S13 Électrophorèse des protéines Flashcards
V ou F : les principes généraux vus lors de la présentation de l’électrophorèse de l’ADN sur gel d’agarose s’appliquent ÉGALEMENT à l’électrophorèse des protéines
VRAI
Que regroupe-t-on sous le terme électrophorèse
Les méthodes permettant de SÉPARER les composantes d’un mélange en fonction de leur VITESSE DE MIGRATION dans un gel en présence d’un CHAMP ÉLECTRIQUE
Lors de l’électrophorèse, décris la migration des molécules CHARGÉES
Les molécules CHARGÉES migrent vers l’électrode de CHARGE OPPOSÉE
V ou F : lors de l’électrophorèse, les molécules chargées migrent vers l’électrode de MÊME CHARGE
FAUX, lors de l’électrophorèse, les molécules CHARGÉES migrent vers l’électrode de charge opposée
V ou F : lors de l’électrophorèse, la migration des molécules dépend UNIQUEMENT de sa charge
FAUX, en plus de sa CHARGE, la migration d’une molécule dépend ÉGALEMENT de sa forme et sa masse moléculaire
Énumère les caractéristiques de la molécule influençant la migration lors de l’électrophorèse
-Charge électrique
-Forme
-Masse moléculaire
V ou F : lors de l’électrophorèse, certaines molécules sont exclues et ne doivent pas passer au travers du réseau de pores présent dans le gel
FAUX, contrairement à la chromatographie d’exclusion, les PLUS GROSSES MOLÉCULES ne sont PAS exclues.
Lors de l’électrophorèse, ce sont les petites molécules ou les grosses molécules qui migrent plus rapidement
Les petites molécules migrent plus rapidement
Explication : les petites molécules se faufilent plus facilement dans le réseau du gel, tandis que les grosses molécules rencontrent plus de résistance
Combien de méthodes avons-nous vu pour l’électrophorèse des protéines ? Nomme-les et décris-les rapidement
3 méthodes :
-PAGE :
Électrophorèse sur gel d’acrylamide en conditions NATIVES
-SDS-PAGE
Électrophorèse sur gel d’acrylamide en conditions DÉNATURANTES
-IEF
Focalisation isoélectrique
V ou F : l’électrophorèse est une méthode principalement utilisée pour la PURIFICATION
FAUX, l’électrophorèse est une méthode principalement ANALYTIQUE, mais on peut parfois l’utiliser pour la purification.
Si l’électrophorèse est utilisée pour la purification (peu souvent) , que devons-nous faire
prélever la portion du gel contenant la protéine d’intérêt
V ou F : le choix du type d’électrophorèse a un peu d’importance, elles sont toutes pas mal équivalentes
FAUX, le choix du type d’électrophorèse dépend de l’information que l’on veut obtenir
Le gel de polyacrylamide est un mélange de 2 choses, lesquelles?
Mélange d’ACRYLAMIDE et de BIS-ACRYLAMIDE
Quelle est l’utilité du BIS-ACRYLAMIDE
bis-acrylamide agit comme un AGENT RÉTICULANT et permet la polymérisation de l’acrylamide en polyacrylamide
V ou F : l’acrylamide est très toxique et devrait toujours être manipulé avec des gants AVANT sa polymérisation
VRAI
Le gel de polyacrylamide est utilisé pour analyser la migration de 2 choses, lesquelles
migration des :
-acides nucléiques de petites tailles
-des protéines
V ou F : gel de polyacrylamide est chargé
FAUX, gel de polyacrylamide est non chargé
V ou F : gel de polyacrylamide est inerte
vrai
Puisque le gel de polyacrylamide est non chargé et inerte, on peut l’utiliser dans des conditions dénaturantes ou non dénaturantes
vrai, on peut utiliser le gel de polyacrylamide autant dans des conditions dénaturantes que non dénaturantes
Que forme l’acrylamide lorsqu’il est SEUL
De longues chaînes linéaires SANS liens entre elles
Si l’acrylamide SEUL forme de longues chaînes linéaires SANS liens entre elles, que faut-il rajouter pour remédier à ça et qu’il y AIT polymérisation
Un agent réticulant tel que le N,N’-méthylène-bis-acrylamide, il y a alors une COPOLYMÉRISATION DES CHAÎNES et un RÉSEAU DE PORES se forme
V ou F : la polymérisation du gel de polyacrylamide peut se faire sans radicaux libres
FAUX, la polymérisation du gel de polyacrylamide NÉCESSITE des radicaux libres
À quoi sert le persulfate d’ammonium (APS)
Persulfate d’ammonium (APS) fournit les radicaux libres
Qui est l’initiateur de la polymérisation du gel de polyacrylamide
Persulfate d’ammonium (APS)
À quoi sert le TEMED (tetramethylethylenediamine)
Catalyseur de la réaction de polymérisation.
Autrement dit, TEMED accélère la réaction
Gamme de séparation des molécules : De quoi dépend la taille des pores
- du % total d’acrylamide et de bis-acrylamide
-de la PROPORTION acrylamide/bis-acrylamide
Plus le % d’ACRYLAMIDE est élevé, plus le gel permet de séparer des molécules de petites ou de grandes tailles
De petites tailles
V ou F : le pourcentage d’acrylamide. est un peu important
FAUX, il est un paramètre important tout dépendant du but de mon expérience
J’ai 2 gels de polyacrylamide utilisant des pourcentages (%) différents d’acrylamide
J’ai un gel de 12% et j’ai un gel de 7,5%.
J’observe qu’un de mes gels permet de séparer des protéines ayant une taille SUPÉRIEURE ou égale à 45 000 Da et mon autre gel permet de séparer des protéines d’une taille entre 14 000 et 100 000 Da.
Fais l’association % du gel avec les tailles des protéines qu’il peut séparer
Gel de 12% : permet de séparer des protéines d’une taille entre 14 000 Da et 100 000 Da
Gel de 7,5% : Permet de séparer des protéines ayant une taille supérieure ou égale à 45 000 Da
Lors d’une électrophorèse en conditions natives (non dénaturantes) (PAGE), la séparation dépend de quoi
-Charge nette
-Structure
-Taille
V ou F : lors de PAGE (conditions natives, non dénaturantes), la séparation dépend uniquement de la taille
FAUX, lors de PAGE (conditions natives, non dénaturantes), la séparation dépend de la charge nette, structure et taille (3 choses)
L’électrophorèse en conditions natives est utilisé quand
Lorsque la STRUCTURE de la protéine DOIT être CONSERVÉE
Nomme 2 exemples de moments où on souhaiterait utiliser PAGE (conditions natives, non dénaturantes)
- Études structurales et fonctionnelles : par exemple, détection d’interactions protéine-protéine (complexe protéique)
- Études enzymatiques : l’activité enzymatique peut souvent être démontrée après électrophorèse, car notre protéine d’intérêt CONSERVERA son activité enzymatique suite au PAGE
Quelle est la limite de PAGE en absence de SDS
PAGE seul ne permet PAS de déterminer la masse moléculaire ou le PI d’une protéine
Puisque PAGE seul ne permet pas de déterminer la masse moléculaire ou PI d’une protéine, quel type d’analyses a été développé
SDS-PAGE et la focalisation isoélectrique
Définis point isoélectrique (PI)
Correspond au pH pour lequel la SOMME des charges + et - d’une protéine s’annule : la charge nette est nulle
V ou F : au point isoélectrique (PI), la charge nette est NULLE
vrai
Lorsque pH est plus petit que pI, la protéine est chargée ______
positivement
Lorsque pH est plus grand que pI, la protéine est chargée ______
négativement
V ou F : à un pH donné, les protéines ont souvent toutes la même charge et la même intensité de charge
FAUX, à un pH donné, les protéines n’ont PAS toutes la même charge ni la même intensité de charge
V ou F : les valeurs de pI sont TRÈS VARIABLES
Vrai
Lors d’une électrophorèse en conditions NON dénaturantes, les protéines sont séparer de manière à préserver leur conformation native. Plus précisement, on préserve quoi exactement (4)
On préserve :
Leur structure TERTIAIRE, leurs interactions entre sous-unités, donc la structure quaternaire et leurs interactions protéine-protéine, ainsi que leur activité biologique
V ou F : PAGE est recommandée pour la détermination du POIDS moléculaire
FAUX, PAGE n’est pas recommandée pour déterminer le poids moléculaire
Explication : la mobilité des protéines est déterminée par une combinaison COMPLEXE de facteurs, car chaque protéine peut migrer vers l’une ou l’autre électrode en fonction de sa charge, et ceci à une vitesse dépendant de sa FPRME et de son COMPORTEMENT de LIAISON
V ou F : lors de PAGE, il est possible d’établir une corrélation entre le poids moléculaire des protéines et la distance parcourue dans le gel
FAUX
PAGE est un type d’électrophorèse réservé à quelles applications (2)
Applications qui nécessitent :
-La PURIFICATION de la protéine ACTIVE
-La détection par un ANTICORPS qui ne reconnaît QUE la forme native de la protéine
Lors de PAGE, les molécules chargées NÉGATIVEMENT migreront vers __________
l’anode (+)
Lors de PAGE, les molécules chargées POSITIVEMENT migreront vers __________
cathode (-)
Nom plus commun de l’électrophorèse sur gel de polyacrylamide en conditions dénaturantes
SDS-PAGE
Que permet le SDS lors de SDS-PAGE
un agent réducteur qui permet de DÉNATURER LA PROTÉINE, c’est-à-dire afin de détruire sa structure TRIDIMENSIONNELLE (sa forme)
V ou F : lors de SDS-PAGE, il y a uniformisation de la forme et de la densité de charge avec un détergent ANIONIQUE (SDS: sodium dodecyl sulfate)
VRAI
V ou F : lors de SDS-PAGE, la séparation dépend de la charge nette, de la structure et de la taille
FAUX, lors de SDS-PAGE, la séparation est selon la MASSE moléculaire uniquement
(C’est lors du PAGE que la séparation dépend de ces 3 choses)
V ou F : SDS-PAGE permet uniquement de déterminer la masse moléculaire apparente des protéines
FAUX, SDS-PAGE permet de déterminer TROIS CHOSES :
-Déterminer la MASSE moléculaire apparente des protéines
-Déterminer le NOMBRE DE SOUS-UNITÉS d’une porétine
-De déterminer LA PURETÉ d’un échantillon
V ou F : grâce à SDS-PAGE, on peut déterminer la PURETÉ d’un échantillon
Vrai, c’est une des 3 choses qu’on peut déterminer grâce au SDS-PAGE
Par quoi est maintenue la structure 3D d’une protéine
Par 2 choses :
-des interactions non covalentes
-des liens covalents de type ponts disulfures
V ou F : la structure 3D d’une protéine est maintenue uniquement par des interactions non covalentes
FAUX, la structure 3D est aussi maintenue par des liens covalents de type ponts disulfures
À quoi réfère la dénaturation d’une protéine (définition COMPLÈTE)
À la perte de la conformation NATIVE à la suite du bris des interactions non covalentes et des ponts disulfures de cette protéine
Quelle structure de la protéine n’est PAS affectée par la dénaturation ? Pourquoi? (sera sûrement à l’exam!!!)
La structure PRIMAIRE n’est PAS affectée par la dénaturation
Explication : Puisque la dénaturation ne touche PAS aux liens peptidiques, la structure primaire n’est PAS affectée
Lors du SDS-PAGE, on commence par faire quelle étape
On commence par chauffer les échantillons (un court moment)
Pourquoi lors du SDS-PAGE, on commence par chauffer les échantillons
-La CHALEUR augmente l’énergie dans le milieu
-Vibration des molécules augmente par le fait même, ce qui provoque le bris des interactions faibles qui maintiennent la conformation native de la protéine
Le pH est un agent dénaturant pour les protéines, que fait-il
Changement de pH peut entraîner une MODIFICATION de la CHARGE des chaînes latérales, ce qui favorise le bris des interactions essentielles au maintien de la structure 3D
SDS-PAGE : dans la plupart des cas, le traitement à la chaleur se fait en présence de ________ et de _________
SDS, b-mercaptoéthanol
SDS-PAGE : que brise le SDS
Le dodécylsulfate de sodium (SDS) est un détergent, il permet le bris des interactions NON covalentes.
SDS-PAGE : Plus précisément, que permet le SDS (2 choses)
SDS - détergent :
-RECOUVRE les molécules de charges NÉGATIVES
-EMPÊCHE la RENATURATION des protéines dénaturées
SDS-PAGE : que brise le b-mercaptoéthanol
brise les liens covalents de type ponts disulfures formés entre les résidus Cys
Pourquoi le tampon utilisé pour préparer le gel contient également du SDS
la présence de ce détergent tout au long de l’expérience permet de s’assurer que les protéines demeureront dénaturées
Énumère les caractéristiques spécifiques du SDS qui en font le détergent de CHOIX pour dénaturer les protéines
-Ce détergent forme un complexe avec les protéines. En s’y fixant, le SDS provoque le DÉPLIEMENT des structures SECONDAIRES et TERTIAIRES en brisant les liens non covalents.
V ou F : les molécules de SDS ENTOURENT la PROTÉINE DÉPLIÉE de façon NON UNIFORME
FAUX, DE FAÇON UNIFORME : cela empêche la renaturation
En quoi c’est si important que les molécules de SDS (le détergent) entourent la protéine dépliée de façon UNIFORME
Cela empêche la renaturation
V ou F : les protéines dénaturées par le SDS sont chargées positivement
FAUX!!!! Attention, les protéines dénaturées par le SDS sont plutôt chargées NÉGATIVEMENT
V ou F : le nombre de molécules de SDS qui se lient à une protéine est PROPORTIONNEL à la TAILLE de celle-ci
Vrai
Explique pourquoi les protéines mises en présence de SDS ont une DENSITÉ DE CHARGE NÉGATIVE UNIQUEMENT
-Premièrement, les molécules de SDS sont chargées négativement
-Deuxièmement, le nombre de molécules de SDS qui se lient à une protéine est proportionnel à la taille de celle-ci
Ainsi, les protéines mises en présence de SDS ont une densité de charge négative
En quoi la méthode SDS-PAGE permet de séparer les protéines selon leur MASSE MOLÉCULAIRE UNIQUEMENT? Explique
-Puisque les protéines mises en présence de SDS ont une densité de charge négative uniforme, les protéines migreront vers l’anode (+), plus ou moins vite, en fonction de leur poids moléculaire
V ou F : le b-mercaptoéthanol brise les ponts disulfures et cette rupture est uniquement intra-peptide
FAUX, la rupture peut autant être intrapeptide (à l’intérieur même du peptide) OU interpeptide (entre différentes sous-unités protéiques)
Si une protéine est formée de 2 sous-unités protéiques, si on utilise le b-mercaptoéthanol, combien de bandes devrait-on voir sur le gel
2 bandes
Si une protéine est constituée d’une seule chaine qui se REPLIE SUR ELLE-MÊME via un pont disulfure, combien de bandes devrait-on voir sur le gel
1 bande.
Explication : En effet, le brisde ce pont permet de linéariser la molécule, MAIS PUISQU’ELLE N’EST FORMÉE QUE D’UNE SEULE CHAÎNE, une seule bande sera visible sur gel
V ou F : le SDS-PAGE peut être fait en système continu ou en système discontinu
VRAI
SDS-PAGE : Par quoi se caractérise un système CONTINU
Utilisation d’UN SEUL GEL de polyacrylamide et d’UN SEUL SYSTÈME de tampon pour effectuer l’électrophorèse
SDS-PAGE Dans un système discontinu, en quoi les deux gels (gel de concentration/empilement et gel de résolution/séparation) diffèrent
Ces 2 gels diffèrent sur 2 points :
1. La CONCENTRATION DE POLYACRYLAMIDE est différente
2. Les GELS sont PRÉPARÉS dans des tampons Tris-HCl de pH différent
SDS-PAGE : Par quoi se caractérise un système DISCONTINU
Superposition de deux gels de polyacrylamide; un gel de concentration/d’empilement et d’un gel de résolution/séparation
SDS-PAGE Combien de tampons différents avons-nous dans un système discontinu
3 tampons différents!
-Chaque gel est préparé dans un tampon de pH différent (on parle ici du gel de concentration/empilement et gel de résolution/séparation), ça fait 2 gels ici
-Un troisième gel, car pour LES SDS-PAGE, le tampon d’électrophorèse (liquide dans legel BAIGNE le gel une fois polymérisé) est différents des tampons utilisés pour la préparation des gels
V ou F : pour le gel d’agarose, on prépare le gel DANS le TAMPON D’ÉLECTROPHORÈSE
Vrai
V ou F : pour les SDS-PAGE, le tampon d’électrophorèse (liquide dans lequel baigne le gel une fois polymérisé) est pareil que les tampons utilisés pour la préparation des gels ? (sera je crois question à l’examen)
FAUX, pour les SDS-PAGE, le tampon d’électrophorèse est différent des tampons utilisés pour la préparation des gels.
C’est pourquoi on a 3 tampons différents pour SDS-PAGE
SDS-PAGE en système discontinu : Qu’est-ce qui arriverait en absence de gel de concentration/empilement
Les protéines n’entreraient PAS en même temps dans le “gel de séparation” et formeraient des bandes larges et diffuses
SDS-PAGE en système discontinu :
Si on observe des bandes LARGES ET DIFFUSES :
a) c’est que le gel de concentration/empilement a fait son travail
b) c’est que le gel de concentration/empilement est absent
b) c’est que le gel de concentration/empilement est absent
V ou F : le gel de concentration/empilement permet aux protéines d’arriver à pleins de moments différents au niveau du gel de séparation
FAUX, gel de concentration/empilement permet au contraire aux protéines d’arriver en même temps au niveau du gel de séparation
C’est dans le gel de concentration/empilement ou dans le gel de résolution/séparation que le % d’acrylamide est plus élevé
Dans le gel de résolution/séparation, le % d’acrylamide est plus élevé
V ou F : le gel de résolution/séparation permet de séparer les protéines selon leur taille en fonction de leur vitesse de migration
VRAI
V ou F : Dans le gel de résolution/séparation, ce sont les plus grosses protéines qui migrent plus rapidement
FAUX, les GROSSES molécules subissent PLUS DE FRICTION, ce qui les ralentit
Que doit-on faire une fois la migration terminée pour visualiser les différentes compsosantes
traiter le gel avec un COLORANT
V ou F : les méthodes de coloration ont des sensibilités semblables
FAUX, ces méthodes de coloration ont des sensibilités différentes, c’est-à-dire que la quantité minimale de protéine qui PEUT ÊTRE DÉTECTÉE VARIE pour CHAQUE MÉTHODE
Quelle est la méthode la plus sensible ? Est-elle fréquemment utilisée ? Pourquoi
-La méthode la plus sensible = radiographie
-Est peu utilisée comme méthode de routine puisqu’elle demande de l’équipement spécialisé
Quels sont les noms des 2 colorants les PLUS FRÉQUEMMENT UTILISÉS
-Bleu de Coomassie
-Nitrate d’argent
Lors du SDS-PAGE, que faut-il déposer dans le premier puit pour déterminer la taille des protéines
Un mélange de protéines de masses moléculaires CONNUES, appelées marqueurs.
En effet, après migration, les distances parcourues par la protéine inconnue et les marqueurs de masse moléculaire sont mesurées
Qu’est-ce qui permet d’estimer la masse moléculaire de la protéine inconnue
Une courbe standard exprimant le LOG de la masse moléculaire en fonction de la distance de migration
V ou F : les modifications POST-TRADUCTIONNELLES ont peu d’influence sur le poids moléculaire apparent sur SDS-PAGE
FAUX, les modifications post-traductionnelle peuvent bel et bien affecter le poids moléculaire apparent sur SDS-PAGE
-En effet, les groupements phosphate et glycosyl ne réagissent PAS de la même façon au traitement au SDS et il est donc POSSIBLE QUE LA DÉNATURATION ne soit PAS COMPLÈTE
La focalisation électrique (ou isofocalisation) permet de déterminer quoi
Le point isoélectrique d’un peptide ou d’une protéine
Que contient le gel de polyacrylamide utilisé pour la focalisation électrique
Un gradient de pH (une extrémité du gel est basique, tandis que l’autre est acide)
Dans le gel de polyacrylamide utilisé pour la focalisation électrique, le pH diminue ou augmente le long du gel en descendant
pH diminue,
autrement dit, le haut du gel est basique et le bas du gel est acide
Explique comment fonctionne la focalisation électrique
-Le gel contient un gradient de pH
-À pH très basique, les protéines portent TOUTES DES CHARGES NETTES négatives; elles migrent donc vers l’électrode positive
-À mesure que les protéines MIGRENT DANS LE GEL, il y a modification de leur charge nette, car le pH du gel change
-Lorsqu’une protéine se situe dans la zone du gel correspondant à son point isoélectrique, elle ne porte PLUS de charge nette
Dans une focalisation isoélectrique, à quel moment la protéine arrête de migrer
Lorsqu’elle se trouve dans la zone du gel CORRESPONDANT À SON POINT ISOÉLECTRIQUE, elle ne porte PLUS DE CHARGE NETTE.
Par conséquent, elle n’est plus entraînée par le champ électrique et il y a arrêt de sa migration
Avec quelle technique peut-on déterminer le pI et la masse moléculaire d’une protéine au cours de la même expérience
Grâce à l’électrophorèse 2D
Explique brièvement les 2 étapes de l’électrophorèse 2D
-Première migration dans un gel contenant un gradient de pH, ce qui permet de séparer les protéines selon leur pI
-Ce gel est ensuite placé HORIZONTALEMENT sur le DESSUS d’un gel de type SDS-PAGE. AU cours de cette seconde migration, les protéines sont séparées selon leur masse moléculaire
V ou F : la première migration lors de l’électrophorèse 2D se déroule en conditions non dénaturantes
VRAI.
(C’est la deuxième migration, lorsque le gel est ensuite placé horizontalement sur le dessus d’un gel de type SDS-PAGE, qui se déroule en condition DÉNATURANTES)
Définis “protéome”
ensemble des protéines d’un organisme
Définis “protéomique”
étude d’un protéome
Sur un gel en 2 dimensions montrant les différentes protéines d’Escherichia coli, chacun des points sur le gel correspond à quoi
Chacun des points correspond à une protéine différente
Que peut-on faire grâce aux points retrouvés sur un gel en 2 dimensions
Ces points peuvent être PRÉLEVÉS INDIVIDUELLEMENT, ce qui permet ensuite l’IDENTIFICATION des protéines qu’ils contiennent par SPECTROMÉTRIE de MASSE
