Replikation allgemein Flashcards
Dna replikation
Vervielfältigung der Dna
Ist semikonservativ: 1 strang bleibt erhalten, ein neuer wird synthetisiert
2 substrate müssen vorliegen: 4 dNTPs und primer template junction
Template stellt ssDNA zur verfügung, primer ist komplementär zum template
Primer: stellen freies 3’OH ende bereit, dass direkt in ssdna übergeht
Primase: spezialisierte RNA pol, die die kurzen primer synthetisiert
Dna pol benutzt dNTPs als substrat für die neusynthese
Synthese erfolgt in 5‘-3‘ richtung
An 3‘ hydroxylgruppe wird nächstes nt angehängt’
Beim anfügen eines nt wird von diesen ppi (pyrophosphat)abgespalten
Leitstrang synthese erfolgt durch
Folgestrang synthese erfolgt diskontinuirlich durch verbindung von okazaki fragment
Jedes okazaki hat eigenen primer
Primase
Spezialisierte rna pol
Synthetisiert kurze rna primer
8-14 nt lsnge rnas oder kurze rnas, die mit kurzer dna verlämgert sind
Stelle freies 3‘oh ende zur verfügung, das direkt in ss dna übergeht
Bevorzugt bestimmte trimere sequenzen auf ssdna um primer zu synthetisieren
Replikationsproteine von ecoli
Helicase DnaB: entwindet doppelhelix
Primase. Synthetisiert rna primer
SSB Stabilisiert ss regionen
DNA gyrase. Leitet negative supercoils ein
Dna pol3. Synthetisert dna
Dna pol 1. erases primer und füllt gaps
Dna ligase. Lagert sich an enden der dna an
Helicase bei ecoli
DnaB : hexamere struktur, loch kn der mitte, durch das dna durchgezogen wird. Ds wird aufgebrochen, indem h brücken gelöst werden, in 5‘3‘ richtung
Entwindet dna
Atp abhängig
SSB
Ss dna führt eig zu sos-response
Deshalb schützen ssb die ssdna
Bei e coli= tetramer, 2 ue binden an dna
Bei eukaryonten= dimer, Umschließt sequenzunspezifiwchdie ssdna
Das binden an teritär oder sekundätfsltung verhindert und sos response unterdrückt
Binden kooperativ sn dna
Dna polymerase
Synthetisieren neuen dna strang bei replikation
Altives zentrum katalysiert addition der dntps
3‘oh vom primer bindet mit alpha phosphat mit eintreffenden dNTP
Struktur:
Wie halbgeschlossene rechte hand mit handfläche, finger u daumen
Handfläche: mg ionen -> für ausbildung der phosphodiesterbindung
Finger: umschließt eintreffende dntps, bringt diese nahe an mg ionen u führt zu turn damit nur 1: template base präsentiert wird
Daumen: interagiert mit neusynthetisierten strang
Polymerase 3
Bringt eigentliche syntheseleistung bei replikation
Schnell u hat hohe prozessivität
Teil des dna pl 3 holoenzyms
Aufbau:
Alpha ue hat pol aktivität und Benötigt epsilon und theta ue
2 alpha, 2 theta u 2 epsilon ue bilden core enzym
Epsilon: exonucleasesktivität
Theta: dient stabilisierung der ue an dna
2 T ue verbinden die alpha miteinander u sorgen für zusammenhalt des holoenzyms und der helicase
Sliding clamp: von je zwei beta ue ausgebildet, binden an 2 alpha, sorgt für hohe prozessivität
Y komplex: sorgt für anlagerund der pol an dna-> clamp loader
Clamp loader bindet an atp u sliding clamp, verbiegt beta ue gegeneinander, dass sie geöffnet sind, dna kann durchgefädelt werden j komplex binden
Clmap loader kann sliding clamp nur an primer template junction binden
Pol 3 bei bakterien hat 2 ue:
Eine ue für leitrang; eine für folgestrang zuständig
Leading strand wird in 5‘3‘ richtung synthetisiert
Dna pol 1 von e coli
Niedriege fehlerrate u prozessivität
Bei trypsin zugabe fällt sie in 2 domänen
Größere: klenow fragment: hat pol aktivität und 3‘5‘exonuclease aktivität
-> proof reading
Kleinere: 5‘3‘ exonucleasesktivität , die primer der okazaki frwgmente sbbauen kann
Proof reading
3’5’ exonuklease aktivität einer pol
Bei mismatches wird neusynthetisierte dna vom 3‘ ende degradiert
Erfolgt ohne lösung der pol von dna
Primer template junction wird destabilisiert u kurzes ungepaartes dna stück bildet sich
Polymerasen in der praxis
T4 dna pol: Besonders bei blunt ends da 3‘5‘ exonukleaseaktivität höher ist
T7 dna pol: hohe prozessivität, deshalb für dna sequenzierung eingesetzt
Thermostabile:
taq: hohe fehlerrate( kein proof readin), günstig, pcr da hohe thermostabilität
Phusion und Q5: sind synthetische pols, teuer, für klonierung einfesetzt wegen ihrer zusätzliche ds dna bindedomäne, hat proof reading, hohe prozessivität und genauigkeit
PFu: geringste fehlerrate
Dna ligase
Verknüpt okazaki fragmente
Aktiviert 5‘phospaht gruppe vom letzten okazaki indem sie amp rest auf ein lysin der ligase überträgt
Amp wird auf 5‘phosphat übertragen -> ppi bindung
Phosphodiesterbindung wird durch nucleophilen angriff der 3’oh auf das aktivierte 5‘ geschlossen u amp geht ab
Synthese des folgestrangs
- primase synthetisiert rna primer
- dna pol 3 synthetisiert lagging strand in 5‘-3‘ richtung
- dna pol 3 synthetisiert nächstes fragment
- dna pol 1 entfernt rnt von primer, eechselt es gegen dntps in 5‘-3‘richtung
- dna ligase schließt gap im zucker phophat rückgrad
Replikon
Bereich der von 1 ori aus repliziert wird
Bei bakterien einer da mur 1 ori
Ori
Origin of replication
Stelle auf dna wo entwindung der dna u initiation stattfindet
E coli: OriC
Für funktion von OriC wichtig sind 2 motive:
9 mer motif: bindestelle für initiator dnaA, 5x wiederholt
13 mer motif: 3x wiederholt, initiationsseite für bildung der ss dna während entwindung
Replikator
Cis acting dna sequenz, die ausreicht, um initiation der replikation zu dirigieren
Ori ist teil davon
Enthält bindesequenz für initiator protrine u at reiche region, die dna sufwindet
Initiator protein:
Erkennt spezifisch dna element am replikon u leitet initiation ein
Werden durch atp bindung u hydrolyse reguliert
Erkennen ori
Reguliert aufschemlzen der dna
DnaA
Initiator protein in e coli
Aufgaben:
Bindung der replikator dna u rekrutierung von faktoren, die für initiation notwendig sind
Hat 2 bindedomänen:
1 bindet an 9 mer im oriC in ihrer ds form
2 interagiert mit 13 mer, wenn sie atp gebunden hat-> führt zur aufschmelzung innerhalb 13 mer region
Diese ss dna dient als template für andere replikations proteine
Ist helix turn helix dna bp
Dna ist um filamwntöse schraubenartige struktur gewunden-> dna wird positiv supercoiled aber vorderer bereich bleibt negativ
Initiation prokaryonten
Durch bindung von dnaa kommt es zu primären aufschmelzen der dna in at reichen regionen zu dna unbinding elements
DnaB und dnaC( ladefsktor für helicase) werden in aufgeschmolzenen bereich geladen
Während dnac gebunden ist, ist dnab noch inaktiv
Helicase aktiviert primase, die primer synthetisiert
Dnac lässt von dna sb u dnab wird aktiviert
Der y komplex lagert sliding clamp an primer, alpha ue des dna 3 holoenzyms können binden
Da e coli chromosom zirkulär vorliegt, wrden 2 replikationsgabeln gebildet, in entgegengesetzter richtung
Regulation der initiation prokaryonten
Um vorzeitige re initiation zu verhindern
1. HEMIMETHYLIERUNG DER DNA AM OriC
Hemimethylierte dna wird von seqA an GATc site gebunden u kann von dnaA nicht erkannt werden-> verhindert also bindung Avon dnaA am origin
SeqA binder im origin bereich u bevorzugt hemimethylierte dna
Bindet kooperativ u bildet filamenteäseqA bindet such hinter repl.gsbel, da hier hemimethylierter bereich ist, verhindert so, dass DAM(deoxy adeosin methylase) den neuen strang methylieren kann und dass dnaA eine neue replikationsrunde einleiten kann
- TITRATION VON DnaA
Protein wird vom oriC im darA locus abgefsngen
Hier gibt es 8x mehr 9mer bindetsllen für dnaA als im OriC
DnaA bindet dann meistens im datA locus - ATP-HYDROLYSE VON DnaA
DnaA kann nur bei atp beladung gut binden
Hda wir durch beta ue der dns pol rekrutiert, ist homolog zu dnaa
Triggert atp hydrolyse in einer ue
Stellt trigger finder für 1.ue zur verfügung
Wenn alle ue atp zu ado hydrolysiert haben fällt dnaa ab - DARS1 und DARS2: AUSTAUSCH VON ADP DnaA zu ATP DnaA
Dars= dnaa reactivating site; bindestellen für dnaA, für regenerstion von atp dnaA zuständig
Dd
Alle methoden wirken zusammen um zu verhinder, dass gerade replizierte dna erneut repliziert wird
Verhindert aner nicht dass dna vor zellteilung erneut repliziert eird
Wie werden nucleosomen nach der replikation assembliert.
Es sird für aufrechterhaltung ded chromatin status gesorgt
Schon vorhandene histonr werden auf die 2 neuen dna pdoppelhelices verteilt
Für die anderen müssen neu synthetisierte histone sngebracht werden
CAF1 = chromatin assembly factor, neg grladenes histon chsperon
Caf1 bringt H3H4 tetramere nach replikation an dna indem es mir pcna wechselwirkt, dann binden h2a und h2b dimere
Caf1 interagiert auch mit hp1-> spielt entscheidende rolle für aufrechterhaltung des heterochromatin status
End replication problem
Bei Synthese des lagging strands gibt es letzten teil des templates der nicht einfach synhtetisiert werden kann
Durch Verkürzung würde totüchterstrsng kürzer werden
Telomere
Schützen die enden von eukaryontischen chromosomen, die meist aus AG reichen repeats sind
Repeats sind meist ds, 3‘ende ist länger als 5‘ u endet ss
Dieses 3‘ ende wirkt als ORI und kompensiet end replikation problem
Telomerasen
Ribonucleoprotein
Für aufrechterhaltung der telomere in sich teilende zellen
Verlängert dna an ihren 3‘ ende, braucht keinen primer, ds sie selbst rna template besitzt -> telomerase rna TER
Ter erzeugt im enzym durch andocken an ss3‘ende eine primer:template junction
Besitzt auch reverse transkriptase TERT-> synthetisiert durch reverse transkriptase eine dna kopie der zu den telomeren komplementäre rna sequenz u verbindet diese mit dem 3‘ende des chromsoms
5‘ ende wird durch lagging strand synthese verlängert, das das von der telomerase synthetisierte lange 3‘ende als zusätzliches template für replikationmadchine verwendet werden kann
3‘ überhang wird durch t loop bildung und proteine geschützt
T loop bildung: 3‘ende der telomere dringt in ds dna region ein ->ende wird maskiert
Aktivität durch protrine moduliert:
TRF1:
TRF2:
Wirken als repressoren
CDKs
Wichtig für regulstion der helicase aktivität während zellzyklus
Cdk spiegel ist niedrig währeng G1: helicase kann an dna geladen werden aber nicht sktiviert
Eintritt in s phase: großer anstiegan cdk aktivität u führt zur aktivierung der helicase
Helicase wird von dna losgelassen wenn replikationsgabl mit synthesearbeit fertig ist bzw die dna fertig repliziert ist
Die nun freien replikatoren werden sofort von orc besetzt u könntnen von helicasen gebunden werden-> wird verhindert durch hohe cdk sktivität in restlichen phasen, indem sie cdc6, ctd1 und orc inhibieren
Cdk inhibitoren
P27: inhibiert cyclinD/ CDK4 komplex und cyclinE/CDK2 komplex
Kontrolliert somit g1 phase
Hauptfinktion: verlangsamen und stoppen des zz
P21: inhibiert cyclinE/ CDK2 komplex und cyclinA/CDK 2 komplex
Kontrolliert g1 und s phase
P16: inhibiert cyclin D/CDK 4 komplex und cyclinD/CDK6 komplex
Reguliert g1 phase
Chechpoints im zz
Übergang g1 in s: g1 checkpoint: passt das milieu
Übergang g2 in m: g2 cp: gesamt dna repliziert?
Metaohase co: alle chromosomen an soindelapparat?
Durch aktivierung von cdknreguliert
Cdk aktivierung
Aktivität word von proteinkinasen und proteinphosphatasdn gesteuert
Je nachdem welcher redt phosphoryliert wird, ist komplex aktiv oder insktiv
Zb :
Cyclin/cdk2 wird durch phosphorylierung an thr160 stimuliert
Eine phosph. Am thr14 u d 15 löst inaktivierung aus
CAKs = cdk activstin kinase
Caks phosphorylieren den thr160 rest
CKIs= cdk inhibitoren
Ckis führen zu phosph. Am thr14 und 15 und somit zu insktivierung
Cdc 25 führt zu reaktivierung
Aktivierung von CDK2/cyclinE
Ist knotenpunkt
Stimuliert die dna synthese indem sie beladen der cdc45 abh dns pol alpha u die histonbiosynthese durch direkte phosphorylierung von NPAT erleichtert
