Repaso S1 Flashcards
Indique tres diferencias entre el DNA y el RNA respecto a: Función,
estructura, bases que lo conforman.
Función: DNA: almacenar la información genética; RNA:
intermediario para síntesis de proteína
Estructura: DNA: doble hebra helicoida, desoxiribosa; RNA: simple
hebra, ribosa.
Bases que lo conforman: DNA: A,C,G,T; RNA: A,C,G,U.
En la siguiente tabla se comparan los valores obtenidos de diferentes
parámetros en dos genomas, uno de un hongo marino y otro de un hongo terrestre.
a) ¿Cuál DNA posee mayor contenido de GC?
DNA hongo marino: Tm 89°C, NO sensible a fosfatasa, Valor medio de Cot 10exp-3M, Razón 260/280 1,5, Diámetro del DNA 3,5 nm.
DNA terrestre: Tm 70°C, SÍ sensible a fosfatasa, Valor medio de Cot 10exp4M, Razón 260/280 1,9, Diámetro del DNA 2 nm.
Nota: la fosfatasa es una enzima que SOLO hidroliza grupos fosfatos libres.
A) El DNA del hongo marino, pues posee Tm de 89°C, y la Tm es
directamente proporcional al contenido GC.
En la siguiente tabla se comparan los valores obtenidos de diferentes
parámetros en dos genomas, uno de un hongo marino y otro de un hongo terrestre.
b) ¿Cuál DNA es circular? Explique su respuesta
DNA hongo marino: Tm 89°C, NO sensible a fosfatasa, Valor medio de Cot 10exp-3M, Razón 260/280 1,5, Diámetro del DNA 3,5 nm.
DNA terrestre: Tm 70°C, SÍ sensible a fosfatasa, Valor medio de Cot 10exp4M, Razón 260/280 1,9, Diámetro del DNA 2 nm.
Nota: la fosfatasa es una enzima que SOLO hidroliza grupos fosfatos libres.
B) Es el DNA del hongo
marino, pues en un DNA lineal el único grupo fosfato libre corresponde al fosfato al 5’. Luego al estar circular la fosfatasa no lo podrá hidrolizar.
En la siguiente tabla se comparan los valores obtenidos de diferentes
parámetros en dos genomas, uno de un hongo marino y otro de un hongo terrestre.
c) ¿Cuál DNA es más complejo?
Explique
DNA hongo marino: Tm 89°C, NO sensible a fosfatasa, Valor medio de Cot 10exp-3M, Razón 260/280 1,5, Diámetro del DNA 3,5 nm.
DNA terrestre: Tm 70°C, SÍ sensible a fosfatasa, Valor medio de Cot 10exp4M, Razón 260/280 1,9, Diámetro del DNA 2 nm.
Nota: la fosfatasa es una enzima que SOLO hidroliza grupos fosfatos libres.
C) De los valores de Cot medio, se desprende que el DNA más complejo es el DNA del hongo terrestre, pues posee un valor de1x104 M, esto es 8 órdenes
de magnitud más elevado que el del genoma del hongo marino, lo cual da cuenta de una alta complejidad.
En la siguiente tabla se comparan los valores obtenidos de diferentes
parámetros en dos genomas, uno de un hongo marino y otro de un hongo terrestre.
d) ¿Qué información le entrega la razón 260/280 para cada DNA?
DNA hongo marino: Tm 89°C, NO sensible a fosfatasa, Valor medio de Cot 10exp-3M, Razón 260/280 1,5, Diámetro del DNA 3,5 nm.
DNA terrestre: Tm 70°C, SÍ sensible a fosfatasa, Valor medio de Cot 10exp4M, Razón 260/280 1,9, Diámetro del DNA 2 nm.
Nota: la fosfatasa es una enzima que SOLO hidroliza grupos fosfatos libres.
D) La razón 260/280 indica pureza con respecto a proteínas. La baja razón del DNA del hongo marino, indica que está contaminado con proteínas, no así el DNA del hongo terrestre, que está en su ideal casi 2.0. Lo que indica alta pureza.
En la siguiente tabla se comparan los valores obtenidos de diferentes
parámetros en dos genomas, uno de un hongo marino y otro de un hongo terrestre.
e) ¿qué implicancia biológica, considera usted que tiene el hecho
de que el diámetro del DNA del hongo marino sea 1,75 veces mayor que el DNA del hongo terrestre?
DNA hongo marino: Tm 89°C, NO sensible a fosfatasa, Valor medio de Cot 10exp-3M, Razón 260/280 1,5, Diámetro del DNA 3,5 nm.
DNA terrestre: Tm 70°C, SÍ sensible a fosfatasa, Valor medio de Cot 10exp4M, Razón 260/280 1,9, Diámetro del DNA 2 nm.
Nota: la fosfatasa es una enzima que SOLO hidroliza grupos fosfatos libres.
E) Que el diámetro sea de
1,75 veces mayor que el diámetro promedio de todos los DNAs, significa que estamos en presencia de un nuevo tipo de DNA. Que presenta desafíos desde lo estructural a lo funcional.
En eucariotas, los cromosomas son lineales y para que sean estables y
funcionales, deben tener tres estructuras. Indique ¿cuáles son esas tres estructuras?
Origen de replicación, centrómero y telomeros.
¿Qué ventaja le otorga a los procariotas con respecto a los eucariotas, en términos de estabilidad genética, el hecho de que su genoma es circular?
El hecho de ser circulares, significa que no existe riesgo de pérdida de
material genético en cada vuelta de replicación, pues siempre los partidores de la hebra retrasada, tendrán molde para ser rellenados por nuevo DNA.
¿Cuál es la diferencia, en composición, entre el nucleosoma y el cromatosoma?
Nucleosoma: Octamero de histonas (2H3, 2H4, 2H2B, 2H2A) + 200pb
(146 pb) rodeando por fuera. Cromatosoma: Nucleosoma que tiene unido por fuera la histona H1 o histona linker.
Menciones tres diferencias entre los genomas procariotas y eucariotas (use la tabla)
Genoma procariota
* Único origen de replicación
* Baja complejidad
* Posee plásmidos
* No tiene histonas
* Un único cromosoma circular
* Se encuentra en el citoplasma
* Haploide
* Tamaño pequeño
Genoma eucariota
* Múltiples orígenes
* Alta complejidad
* No posee plásmidos
* Unido a histonas
* Múltiples cromosomas lineales
* Se ubica dentro del núcleo
* Diploide
* Muy grandes
Los procesos de síntesis de DNA en procariotas y eucariotas son, en
general, parecidos pues requieren de los mismos pasos para lograr copiar los cromosomas. Presentan las mismas actividades enzimáticas para tal efecto, pero que sin embargo tienen distinto nombre. Al respecto, complete la siguiente tabla colocando los nombres de la(s) proteína(s), para procariotas y eucariotas, involucrada en cada actividad/función indicada.
Actividad/función
Bacteria
* DNA pol replicativa: DNA polimerasa III
* Helicasa replicativa: DNAB
* Cargar abrazadera deslizante: Complejo gamma
* Síntesis hebra retrasada: DNA pol III
* Abrazadera deslizante: beta clamp o DnaN
* Estabilizar hebra simple: SSB
* Reconocimiento origen de replicación: DnaA
Eucariota
* DNA pol replicativa: DNA polimerasa delta y epsilon
* Helicasa replicativa: Complejo CMG (Cdc45/Mcm2-7/GINS
* Cargar abrazadera deslizante: RF-C
* Síntesis hebra retrasada: DNA pol delta
* Abrazadera deslizante: PCNA
* Estabilizar hebra simple: RPA
* Reconocimiento origen de replicación: ORC
En el caso de la síntesis en eucariotas, que paso(s) en particular se vería afectado en caso de que existiese una deficiencia severa en la función de la proteína Mcm10? Explique su respuesta
Mcm10 es responsable de dos funciones, una de activar la helicasa
para la replicación del DNA y dos de atraer a las proteínas RPA,
responsables de estabilizar el DNA como simple hebra. Luego, si esta
proteína estuviese defectuosa, no se podría realizar ninguna de esta
funciones y, en consecuencia, no se podría sintetizar el DNA.
Usted se encuentra estudiando distintas mutantes de E. coli con diferentes problemas en
el proceso de replicación del ADN.
Para cada mutante/fenotipo (efecto generado por la mutación) mencione que gen podría
estar mutado/inactivado. Fundamente su respuesta.
A) Una mutante posee una DNA polimerasa III que tiende a liberarse de la hebra
templado durante el proceso de replicación
Problema con la procesividad. Mutante en el gen que codifica el sliding clamp (abrazadera). La función de la abrazadera es mantener a la DNA polimerasa III
en el ADN para que no se suelte.
Usted se encuentra estudiando distintas mutantes de E. coli con diferentes problemas en
el proceso de replicación del ADN.
Para cada mutante/fenotipo (efecto generado por la mutación) mencione que gen podría
estar mutado/inactivado. Fundamente su respuesta.
B) Cuando la hebra rezagada es expuesta por la helicasa, esta hebra continuamente se rompe durante el proceso de replicación.
Problema con la estabilidad de la hebra simple de ADN. Mutante en el gen que codifica la proteína SSB. La función de SSB es proteger el ADN de hebra simple para evitar ruptura o formación de estructuras secundarias.
Usted se encuentra estudiando distintas mutantes de E. coli con diferentes problemas en
el proceso de replicación del ADN.
Para cada mutante/fenotipo (efecto generado por la mutación) mencione que gen podría
estar mutado/inactivado. Fundamente su respuesta.
C) De forma descontrolada, reinicia continuamente la replicación del ADN desde la región oriC.
Para que reinicie descontroladamente la replicación debe estar mutado el gen
que codifica para la proteína SeqA. Esto debido a que SeqA se une al ADN hemi-metilado para evitar que Dam lo metile. Si no está SeqA entonces Dam puede metilar sin problemas y se reiniciaría continuamente la replicación del
ADN desde el oriC
Usted se encuentra estudiando distintas mutantes de E. coli con diferentes problemas en
el proceso de replicación del ADN.
Para cada mutante/fenotipo (efecto generado por la mutación) mencione que gen podría
estar mutado/inactivado. Fundamente su respuesta.
D) Es prácticamente incapaz de generar la burbuja de replicación en el oriC y no encuentra problemas con la proteína DnaA.
Si la burbuja de replicación no se está formando en el oriC puede ser que esté mutada la helicasa (DnaB) o la proteína que se encarga de cargarla en el ADN (DnaC), o SSB (fundamentando en cada caso) O que estén mutadas las secuencias de unión a DnaA al oriC, o la región rica en AT (región de repetidos de 13pb)
El cambio de un sólo nucleótido en el gen APOE puede ser indicativo de riesgo a desarrollar la enfermedad de Alzheimer. Usted ha recolectado muestras de sangre de 4 individuos que quieren saber si poseen dicha mutación. Usando secuenciación por Sanger usted determina la secuencia de parte del gen APOE.
A) ¿Cuál es el fundamento de la técnica de secuenciación por Sanger?
El método de secuenciación ideado por Sanger se basa en el empleo de
dideoxinucleótidos que carecen del grupo hidroxilo del carbono 3’, de manera que cuando uno de estos nucleótidos se incorpora a una cadena de ADN en crecimiento,
esta cadena no puede continuar elongándose. Esto sucede porque la ADN polimerasa necesita un grupo terminal 3’ OH para añadir el siguiente nucleótido y el
dideoxinucleótido incorporado carece de este grupo hidroxilo.
De esta forma se preparan 4 reacciones de amplificación donde en cada una además se agrega una pequeña cantidad de cada dideoxinucleótido. De esta forma en el tubo donde se agrega un dideoxinucleotido de Adenina se generarán fragmentos de distinto tamaño correspondientes a la terminación de la cadena en cada posición correspondiente a una
adenina. La comparación del patrón de los fragmentos generados por los 4 dideoxinucleotidos en un gel de agarosa o poliacrilamida permite leer la secuencia de ADN desde abajo hacia arriba (5´ a 3´
El cambio de un sólo nucleótido en el gen APOE puede ser indicativo de riesgo a desarrollar la enfermedad de Alzheimer. Usted ha recolectado muestras de sangre de 4 individuos que quieren saber si poseen dicha mutación. Usando secuenciación por Sanger usted determina la secuencia de parte del gen APOE.
B) Escriba la secuencia 5´ a 3 ´ del control sano y el de cada paciente. ¿Cuál(es) pacientes tienen la mutación?
Los pacientes 2 y 3 tienen la mutación (T a G en la posición 4).
Control. 5´ ATATTGTCGTAG 3
Paciente 1 5´ ATATTGTCGTAG 3
Paciente 2 5´ ATAGTGTCGTAG 3
Paciente 3 5´ ATA**G**TGTCGTAG 3
Paciente 4 5´ ATATTGTCGTAG 3`
Su grupo de investigación se encuentra interesado en entender los procesos de replicación bacterianos en bacterias que viven en lugares extremos. Es así que un(a) estudiante suyo(a) ha aislado 3 bacterias extremófilas del salar de Atacama.
Un experimento de qPCR (basado en Sybr green) para analizar la expresión (mRNA) del gen dam que codifica para la enzima Dam metilasa se muestra a continuación:
A. ¿Cuál es la función de la enzima Dam metilasa durante la replicación bacteriana?
Gráfico Ciclos (x) vs Fluorescencia (y).
1. Análisis de la expresión (mRNA del gen SepA) Bact1 primero, Bact2 segunda, Bact3 tercera.
2. Cuantificación de copias de ADN de oriC. Bact3 primera, Bact2 segunda, Bact 1 tercera.
La enzima Dam es la encargada de metilar el oriC. Cuando ocurre 1 evento de replicación el ADN se encuentra hemi-metilado (debido a que la hebra nueva fue
recientemente sintetizada por la DNA Pol III). Por lo que Dam es importante para metilar la hebra nueva, dejando el oriC complementamente metilado y activo para un nuevo evento de replicación.
Su grupo de investigación se encuentra interesado en entender los procesos de replicación bacterianos en bacterias que viven en lugares extremos. Es así que un(a) estudiante suyo(a) ha aislado 3 bacterias extremófilas del salar de Atacama.
Un experimento de qPCR (basado en Sybr green) para analizar la expresión (mRNA) del gen dam que codifica para la enzima Dam metilasa se muestra a continuación:
B. ¿Qué implicancias tendría para el proceso de replicación del ADN las diferencias observadas en la expresión de dam para cada una de las bacterias?
Gráfico Ciclos (x) vs Fluorescencia (y).
1. Análisis de la expresión (mRNA del gen SepA) Bact1 primero, Bact2 segunda, Bact3 tercera.
2. Cuantificación de copias de ADN de oriC. Bact3 primera, Bact2 segunda, Bact 1 tercera.
Las curvas de qPCR sugieren que: la bacteria 1 tiene una mayor expresión que las bacterias 2 y 3. Y que la bacteria 3 tiene la menor expresión.
Esto sugiere que la bacteria 1 podrá metilar mucho más rápido los nuevos orígenes de replicación y que podrá reiniciar los eventos de replicación mucho más rápido que las otras 2 bacterias.
Su grupo de investigación se encuentra interesado en entender los procesos de
replicación bacterianos en bacterias que viven en lugares extremos. Es así que un(a)
estudiante suyo(a) ha aislado 3 bacterias extremófilas del salar de Atacama.
Un experimento de qPCR (basado en Sybr green) para analizar la expresión (mRNA) del gen dam que codifica para la enzima Dam metilasa se muestra a continuación:
C. Dibuje los perfiles de amplificación por qPCR si analizamos el número de copias
del oriC para cada una de las 3 bacterias
Gráfico Ciclos (x) vs Fluorescencia (y).
1. Análisis de la expresión (mRNA del gen SepA) Bact1 primero, Bact2 segunda, Bact3 tercera.
2. Cuantificación de copias de ADN de oriC. Bact3 primera, Bact2 segunda, Bact 1 tercera.
Como los niveles de expresión de dam se correlacionan a la actividad de replicación, el perfil de amplificación es el mismo. La bacteria 1 tiene más copias del oriC porque tiene mayor expresión de Dam y la bacteria 3 tiene la menor expresión de dam y el menor número de copias del oriC.
- Usted ha generado distintas mutantes bacterianas que poseen distintos problemas en el proceso de traducción del RNA mensajero a proteínas. A continuación se mencionan los fenotipos de 4 de estas mutantes. Para cada caso mencione que componente del proceso de traducción en procariontes podría estar mutando (ausente). Explique su respuesta.
- Mutante 1. Al analizar los ribosomas se da cuenta de que se encuentran detenidos en los codones de término de sus respectivos mRNA. El sitio P se encuentra ocupado por el último tRNA de un codon codificante y el sitio A con el codon de termino se encuentra vacio (4 ptos)
– Mutante 2. Usted examina los ribosomas de esta bacteria y se da cuenta de que todo el RNA mensajero está en el citoplasma pero NO unido a la subunidad 30s del ribosoma. (3 ptos) - Mutante 3. Al analizar todas las proteínas EF-Tu se da cuenta que solo están unidas a GDP.
Mutante 1: La mutante no posee los factores de terminación RF1/RF2 o el factor RRF.
Mutante 2: Si el mRNA no puede unirse a la subunidad 30S del ribosoma puede ser por falta de reconocimiento de la secuencia shine-dalgarno por una mutación del 16s ribosomal o por falta de IF-1 e IF-3
Mutante 3: Falta del factor EF-TS que permite generar EF-TU-GTP.
De acuerdo a la secuencia de ADN de la hebra codificante de la imagen, escriba la secuencia de: A) El ARN mensajero transcrito desde esta secuencia; B) los anticodones del tRNA correspondiente y C) la secuencia completa de aminoacidos del polipetido traducido. Use la tabla del uso de codones como apoyo.
A) RNA mensajero: reconocer cola poli-U como termino. ACUAAUUAGGGAGGUAAGUUCUAUCUAUGUACAUUGGCACAUAAUACUGAUGCCUCCGGUAG GAGGCUUUUUUUU
B) Anti-Codones: Reconocer codon de inicio de la traducción (ATG) y termino (UAA) UAC AUG UAA CCG UGU
C) Secuencia de aminoacios: Leer el codon no el anticodon, reconocer codon de termino.
Met-Tyr-Iso-Gly-Thr
