Realtids - PCR Flashcards
I vilka situationer är det fördelaktigt att kunna kvantifiera patogener?
Följa behandling och se resistensutveckling vid exempelvis HIV.
Antal patogener kan vara kopplat till hur starka symtomen blir - ex. herpes.
Antal patogener kan tala för hur smittsam man är - ex. adenovirus.
Används för att ex. bestämma antal viruspartiklar i dricksvatten vid reningsverk.
Vad är realtids - PCR?
En molekylärbiologisk metod som amplifierar, detekterar och mäter målsekvenser i prov.
Vilka är de fundamentala skillnaderna mellan qPCR och konventionell PCR?
Mängden amplifierat material detekteras och kvantifieras vid varje cykel med fluorescerande prober vid qPCR medan vanlig PCR detekterar vid end-point med ex. gelektrofores.
Vid qPCR sker kvantifieringen i exponentialfasen medan vanlig PCR kvantifierar vid platåfasen.
Vad är CT-värdet? Hur kan det används för kvantifiering?
CT-värdet är den cykel vid vilken fluorescensen går över ett förbestämt tröskelvärde och kan urskiljas från bakgrundsfluorescensen. CT-värdet är omvänt proportionellt med mängden startmaterial i provet. Lägre CT värde indikerar mer startmaterial.
CT - värdet för målsekvensen kan sedan jämföras med standarder av känd koncentration.
Beskriv kortfattat hur realtids-PCR fungerar?
Realtids-PCR röret innehåller alla vanliga PCR komponenter + fluorescerande proper för detektorn och kvantifiering.
Under PCR - reaktionen binder proberna till den amplifierade produkten och kommer då fluorescera. Därav blir fluorescensen proportionell till mängden amplifierat material. Då fluorescensen monteras är det möjligt att bestämma vid vilken cykel fluorescensen går över ett specifikt tröskelvärde. Detta används sedan för kvantifiering.
Vilka är fördelarna med qPCR?
Fördelar:
Slutet system - mindre kontaminationsrisk
kvantifiering av DNA/RNA.
Tidseffektivt
Nackdelar:
Högteknologisk - kräver utbildad personal
Känslig för mutationer och kontaminationer generellt.
Kan inte skilja mellan levande och död agens.
Tid efter infektion avgörande för resultat.
Vilka är de vanligast proberna man använder vid qPCR?
SYBR Green och Taqman
Hur fungerar SYBR Green? Vilka är fördelarna och nackdelarna?
SYBR Green är en fluorescerande prob som binder till dubbelsträngat genetiskt material och remitterar ljus vid 522nm.
Fördelarna är att då det binder till dubbelsträngat material kan proben användas vid analys av många olika genom.
Den är även relativt billig och enkel att använda och designa.
Nackdelarna är att då proben binder till dubbelsträngat material binder det även in till kontaminationer och felkällor som primer dimers. Därav måste man efteråt göra en smältkurvsanalys för att detektera eventuella felkällor.
Hur fungerar Taqman? Vilka är fördelarna och nackdelarna?
Talman använder sig av två prober - en reporter och en quencher. Då dessa två finns i närheten av varandra äter quenchern upp fluorescensen från reportern.
Proben binder till målsekvensen någonstans mellan forward och reverse primer. Då taq polymeraset verkar och bygger en ny komplementär kedja kommer reportern och quenchern ifrån varandra och fluorescensen från reportern kan detekteras.
Fördelarna är att taqman är mer specifik än ex. SYBR Green då den binder till målsekvensen. Då proben är genspecifik finns även möjligheten att skilja mellan olika gentyper i proven. Fastställa ex. vilken typ av nororvirus som finns i ett prov.
Nackdelarna är att dessa prober är svårare att designa samt att de är markant dyrare. Ingen smältkurvsanalys kan användas.
Vilka för- och nackdelar finns med serologi?
Fördelar: Enkelt, snabbt, billigt.
Nackdelar: Svårt att skilja på en aktiv infektion och en tidigare och nu avslutad infektion. Tiden för provtagningen är av stor vikt - Tidigt = antikroppar har inte hunnit bildats, sent = Infektionen är inte längre aktiv.
Vilka för- och nackdelar finns med elektronmikroskopi?
Fördelar: Man kan hitta nya agens.
Nackdelar: Avancerad och dyr utrustning samt att den är okänslig - den visar även det man inte letar efter.
Vilka för- och nackdelar finns med odling?
Fördelar: Starkt bevis för aktiv infektion och visar endast levande agens.
Nackdelar: Långsam + att alla virus inte går att odla.
Vilja är för- och nackdelarna med molekylärbiologiska metoder?
Fördelar: De är snabba och ofta väldigt känsliga.
Nackdelar: De kan ej skilja på levande och död agens samt att de generellt är väldigt kontaminsationskänsliga.
Varför kan inte exponential fasen hos en qPCR reaktion pågå för alltid?
För att det exponentiellt blir svårare och svårare att hitta nukleotider samt att taq polymeraset blir utmattat. Exponentialfas går då över i en linjär fas.
Vad händer i exponentialfasen?
Teoretiskt fördubblas det genetiska materialet för varje cykel.
