Preguntas

Question 1

¿Qué es la titulación isotérmica calorimetrica (ITC)?

Answer 1

Técnica que permite conocer la afinidad de los fármacos con las proteínas.

Question 2

¿Cómo funciona la técnica ITC?

Answer 2

Posee una celda que permite detectar la absorción o liberación de calor, determinando así la entalpia.

Question 3

¿Por qué la ITC se denomina titulación?

Answer 3

Porque se van añadiendo distintas concentraciones de fármaco. Si es menor la concentración, será más afín a la proteína.

Question 4

¿Qué es el dicroísmo circular?

Answer 4

Técnica espectroscópica que cuantifica el grado de estructura secundaria de las proteínas.

Question 5

¿Cómo funciona la técnica de dicroísmo circular?

Answer 5

Se basa en la interacción de la luz con las proteínas. El instrumento emite una luz circularmente polarizada.

Question 6

¿Qué otra función posee la técnica de dicroísmo circular?

Answer 6

Otra función que posee esta técnica es estudiar la estabilidad de las proteínas.

Question 7

¿Cuáles son las técnicas para comprender el funcionamiento de las proteínas?

Answer 7

Son mediante aplicaciones indirectas. Se realizan separaciones y purificaciones.

Question 8

¿Cuántos métodos de separación hay? ¿Cuáles son?

Answer 8

Existen dos métodos, uno cromatográfico y otro electroforético. El primero se usa para purificar proteínas y el segundo para cuantificar la cantidad de proteínas.

Question 9

Explique el funcionamiento de una cromatografía

Answer 9

Está compuesta por dos fases, una móvil y otra estacionaria. La fase estacionaria posee un compuesto activo que interactúa con el analito y permite el viaje del mismo por la columna. Por su parte, la fase móvil es la que contiene al analito en estudio.

Question 10

¿Cuáles son los tipos de cromatografía utilizadas en el estudio de proteínas?

Answer 10

Existen tres tipos, la de intercambio iónico, exclusión por tamaño y por afinidad.

Question 11

Mencione características de la cromatografía por intercambio iónico

Answer 11

Tiene dos fases estacionarias, un carboximetil o una amina cuaternaria llamada DEAE. El primero se encuentra con carga negativa y el segundo con carga positiva, ambos a pH neutro (pH=7).

Question 12

Explique las interacciones de las proteínas en la cromatografía por intercambio iónico

Answer 12

Las proteínas van a interaccionar con la fase estacionaria dependiendo de su carga y del pH, donde la carga será aportada por los aminoácidos. Mientras mayor sea la interacción con la fase estacionaria, más tardará la proteína en eluir y viceversa.

Question 13

Mencione los inconvenientes de la cromatografía por intercambio iónico y cómo se soluciona

Answer 13

El principal es que las proteínas tarden mucho en eluir debido a la fuerte interacción con la fase estacionaria. Esto se puede solucionar empleando un gradiente de concentración con sales.

Question 14

Mencione los inconvenientes de la cromatografía por intercambio iónico y cómo se soluciona

Answer 14

El principal es que las proteínas tarden mucho en eluir debido a la fuerte interacción con la fase estacionaria. Esto se puede solucionar empleando un gradiente de concentración con sales.

Question 15

Explique el fundamento del empleo de sales para solucionar los inconvenientes en las cromatografías

Answer 15

Se emplea un gradiente de concentración de sales. La finalidad de esto es que la sal compita con la proteína para interaccionar con la fase estacionaria.
De esta forma, la proteína puede eluir más rápido.
Sí a una baja concentración de sal, eluye una proteína, significa que tenía carga de cero.

Question 16

Explique la cromatografía por exclusión molecular

Answer 16

La fase estacionaria está compuesta por esferas con hendiduras que permiten el ingreso de las proteínas según su tamaño.

Question 17

Explique por qué es importante el movimiento browniano en la cromatografía por exclusión

Answer 17

Porque el movimiento browniano permite que las proteínas pequeñas ingresen a las hendiduras, aumentando el tiempo de retención, mientras que las de mayor tamaño van a eluir más rápido.

Question 18

Explique el fundamento de la cromatografía por afinidad

Answer 18

En esta cromatografía la fase estacionaria es afin con la proteína en estudio. El fundamento es el mismo de las de intercambio iónico. Son cromatografías de baja capacidad, por lo que se suele acompañar con otras.

Question 19

¿Cuál es la finalidad de un TAG molecular y dónde se añaden?

Answer 19

Tras purificar una secuencia de ADN de la proteína, se añade un TAG cuya finalidad es diferenciar a la proteína expresada del resto.

Question 20

Mencione una fase estacionaria de la cromatografía de afinidad

Answer 20

Una de ellas es la niquel NTA, un polímero que se coordina con dos moléculas de agua que pueden ser reemplazadas por los nitrógenos de dos histidinas. O sea, esta fase sirve para unir histidinas.

Question 21

Explique el método salting in, salting out

Answer 21

Consiste en un método de purificación por precipitación selectiva por sales. Salting in consiste en el aumento de la solubilización de proteínas y salting out en la formación de un precipitado.

Question 22

Explique que es la solvatación, las cadenas hidrofobicas y cómo afectan en la solubilidad.

Answer 22

La solvatación es la interacción de moléculas de solvente con el soluto, lo que disminuye la solubilidad. Las cadenas hidrofobicas también disminuyen la solubilidad y, por su parte, el empleo de algunas sales como sulfato de amonio, también la disminuyen.

Question 23

¿Qué es la electroforesis?

Answer 23

Corresponde al movimiento de iones frente a un voltaje en una placa con dos electrodos. La rapidez del movimiento depende del potencial, fricción y viscosidad.

Question 24

Explique las relaciones de las variables de la electroforesis. ¿De qué depende el potencial?

Answer 24

La velocidad es proporcional al potencial. El potencial se puede multiplicar con el voltaje aplicado.
El potencial es variable y depende de la carga y de la fricción, siendo directamente proporcional a la carga e inversamente a la fricción.

Question 25

Discuta la relación entre fricción y tamaño

Answer 25

A menor fricción, menor tamaño y viceversa. Por otro lado, un gran tamaño puede compensarse con una gran carga.

Question 26

Explique cómo separar moléculas de ADN según su tamaño y por carga.

Answer 26

El ADN posee grupos fosfodiester con carga negativa -1. Para separar al ADN se prepara un gel con un polímero llamado agarosa, el cual posee espacios para permitir la unión del ADN según el tamaño.
Además, el gel posee dos electrodos, los que permitirán la unión de los grupos fosfodiester al anodo del gel.

Question 27

Explique los problemas de la separación de proteínas

Answer 27

Las cargas de las proteínas no siempre son las mismas, ya que su carga depende de los aminoácidos, además presentan distintos tamaños, por lo que su relación carga/masa será distinta.

Question 28

Explique cómo solucionaría el problema de la separación de proteínas

Answer 28

Para ello se añade al gel un detergente llamado SDS que contiene acrilamida y bis-acrilamida (polímeros), además de lauril sulfato de sodio que desnaturalizan la proteína, rompiendo su estructura 3D. Generalmente, se une una molécula de SDS por cada dos residuos de aminoácidos, lo que permite la uniformidad de la relación carga/masa.

Question 29

Explique la relación migración vs logaritmo peso molecular y su utilidad en el estudio de proteínas

Answer 29

Las proteínas de mayor logaritmo peso molecular van a emigrar poco, ya que son más grandes. Es útil esta gráfica porque se tienen datos conocidos, los cuales permiten la interpolación para obtener los datos de la proteína en estudio.

Question 30

Describa un estudio de purificación de proteínas ideal incluyendo las distintas etapas

Answer 30

1- Homogeneizado: Se encuentran todas las proteínas.
2- Salting out: Formación de precipitados.
3- Intercambio iónico
4- Exclusión
5- Afinidad
Por lo tanto, la proteína en estudio se va a oscurecer y su concentración relativa irá en aumento según la cantidad de etapas.

Question 31

¿Qué es el punto isoelectrico?

Answer 31

Corresponde al pH en el cual la carga de la proteína es cero, por lo tanto, el potencial será cero, no poseerá movilidad electroforetica y no migrará.

Question 32

Explique las reglas de pH relacionadas al punto isoelectrico y su importancia en cromatografía.

Answer 32

Sí la proteína se encuentra un pH debajo de su punto isoelectrico, tendrá carga positiva y viceversa. Es útil en cromatografía porque permite conocer el pH en el cual habrá mayor interacción de la proteína con la fase estacionaria.

Question 33

¿Cuál es la utilidad del punto isoelectrico?

Answer 33

Permite la formación de geles de dos dimensiones. La relevancia de estos geles es que se pueden separar proteínas según carga y tamaño.

Question 34

¿Qué es la técnica de isoelectroenfoque?

Answer 34

Presente en los geles 2D. Consiste en un gel que posee un gradiente de pH, dónde en la zona inferior del mismo el pH es bajo y se encuentra un anodo, mientras que en la zona de pH alto se encuentra catodo.

Question 35

Explique cómo interactúan las proteínas con este gel 2D

Answer 35

Las proteínas al ingresar llegan a la zona con pH=7. Luego, se moverán hacia su punto isoelectrico (primera dimensión, fase isoelectroenfoque). Después se traslada a un gel en presencia de SDS, donde se van a separar según su tamaño (segunda dimensión). Finalmente, se añaden los electrodos.