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Practica De ELISA Flashcards

1
Q

Nombre de la práctica

A

Practica de ELISA de Bio-Progesterona

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2
Q

Intención de uso

A

El kit Progesterona ELISA se utiliza para la determinación cuantitativa
de concentraciones de la Hormona Progesterona en suero o plasma
humano

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3
Q

Que es la progesterona

A

La progesterona es un estereroide C21, que es sintetizada a partir de los tejidos y colesterol circulante.

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4
Q

en que es transformado el colesterol

A

El colesterol es transformado en pregnenolona por medio de la deshidrogenasa e isomerasa en progesterona.

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5
Q

sitos principales de produccion

A

Los sitios principales de producción son las glándulas suprarrenales, los ovarios y la placenta durante el embarazo.

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6
Q

rol primario de la progesterona

A

El rol primario de la progesterona se presenta en los órganos
reproductores. En los hombres, la progesterona es un intermediario
necesario para la producción de corticosteroides y andrógenos. En
mujeres la progesterona permanece a niveles relativamente constantes
en la fase folicular del ciclo menstrual.

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7
Q

porque se eleva la progesterona

A

La concentración incrementa rápidamente durante la ovulación y permanece elevada por 4 – 6 días y decrece a los niveles iniciales 24 horas antes del inicio de la menstruación. En el embarazo, la producción de progesterona por medio de la placenta incrementa los niveles de 10 a 20 veces de aquellos del pico de la fase lútea

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8
Q

determinacion de progesterona

A

La determinación de progesterona es efectuada para determinar la ovulación así como para caracterizar los defectos de la fase lútea. El monitoreo de la terapia con progesterona y las evaluaciones del embarazo temprano comprenden el resto de los ensayos de progesterona

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9
Q

principio del ensayo

A

La Progesterona es una fase competitiva de ELISA. Las muestras y la enzima conjugada de Progesterona son agregadas a los pozos recubiertos con anticuerpos anti-Progesterona monoclonales. La progesterona presente en la muestra del paciente competirá con la Progesterona marcada enzimáticamente por la unión con el anticuerpo anti-Progesterona inmovilizado en la superficie del micropozo.

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10
Q

MATERIALES PROVISTOS

A

MATERIALES PROVISTOS
96 Pruebas

  1. Micropozos recubiertos con Progesterona
    MAc
    12x8x1
  2. Estándares de Progesterona : 6 viales (listos
    para su uso)
    0.25 ml
  3. Conjugado Biotin Progesterona: 1 frasco (listo para su uso)
    7 ml
  4. Enzima Conjugada (20 X)
    0.7 ml
  5. Diluyente de la muestra: 1 frasco (listo para su uso)
    12 ml
  6. Sustrato TMB: 1 frasco (listo para su uso)
    12 ml
  7. Solución de Frenado: 1 frasco (listo para su uso)
    12 ml
  8. Solución de Lavado Concentrado: 1 frasco (20X)
    25 ml
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11
Q

MATERIALES REQUERIDOS PERO NO PROVISTOS

A
  1. Agua destilada o desionizada.
  2. Pipetas de precisión.
  3. Puntas de pipetas desechables.
  4. Lector Microelisas con lente a 450nm de longitud de onda
  5. Papel absorbente o toalla de papel.
  6. Papel cuadriculado
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12
Q

ALMACENAMIENTO Y ESTABILIDAD

A
  1. Almacene el kit a 2 - 8°C.
  2. Mantenga las tiras de los pocillos selladas en la bolsa de aluminio.
  3. Todos los compuestos son estables hasta su fecha de expiración
    siempre y cuando las condiciones de almacenaje sean
    estrictamente llevadas a cabo como aquí se indica.
  4. No exponga los reactivos al calor, luz solar o intensa luz eléctrica.
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13
Q

ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES

A
  1. Potencial de los materiales de riesgo biológico: Los calibradores
    contienen componentes de origen humano, que se han sido
    probados y encontrados no reactivos para el antígeno de superficie
    de hepatitis B y anticuerpos contra el VIH Aprobado por la FDA.
    Sin embargo no hay método de prueba que puede ofrecer
    completa seguridad de que el virus VIH, Hepatitis B u otros
    agentes infecciosos estén presentes. Estos reactivos deben ser
    manejados según el Nivel de Bioseguridad 2
  2. No pipetee con la boca. No fume, coma , o beba en el área donde
    maneje este equipo
  3. Los componentes en este equipo son para uso como una unidad
    integral. Los componentes de diferentes lotes no se deben mezclar
  4. Para obtener óptimos resultados, debe apegarse estrictamente al
    protocolo. Pipeteado exacto y preciso, así como después de la
    hora exacta y requerimientos de temperatura prescritos son
    esenciales. Cualquier desviación de este pueden dar datos no
    válidos.
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14
Q

LIMITACIONES DE LA PRUEBA

A
  1. Los resultados obtenidos mediante la utilización de este kit sirven
    solo como ayuda en el diagnóstico y deben ser interpretados en
    relación a la historia clínica del paciente, síntomas y otros
    procedimientos de diagnóstico.
  2. No utilice ácido de sodio como conservador ya que inhibe la
    actividad de la enzima HRP.
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15
Q

RECOLECCIÓN DE LA MUESTRA

A
  1. Se recomienda recoger muestras de suero con equipamientos
    disponibles en el mercado. Las muestras de suero debe ser
    totalmente incoloro incluso el color rojo muestra ligera
    contaminación de la sangre.
  2. Las muestras pueden ser refrigeradas de (2-8°C) por 1 día.
    Muestras congeladas (-20°C) no más de un mes.
  3. Evitar múltiples ciclos de congelación-descongelación.
  4. Previo al ensayo, las muestras congeladas, deberán
    descongelarse totalmente y mezclase.
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16
Q

PREPARACIÓN DEL REACTIVO

A
  1. Reactivo de trabajo enzima conjugada: Diluir la enzima
    conjugada 1:21 con diluyente de muestra en un recipiente
    adecuado. Por ejemplo, diluir 100µl del conjugado con 2 ml de
    diluyente de la muestra (este reactivo de trabajo es suficiente para
    10 micropozos).
  2. Buffer de Lavado Prepare una solución de lavado 1X, adicionando
    el contenido de la botella (25 ml.20 X) a 475 ml de agua destilada o
    desionizada.
    Conserve a temperatura ambiente.
17
Q

PROCEDIMIENTO DEL ENSAYO primer paso

A

Previo al ensayo, permita que todos los reactivos alcancen la
temperatura ambiente (18°-26°C). Mezcle suavemente los reactivos
antes de su uso.
1. Corte el número de pozos a utilizar. Cierre y selle el resto de los
micropocillos no utilizados y refrigérelos a 2-8° C.

18
Q

CÁLCULO DE RESULTADOS

A

La curva estándar se construye de la siguiente manera:
1. Compruebe el valor estándar de la media de la absorbancia (a450)
para cada grupo de Estándares de referencia, controles y
muestras. Este valor puede variar de lote a lote. Asegúrese de
verificar el valor de cada kit. Véase el ejemplo de la norma adjunta.
2. Para construir la curva estándar, trazar la absorbancia para el
estándar de Progesterona (eje vertical) frente a las concentraciones
estándar de Progesterona (eje horizontal) en un papel gráfico
lineal. Dibuje la mejor curva a través de los puntos.
3. Leer la absorbancia de los controles y cada muestra desconocida
de la curva. Registre el valor de cada control o muestra
desconocida.

19
Q

VALORES EXPERADOS Y SENSIBILIDAD

A

VALORES EXPERADOS
Se recomienda que cada laboratorio establezca sus propios rangos
normales sobre la base de una muestra representativa de la población
local. Los siguientes valores de Progesterona pueden ser utilizados solo
como guía:

Hombres
18-29 años ≤0.3
30-59 años ≤0.2

Mujeres
Fase folicular ≤2.7
Fase lútea 3.0-31.4
Postmenopausicas ≤0.2
1er trimestre 10.25-44.0
2º trimestre 19.5-82.5
3er trimestre 65.0-229.0

Niños
5-9 años
Hombres: ≤0.7
Mujeres: ≤0.6
10-13 años
Hombres: ≤1.2
Mujeres: ≤10.2
14-17 años
Hombres: ≤0.8
Mujeres: ≤11.9

Se mide en ng/mL

20
Q

PERFORMANCE.
Precisión:
Intra Ensayo

A

Suero
1
No. de Réplicas
10
Media ng/ml
1.72
Desviación standar
0.092
Coeficiente de Variación (%)
5.36

Suero
2
No. de Réplicas
10
Media ng/ml
10.1
Desviación standar
0.16
Coeficiente de Variación (%)
1.62

Suero
3
No. de Réplicas
10
Media ng/ml
19.7
Desviación standar
0.4
Coeficiente de Variación (%)
2.04

21
Q

PERFORMANCE.
Precisión:

Inter Ensayo

A

Suero
1
No. de Réplicas
10
Media ng/ml
2.16
Desviación standar
0.21
Coeficiente de Variación (%)
9.68

Suero
2
No. de Réplicas
10
Media ng/ml
9.73
Desviación standar
0.85
Coeficiente de Variación (%)
8.8

Suero
3
No. de Réplicas
10
Media ng/ml
19.1
Desviación standar
1.2
Coeficiente de Variación (%)
6.3

22
Q

Sensibilidad:

A

La sensibilidad de esta prueba fue al calcular la media más dos desvíos
estándar del punto de estándar cero, veinte veces en la misma prueba.

Suero
Zero
No. de Réplicas
20
Media ng/ml
0.04
Desviación standar
0.09
Media + 2SD (Sensibilidad)
0.22 ng/ml

23
Q

Procedimiento del ensayo segundo paso

A
  1. Agregue 20 µl de estándares, especímenes y controles en los
    pozos apropiados.
24
Q

Procedimiento del ensayo 3er paso

A
  1. Agregue 100 µl de enzima conjugada de trabajo en cada pocillo.
25
Q

Procedimiento del ensayo 4to paso

A
  1. Agregar 50 µl de Conjugado Biotin Progesterona a cada pocillo
26
Q

Procedimiento del ensayo 5to paso

A
  1. Incube a temperatura ambiente por 60 minutos (20-25°C).
27
Q

Procedimiento del ensayo 6to paso

A
  1. Retire el líquido de los pocillos. Enjuague y lave los pocillos tres
    veces con 300 µl de solución de lavado de 1X. Golpee la placa de
    los micropocillos sobre papel absorbente para remover las gotas
    de agua residuales.
28
Q

Procedimiento del ensayo paso 7

A
  1. Vierta 100 µl de sustrato TMB a todos los pocillos.
29
Q

Procedimiento del ensayo paso 8

A
  1. Incube a temperatura ambiente por 15 minutos.
30
Q

Procedimiento del ensayo paso 9

A
  1. Frene la reacción agregando 50 µl de solución de frenado a cada
    pocillo. Mezcle gentilmente para facilitar el mezclado de la solución.
31
Q

Procedimiento del ensayo paso 10

A
  1. Lea la densidad óptica a 450nm con un lector de placa de micro
    valoración en un plazo de 15 minutos después de haber agregado
    la solución de frenado.

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