PPT1 Flashcards
O que são fatores de transcrição?
São proteínas modulares com vários domínios que permitem que comece a transcrição
Distinga os dois tipos de enzimas de processamento do DNA.
Que moléculas interagem com o DNA?
A maioria dos fatores de transcrição
enzimas de restrição e de reparação do DNA
proteínas de empacotamento do DNA
Recombinases
As zonas reguladoras do DNA necessitam de estar geograficamente próximas dos genes que regulam?
Não. Regulatory DNA sequences that can work over distances of 100Kb or more from the gene promotor.
Quais são os 4 tipos de reguladores de genes a longa distância (long range)?
Enhancers
Aumentam a atividade do promotor de um gene quando há necessidade de produção de X proteína.
Apenas 1-2% efetivamente regulam genes
Os mamíferos têm 1 000 000 deles
100-500bp
Têm binding sites para vários TF e existem em todo o genoma
Silencers
Decrescem a atividade do promotor
Maiores que os enhancers: 700-1000bp
Existem em todo o genoma
Insulator
Separa as regiões de eucromatina e heterocromatina
300-2000bp
Bloqueia enhancers e insuladores
Locus control regions (LCR)
Sequências de DNA que promovem a transcrição de DNA a jusante (3’)
Como é feito o transporte dos enhancers para uma região promotora?
Por transvecção. Os enhancers são trazidos em trans para a região promotora
A RNA polimerase pode ligar-se diretamente ao DNA de eucariotas para iniciar a transcrição?
Não. Primeiro têm de ligar-se os fatores transcrição basais (BTF) para haver uma região suficientemente comprida para a RNA poly se ligar.
Os BTF têm a forma TFnX em que n é o número da polimerase (I,II,III) e X é uma letra
Como é feito o reconhecimento do promotor pela RNA polimerase nos eucariotas?
Os eucariotas têm vários tipos de RNA polimerases dependentes de DNA e de organelos.
RNA polimerase:
I (nucléolo); transcreve: 18S, 28S e 5,8S rRNA (RNA RIBOSSOMAL) promotor: [A montante de +1] (96% de todo o RNA)
II (núcleo) transcreve: mRNA snRNA U1-U7 exceto U-6 miRNA promotor: [A montante] (2-3% de todo o RNA)
III (núcleo) transcreve: tRNA rRNA snRNA promotor: [A jusante]
As sequências promotoras são pequenas e conservadas e reconhecidas por BTF
Nas plantas: RNA polimerase IV e V
Descreva a região de enhancers e promotores da RNA polimerase II
Enhancer: 100 bp, contém binding sites muito próximos uns dos outros para a ligação de fatores de trasncrição. Cis-acting. Pode funcionar em ambas as direções a montante ou ajusante.
Promotor: 100 bp, sequências disperas que permitem a ligação do aparato de transcrição basal.
Os enhancers e os promotores podem estar separados por centenas de bp
Que tipos de fatores de transcrição se podem ligar aos enhancers?
Ativadores ou repressores.
Os enhancers causam a acumulação de ativadores perto dos promotores em cis, o que permite uma maior frequêcnia de expressão génica.
Quais são os três tipos de ativadores que se podem ligar aos enhancers?
Ativadores verdadeiros: ligam-se a regiões específicas do DNA
Os ativadores capazes de recrutar proteínas remodeladoras da cromatina
Fatores de arquitetura que dobram o DNA
Existe um análogo de enhancer em leveduras?
Sim, a UAS. Comporta-se como um enhancer mas só funciona a montante do promotor.
Os enhancers costumam trabalhar em cis ou em trans com os promotores?
cis
Como é que os enhancers podem funcionar em trans?
Os enhancers podem funcionar em trans se houver ligação do DNA que contém o promotor com o DNA que contém o ehancer por ponte proteíca ou catenação das duas moléculas
O que são coativadores e correpressores?
Coativadores e correpressores são proteínas que aumentam e decrescem a atividade de transcrição sem se ligarem ao DNA. Eles ligam-se diretamente aos fatores de transcrição e ou recrutam proteínas ou têm atividade enzimática
Quais são as duas classes de coativadores?
Complexos modificadores de cromatina (modificações das histonas, acetilação, metilação, ubiquitação…)
Complexos remodeladores de cromatina (deslizamento de nucleossomas, remodelação, substituição e deslocalização (displacement))
Qual é a estrutura das RNA polimerases dos eucariotas?
Tipicamente têm 2 subunidades: 2 grandes e o resto pequenas e comuns entre várias RNA polimerases
500 kDa
Que terminação tem a maior subunidade da RNA polimerase II (polimerase melhor estudada)?
Domínio carboxi-terminal: várias repetições de zonas de consenso de 7 aminoácidos (52 rep em mamíferos e 26 em leveduras)
Que função tem o domínio carboxi-terminal da RNA poli II
Regula a iniciação da transcrição
Elongamento da transcrição
Processamento de mRNA
Exporta o mRNA para o citoplasma
O domínio terminal carboxílico da RNA poli II apresenta 4 etapas diferentes na transcrição, identifica-as, mencionando os estados de fosforilação.
Pré iniciação: Desfosforilado. Sem fatores de transcrição ligados
Iniciação: Já temos fatores de transcrição ligados, já se inicia a síntese de mRNA. Aumento da fosfo-serina-2 (Ser2P)
Elongação: CTD fosforilado
Terminação: os fatores de transcrição soltam-se
Como são as RNA polimerases dos cloroplastos e mitocôndria?
Mais pequenas, assemelha-se a polimerases bacterianas.
Os genomas são mais pequenos e a regulação é mais simples.
As RNA polimerases reconhecem o promotor diretamente?
não
Fala sobre os dois RNA polimerases dos cloroplastos das plantas
Plastid-econded-plastid PEP : 3 subunidades betas e 1 alfa responsável pelo reconhecimento do promotor
Nucleus-econded plastid NEP
Os promotores a que a RNA poli I se liga têm 2 partes. Quais são?
Região promotora core e Upstream Promoter Element (UPE) que afeta a eficiência da transcrição. Ambas estas sequências são ricas em GC. O upstream binding factor (UBF) liga-se ao upstream promotor element.
Que outro elemento para além das duas partes do promotor da poli I é que é necessário para que ocorra transcrição)
O selectivity factor 1, SL1 conhecida por TIF-IB e 3 TAFI. O SL1 é uma proteína multimérica composta por TBP (proteína que se liga à TATA) e 3 TAFI semelhante ao fator sigma. Permite o reconhecimento da RNA poli I
A que se liga a RNA poli I?
TIF-IA
Quais são as duas classes de promotores utilizadas pela RNA polimerase III?
Interna e externa.
Interna (pode ou não ter TATA box):
tipo I (5S rRNA) pode ou não ter (TATA) → Box A → elemento intermédio → box C
tipo II (tRNA, Rnase): pode ou não ter (TATA) → Box A → Box B
Externa (tem TATA box): não têm boxes ao contrário dos promotores internos. Apresenta duas regiões a montante da TATA box: DSE e PSE distal and proximal sequence element.
Descreva o mecanismo de ligação da RNA polimerase III ao DNA do promotor interno tipo I.
O fator de transcrição 3 A (TFIIIA) liga-se à BOX A. Depois disso, TFIIIC liga-se à BOX C. Estes dois fatores de transcrição são assembly factors. Eles não fazem parte do complexo de transcrição, apenas permitem a sua ligação. Depois de TFIIIA e TFIIIC estarem ligados liga-se TFIIIB (que contém uma proteína de ligação à TATA box, TBP (Tata box binding protein) e esse é o real fator de transcrição de iniciação. Liga-se a RNA polimerase.
Descreva o mecanismo de ligação da RNA polimerase III ao DNA do promotor interno tipo 2.
Ligam-se dois fatores de transcrição 3 C (TFIIIC) às BOX A e BOX B. Liga-se então TFIIIB que é o fator de transcrição de iniciação real. Os dois primeiros fatores são apenas de assembly. A RNA poli III liga-se ao DNA depois da TFIIIB estar ligada.
Descreva o mecanismo de ligação da RNA polimerase III ao DNA do promotor externo tipo 3.
A TATA box pode ser suficiente para iniciar a transcrição mas o distal and proximal sequence element permitem a amplificação da eficiência da transcrição. DSE e PSE.
Quais são os principais produtos da RNA polimerase II?
Proteínas, já que a RNA poli II é responsável pela transcrição de todos os genes que codificam proteínas. miRNA, snRNA (U1-U7 extenso U6)
Os promotores da polimerase III têm obrigatoriamente uma TATA box?
Não. Quando o promotor da RNA polimerase III não tem TATA box pode ter um downstream promoter element (DPE). A distância entre o promotor e a DPE tem que ser ideal para transcrição ótima a mais ou menos +18-+27
Que tipos de nucleótidos flanqueiam as sequências iniciadoras, inr, nos promotores da Polimerase III?
(base azotada)
Pirimidinas. O motivo iniciador localiza-se entre -3 e -5.
Qual é a diferença entre um promotor core focado e um promotor core disperso? E um mixed?
Em promotores core focados a transcrição inicia-se num só sítio ou num cluster de sítios numa região muito curta.
Em promotores core dispersos existem várias zonas de iniciação num espaço de 50 a 100 nt.
Quando há mistura vamos ter um promotor mais forte e outros menos fortes a flanqueá-lo.
Que outros elementos promotores da RNA polimerase II conhece para além da DPE e TATA box?
BRE (zona de reconhecimento de TFIIB), fica a montante TATA box e MTE que fica a montante de DPE.
Que processo de remodelação da cromatina tem que ocorrer para que se inicie a transcrição)?
Qualquer nucleossoma posicionado perto do promotor tem que ser removido ou modificado. Nucleosome sliding, removal, substitution e remodelação
Que nome têm os fatores de transcrição remodeladores da cromatina?
hint: chapéu
HAT
Qual é o fator essencial que permite a ligação da RNA polimerase I, II e III ao binding site (na minor groove)?
TBP, TATA binding proteins.
Explique a função das TBP (TATA binding proteins) e dê exemplos destes fatores na ligação da polimerase I II e III.
As TBP são um fator de posicionamento que se liga diretamente à TATA box. S esta não estiver presente como pode ocorrer para os promotores interiores tipo 1 e tipo 2 da RNA poly III as TBP ligam-se ao inr.
Poly I: presente no fator de seletividade: SL1
Poly II: presente em TIIFD
Poly III: presente em TIIIFB
TAF (TBF associated factors) também existem associados
Associa a polimerase
TFIIIB
Polimerase III
Associa a polimerase
TFIID
Polimerase II
Associa a polimerase
SLV1
Polimerase I
Que genes não costumam apresentar TATA box?
Genes “housekeeping” ou de manutenção: são genes constitutivos que são necessários para a manutenção da função celular básica e são expressos em todas as células de um organismo sob condições normais e patofisiológicas.
Genes regulados pelo desenvolvimento do organismo (tipo o sistema imunitário)
Os promotores sem TATA box necessitam de TFIID?
Sim mas eles posicionam-se recorrendo ao Inr. Fatores de transcrição associados a TATA binding factors conseguem reconhecer regiões downstream promotor element (DPE) (não confundir com DSE distal sequence element da polimerase III que aumentam a eficiência da ligação ao promotor externo)
Quais são os 3 estágios de abertura da cromatina?
Cromatina fechada (gene inativo) > Cromatina permissiva (necessita de segundo sinal) > Cromatina aberta: gene ativo (necessita de TF basais)
Onde se monta o complexo de transcrição basal?
No promotor depois da ligação de TFIID (TBP + TAF) à TATA box ou Inr. O RNA II liga-se ent aos promotores mas precisa de mais TF diferentes para começar a transcrição
Para que serve TFIIE e TFIIH
Aparecem em estágios mais tardios da iniciação da transcrição. TFIIH é o TF mais complexo ao ponto que até participa na reparação do DNA. Tem função de ATPase e Helicase, cinase, ajuda na elongação da transcrição
Para que serve um mediador (complexo de 25 a 30 proteínas)?
Tem uma região conservada que interage com a CTD da polimerase II e proteínas que interagem com os TF em regiões longe do promotor. Conecta ativadores transcricionais ou repressores com a pol II
Quais são os diferentes estágios da iniciação da transcrição
Promotor melting, iniciação abortiva (RNA polimerase sintetiza 7 nucleótidos mas n sai do prmotor), Promotor escape (depois dos 10 nt), Pausa (negative elongation factor (NELF) + DRB-sensitivity-inducing factor (DSIF) , Libertação da pausa (Positive transcription elongation factor-b (PTEFb))
A pausa para por fosforilaçã do NELF e DSIF
Quando começa a elongação produtiva?
Depois do capping do RNA em 5’
O complexo polimerase é fechado?
‣ Binding of RNA pol generates a closed complex that progresses to an open complex where DNA strands are separated.
O que permite a libertação do promotor e elongação?
O domínio carboxi-terminal CTD da RNA polimerase quando fosforilado liberta o promotor
Que serinas são fosforiladas na CTD para ativar que fases da transcrição?
quinta para iniciação da transcrição
segunda para elongação
Que fator de transcrição catalisa o primeiro evento de fosforilação na CTD da polimerase?
TFIIH
Como é que as células eucarióticas lidam com os nucleossomas na transcrição?
Os nucleossomas são disrupted por remoção de H2A e H2B por fatores auxiliares de elongação (EF) e FACT (facilitates cromatin transcription) e TFIIs
