PCR e Eletroforese Flashcards
Quem foi o criador da técnica de PCR e em que ano isso aconteceu?
Kary Mullis, em 1983.
O que é PCR?
Reação em Cadeia da Polimerase. É uma técnica que tem por objetivo realizar a replicação do DNA in vitro.
Quais são as aplicações do PCR?
Clonagem molecular, diagnóstico de doenças genéticas e infecciosas, identificação de indivíduos, detecção de contaminação por bactérias, vírus ou fungos, quantificar diferenças na expressão de genes (RT-PCR).
Quais são os 5 principais reagentes para a PCR?
Taq polimerase, dNTPs, cloreto de magnésio, solução tampão, DNA molde e primer
Como é o primer da PCR e qual a principal diferença entre ela e o primer da replicação de DNA in vivo?
O primer da PCR é feito de DNA fita simples e é sintetizado quimicamente de maneira específica para o gene a ser estudado.
Quantos primers são necessários na PCR?
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O que é termociclador?
É um equipamento que promove ciclos de temperaturas pré-estabelecidos com tempos específicos para que as reações ocorram.
Quais são os tempos utilizados no termociclador (aproximadamente) e quais eventos ocorrem em cada um desses tempos?
95°C = desnaturação da dupla fita de DNA;
55°C = anualmente dos primer ao DNA;
72°C =Replicação do DNA pela Taq polimerase.
O DNA fica aproximadamente quantos ciclos para amplificação?
Entre 25-40.
Como é possível detectar os produtos amplificados de DNA?
Através do gel de agarose (PCR convencional).
Qual é o princípio da eletroforese em gel?
É a migração e separação de partículas em um suporte (gel) por diferença de potencial elétrico (DDP).
A DDP separa as partículas de acordo com quais critérios?
Carga e massa (tamanho).
Quais são os tipos de suporte da eletroforese e qual é o mais recomendado?
Gel de agarose (mais recomendado) e gel de poliacrilamida
Quais são os materiais utilizados para a eletroforese além do suporte de gel?
Cuba, tampa com eleteodos (negativo em cima e positivo embaixo), “transformador” de corrente elétrica e tampão para estabilizar o pH do meio
Por que quanto menos concentrado o gel for, melhor?
Por que altas concentrações do gel podem impedir a passagem das partículas pela sua malha.
O que é marcador de peso molecular e como podem ser expressos?
É uma solução que apresenta vários fragmentos de DNA de massa conhecida. Podem ser expressos em kilobase ou pares de base
Como os marcadores de bases podem ser utilizados?
Eles são colocados paralelamente à corrida do DNA de massa desconhecida e serem usados como um padrão de corrida.
O brometo de etídio é um tipo de corante de DNA antigamente muito utilizado na eletroforese. Por que caiu em desuso?
Por que o brometo de etídio é cancerígeno.
Hoje em dia qual é um dos melhores corantes utilizados para corar DNA?
O UniSafe Dye. Além de não ser cancerígeno, ele é capaz de detectar fragmentos muito pequenos de DNA.
