PCR

Question 1

¿Cual es la base del PCR?

Answer 1

El PCR (Reaccion en cadena de la Polimerasa), se basa en la amplificacion de una region especifica del ADN, en donde hay secuencias unicas del patogeno (virus, bacteria, hongo o parásito).

Question 2

¿Cuales son los componentes necesarios para llevar a cabo la tecnica del PCR?

Answer 2

-Taq DNA polimerasa.
- Desoxinucleotidos.
- Buffer y Cloruro de magnesio.
- Primers (partidores o oligonucleotidos)
- DNA molde.

Question 3

¿Cuál es la diferencia entre nucleotidos y nucleosidos?

Answer 3

Se diferencia en su composicion:
- Nucleotido: Un azucar (Ribosa o desoxiribosa), Una base nitrogenada, uno o varios grupos fosfatos.
- Nucleosidos: Un azucar (ribosa o desoxiribosa), y una base nitrogenada.

Question 4

¿Cuáles son los pasos necesarios para identificar patógenos bacterianos y virales mediante la técnica de PCR y RT-PCR? (Terminos generales)

Answer 4

1. Tomar la muestra de DNA o RNA del patogeno en la muestra bilogica.
2. Purificacion de DNA o RNA utilizando columnas de resina de union de ácidos nucleicos (Lisar el tejido –> DNA o RNA unido a resina –> ADN purificado.
3. Hacer tecnica de PCR o RT-PCR respectivamente.

Question 5

¿Qué significas las siglas PCR?

Answer 5

Reaccion en cadena de la polimerasa

Question 6

¿El PCR es una tecnica in vitro o in vivo?

Answer 6

Es una tecnica in vitro.

Question 7

¿Qué son los partidores?

Answer 7

Son pequeñas secuencias de nucleotidos complementarias de una region especifica del DNA que se desea amplificar.

Question 8

¿Cuales son los tres pasos fundamentales de la PCR?

Answer 8

1. Desnaturalizacion (95°c).
2. Apareamiento o alineamiento (60°c).
3. Extension o sintesis (72°c).

Question 9

¿Por qué los partidores son considerados uno de los factores más importantes en el proceso de PCR?

Answer 9

Porque son los que le dan la eficencia y la especifidad al proceso.

Question 10

¿Qué se debe hacer en el caso del RNA para poder realizar PCR?

Answer 10

Debe ser previamente transformado en DNA, a traves de la reaccion transcripcion reversa o de retrotranscripción (RNA –> DNAc).

Question 11

¿Cuál es el número óptimo de ciclos para la técnica de PCR?

Answer 11

Entre 20 a 35 ciclos.

Question 12

¿Qué sucedería si se realizan más de 35 ciclos en PCR?

Answer 12

• Consumo total de los componentes de la reacción.
• Perdida de la actividad de la polimerasa.
• Acumulacion de productos de PCR no deseados o inespecificos.

Question 13

¿Que significa RT-PCR?

Answer 13

PCR con transcripción reversa.

Question 14

¿En qué casos se utiliza el RT-PCR?

Answer 14

El RT-PCR se utiliza comunmente cuando se necesita amplificar y detectar secuencias especificas o unicas de ARN. (Util en la deteccion de virus de RNA).

Question 15

¿Cuales son los componentes necesarios para llevar a cabo la tecnica del Transcripsion reversa?

Answer 15

• Inhibidor de RNasa.
• Hexameros (primers)
• RNA molde.
• Enzima Transcriptasa inversa.

Question 16

¿Cuáles son los tres pasos de la reacción de transcriptasa reversa y qué temperatura se requiere en cada uno de ellos?

Answer 16

• Desnaturalizacion (70°c)
• Apareamiento o alineamiento (25°c)
• Extension o sintesis (37°c)

Question 17

¿Qué método se utiliza para detectar el producto de la reacción de la cadena de la polimerasa convencional (PCR)?

Answer 17

Mediante electroforésis.

Question 18

¿Qué es el PCR en tiempo real?

Answer 18

Es una modificacion del PCR convecional y sirve para amplificar una region unica del DNA y que permite la deteccion y cuantificacion de los productos de amplificacion en tiempo real.

Question 19

¿Cuales son las desventajas de la visualizacion del producto PCR en geles de agarosa?

Answer 19

• No se puede automatizar.
• Baja sensibilidad.
• Baja resolucion.
• La identidad del producto de PCR es solo por tamaño.
• No es un metodo cuantitativo.

Question 20

¿Cuál es el procedimiento para realizar la PCR en tiempo real?

Answer 20

1.Prepare la mezcla de reacción de PCR que contiene los primers, la enzima Taq polimerasa, dNTP y el fluorocromo.

2. Agregue la muestra de ADN o ARN que se desea amplificar a la mezcla de reacción.
3. Coloque la placa en el termociclador en tiempo real.
4. Durante la amplificación, el fluorocromo se une a los fragmentos de PCR a medida que se amplifican, lo que produce una señal fluorescente que puede ser detectada por el termociclador en tiempo real.
5. La amplificación y detección del fluorocromo continúan durante varios ciclos y la acumulación de la señal fluorescente se registra en tiempo real.
6. La cantidad de señal fluorescente se mide en cada ciclo, lo que permite la determinación cuantitativa de la cantidad inicial de la muestra de ADN o ARN.
7. El resultado se puede representar gráficamente como una curva de amplificación en tiempo real, que muestra la acumulación de señal fluorescente versus el número de ciclos de amplificación.

Question 21

¿A que se le denomina ciclo umbral (Ct) en el PCR en tiempo real?

Answer 21

El momento en que se alcanza un nivel de fluorescencia específico en la reacción de PCR

Question 22

¿A que se le denomina umbral del punto de deteccion en PCR en tiempo real?

Answer 22

Es un valor definido de forma arbitraria que se utiliza para determinar el ciclo de amplificación en el cual se considera que la señal de fluorescencia es significativa y que el producto de PCR se está produciendo de manera detectable.

Question 23

¿Los valores bajo el umbral del punto de deteccion en PCR en tiempo real que significa?

Answer 23

Son valores que no se consideran significativo para la deteccion del producto del PCR, por lo tanto, se considera como una muestra negativa.

Question 24

¿Cuáles son las aplicaciones de la PCR en tiempo real?

Answer 24

• Cuantifiacion viral.
• Deteccion de patogenos.
• Cuantificacion de la expresion genica.
• Evaluar la eficacia de los tratamientos con antibacterianos y antivirales.
• Estimacion de daño en el DNA.
• Genotipificacion.