Pag 13-18 Flashcards
Definizione di unità enzimatica
quantità di enzima in grado di convertire 50 microM di substrato in 1 min a 25°
Definizione di attività specifica di un enzima
unità enzimatica rapportata ai mg di proteina
Definizione di saggio enzimatico
esperimento per misurare la comparsa di prodotto o la scomparsa di substrato in cui la concentrazione di enzima è irrilevante
Per cosa posso utilizzare un saggio in continuo?
Per monitorare il real time la concentrazione di substrato sfruttando:
- fluorescenza
- chemiluminescenza
- assorbanza
- ddp
- produzione di gas: monitoro la pressione
- generazione di uno stereoisomero: uso la racemasi e monitoro con un polarimetro
Elenco di esempi di saggi in continuo utilizzati?
- fumarato-idratasi: monitoro la scomparsa di fumarato (S che assorbe a 300nm)
- lattato-deidrogenasi: monitoro la scomparsa di NADH (cofattore che assorbe a 340nm)
Come posso fare un saggio in continuo di reazioni accoppiate?
- aconitasi: monitoro la comparsa di NADH grazie alla reazione accoppiata mediata da isocitrato deidrogenasi
- lattato deidrogenasi: monitoro la scomparsa di NADH che è associata alla produzione di ATP da parte della piruvato chinasi
Processo generale di un saggio in continuo?
1- preparo 6 campioni a concentrazioni crescenti di substrato
2- aggiungo enzima a condizioni fisse e cofattori a condizioni saturanti
3- costuisco una retta tempo/A: la velocità è proporzionale alla pendenza e il NADH è in rapporto 1:1 con l’enzima
Processo per un saggio in discontinuo?
1- preparo i campioni a concentrazioni crescenti di substrato, enzima fisso, cofattore saturante e tampone
2- scelgo T, tempi e pH
3- creo una retta di taratura con concentrazione di substrato/fluorescenza
4- quenching: blocco la reazione ai tempi stabiliti e misuro la fluorescenza
Che misure posso ottenere da un saggio in discontinuo?
- concentrazione di prodotto
- Vmax
- IC50: se metto substrato ad alte concentrazione e inibitore crescente
- Ki
Un esempio di reazione che posso monitorare con un saggio in discontinuo?
L’enzima NAMPT catalizza la sintesi del nicotinammide mononucleotide (NMN, non ha caratteristiche spettroscopiche o fluorimetriche) a partire dal NAM
Perchè non posso monitorare una proteina con meccanismo suicida con un saggio in continuo?
perché le condizioni di reazione cambiano ad ogni ciclo di reazione: il substrato resta attaccato all’enzima (c’è meno substrato) e c’è anche meno enzima disponibile al ciclo successivo.
Come posso monitorare una proteina con meccanismo suicida?
Faccio un saggio in discontinuo in cui
1- Creo campioni a concentrazione crescente di SNAP-Vista green
2- Per ogni campione effettuo un time-course: aggiungo l’enzima e lo faccio reagire con il substrato fluorescente.
3- Quenching di ogni campione: stoppo la reazione a tempi noti mediante aumento di temperatura. Faccio quindi 6 prelievi per ogni campione a tempi noti.
4- Creo una serie di curve tempo-risposta cioè quanta proteina viene modificata rispetto al tempo (grafico piccolo) sfruttando anche un’analisi SDS-page: ottengo bande fluorescenti ad intensità crescente
5- Calcolo la Kops cioè la costante di primo ordine che rappresenta la velocità e la comparo alla concentrazione di enzima-SNAP
Un esempio di proteina con meccanismo suicida che posso monitorare con un saggio in discontinuo?
SsOGT: un’alchil transferasi che lega il DNA rotto.
Se aggiungo ai campioni DNA metilato questo interferisce con la marcatura (+ DNA → – fluorescenza).
Ottengo quindi le curve a concentrazioni crescenti di DNA e posso rapportare la diminuzione di affinità con la concentrazione di DNA. Posso ottenere una retta che intercetta l’asse X in corrispondenza della costante di dissociazione (Kd).
Dato che il DNA lavora come inibitore, la Kd può anche essere considerata come Ki
Cosa permette di ottenere la cristallografia a raggi X
si ottengono dettagli atomici sulla posizione di una molecola nel sito di legame
Qual è la lunghezza d’onda dei raggi X e cosa mi permette di vedere?
0,1nm (1A)
Posso usarla per vedere legami covalenti (1-2A) o legami H (2,5-3A)
Che cos’è un cristallo?
è un’entità fisica con disposizione ordinata e periodica all’interno di un reticolo cristallino
Definizione di unità asimmetrica
La più piccola parte del cristallo che si ripete. Si può riconoscere un’origine
Cosa dice la legge di Bragg?
n lambda = 2d * sin(teta)
Questa legge definisce che in caso di interferenza costruttiva, la distanza percorsa dal raggio incidente è un multiplo della lunghezza d’onda
Che cos’è l’immagine di diffrazione?
è la somma dei raggi x diffratti dai piani che intersecano gli atomi della molecola nel reticolo
Cosa definisce la serie di Fourier?
ciascun riflesso corrisponde ad un’onda descritta da un’equazione Fhkl che è la sommatoria dei fattori di struttura dei singoli atomi.
L’equazione Fhkl descrive la posizione nello spazio del singolo atomo
Come posso risolvere il problema della fase?
Con la cristallografia non posso calcolare la fase, cioè l’angolo che l’onda disegna con il piano.
Per risolverlo posso fare:
- molecular replacement: sfrutto la struttura già risolta si una proteina simile
- inserisco il cristallo in mezzo ad atomi pesanti (Se) e produco la proteina in un terreno di selenio-metionina. Posso usare il Se per calcolare la fase
Come funziona il molecular replacement?
1- Indicizzo la raccolta dati
2- Carico i fattori di struttura e automaticamente il sistema prende il gruppo spaziale e le unità di cellula.
3- Bisogna poi inserire il peso molecolare o la sequenza o il pdb di un modello.
4- Dati questi valori, il sistema mi dice quante unità mi devo aspettare (coefficiente di Matthews), cioè quanto solvente ho nella soluzione.
Per avere una buona lettura serve una percentuale di solvente maggiore del 40%.
Se ottengo due diverse percentuali di solvente ma entrambe accettabili vuol dire che ci può essere un monomero o un dimero: il sistema dovrà roto-translare il sistema per cercare la struttura.
Il risultato del sistema sono amminoacidi inseriti con diverse sicurezze.
Perchè un cristallo è simmetrico?
Perchè l’unità di cellula può rototranslare rispetto ad assi di rotazione puri. Questi movimenti non è detto che siano quelli che la proteina fisiologica fa
Definizione di unità di cella
Il più piccolo gruppo di particelle che costituisce il pattern ripetuto del cristallo
Definizione di indexing
calcolo dell’unità asimmetrica e dell’unità di cella da parte di un software
Quali condizioni specifiche devo avere perchè la proteina possa cristallizzare?
- alta purezza
- alte concentrazioni di proteina
- proteina stabile
- no contaminanti
- temperatura costante
- nessuna vibrazione dei macchinari
Come posso far cristallizzare una proteina?
Per ottenere cristalli bisogna
1- Ottenere la proteina: la produco con DNA ricombinante
2- Rimuovo il solvente per ottenere uno standard cristallografico di purezza (99%): posso farlo evaporare con metodo sitting drop o hanging drop. I cristalli di sale sono sul fondo, i cristalli di proteina su diversi piani focali, fragili e blu sotto UV
3- Controllo con SDS page
Come è fatta una proteina intrinsecamente disordinata
Presenta zone altamente flessibili che non possono essere cristallizzate e un livello di disordine da 0 a 7 con profondità varia.
Hanno amminoacidi polari e flassibili
Come posso riconoscere una proteina intrinsecamente disordinata?
- elettroforesi: tanti aa disordinati causano meno incorporazione di SDS
- proteasi: sono ipersensibili alle proteasi
- analisi idrodinamica: hanno raggio di strokes maggiore quindi migrano meno
- alphafold
Qual è un ruolo delle proteine intrinsecamente disordinate?
Possono legare l’mRNA o il DNA e localizzarlo in zone specifiche
Quali sono gli output della SAXS?
- dimensioni di una particella
- forma (allungata, circolare…)
- grado di dispersione (omogeneità delle particelle nel campione)
- morfologia (es: globulare con zone disordinate
Quali sono le condizioni perchè la SAXS funzioni e restituisca risultati corretti?
il campione deve essere monodisperso e bisogna sempre sottrarre la curva di scattering del solvente
Qual è il meccanismo di funzionamento della SAXS?
le particelle interagiscono tra loro e posso ottenere la nube elettronica usando la trasformata di Fourier e la distribuzione di cariche
Che calcoli posso fare a partire dai risultati della saxs?
- pair distance distribution: creo una curva gaussiana la cui base è il diametro massimo e che posso usare per fare model building (disegno)
- calcolo del raggio di girazione: uso l’approssimazione di guinier per linearizzare la curva di scattering
- Kratky plot: ottengo un grafico che mi dà un’idea della morfologia della molecola in termini di folding (disegno)
- ab-inition structure determination: modelling senza bias a partire dalla densità elettronica
Come è fatto il Monolit?
ha una cassetta con 14 microcapillari con concentrazione fissa di proteina e variabile di analita.
C’è poi un laser che causa un aumento della temperatura
Processo per la microscale thermophoresis
1- proteina nel solvente senza analita
2- accendo il laser, le molecole si disperdono e la fluorescenza crolla visto che si allontanano dal rilevatore
3- aggiungo l’analita
4- riaccendo il laser e misuro la diminuzione di fluorescenza (visto che i complessi hanno meno mobilità)
Cosa posso valutare con la microscale thermophoresis?
posso misurare interazioni proteina-proteina o proteina-DNA e calcolare la Kd (dato che ho una variazione nell’ambiente dopo il binding)
Che cos’è la termoforesi?
è il movimento delle molecole in un gradiente di temperatura.
è direttamente collegata a massa, carica e conformazione della molecola
Quali sono gli svantaggi della microscale thermophoresis?
Il campione non deve contenere gruppi amminici perchè altrimenti ci si potrebbe attaccare il tag
Cosa misuro con la isothermal titration calorimetry?
misuro il calore rilasciato o assorbito quando due molecole interagiscono
Processo della isothermal titration calorimetry?
1- inserisco la proteina A in una camera di reazione
2- inserisco nella siringa una concentrazione saturante di proteina B
3- aggiungo progressivamente la proteina A alla proteina B
4- misuro la variazione di T nella reference cell (grafico a iperbole)
Che misure ottengo della isothermal titration calorimetry?
Kd
entalpia
entropia
stechiometria di reazione
