Optimering av renings- och separationsprocesser

Question 1

Vad är Km och Kcat kopplat till?

Answer 1

KM = hur starkt enzymet binder substratet (inneboende hos enzymet)

kcat = hur många substratmolekyler en enstaka enzymmolekyl kan omsätta per tidsenhet (inneboende hos enzymet)

Question 2

Vad är Kd och Ka?

Answer 2

Kd = Disassociationskonstanten, hur ett komplex disassocierar

Ka = Associationskonstanten, hur ett komplex binder in (uppbyggt av hastighetskonstanterna för kon och koff).

Lägre koff = längre livstid.

Question 3

Vad är retentionsfaktorn k’?

Answer 3

Fördröjningen av en komponent, ges av (Ve-V0)/V0

Question 4

Vad är displacement kromatografi? Fördelar och nackdelar?

Answer 4

Separation där provmolekylerna konkurrerar med varandra om samma bindningsställen och bufferten har mycket liten inverkan.

Fördelar:
-Hög laddningskapacitet
- Teoretiskt hög upplösning (sprids inte med tiden)
- Koncentration i zoner är konstant och beror på displacer koncentrationen
- Absolutmängd reflekteras i zon volymen/längden/elueringstiden
- Bra för slutgiltig separation av mycket lika komponenter

Nackdelar:
- Har ej perfekt konkurrens, annorlunda än annan kromatografi
- Bindningsisotermer kan korsa varandra
- För höga koncentrationer är möjligt och kan leda till utfällning för vissa komponenter

Question 5

Displacer separation kan illustreras i en graf, med operating line. Vad är detta för något?

Answer 5

En linje som visar vilka koncentrationer av komponenterna som kommer ut.

Går från origo till koncentrationen av displacern och lutning motsvarar B/F (om alla komponenter migrerar lika snabbt)

Question 6

Vilka faser kan användas vid kiral separation och vad är de bra för?

Answer 6

Kiral matris (polysackarider eller polyestrar/amider) - många möjliga bindningsställen.

Kirala substituenter (syntetiska, makrocykliska, aptamerer, proteinbaserade). Desto färre men specifika bindningsställen, desto bättre passat för analys och inte kvanitet. “Mycket jobb för ett bindningsställe”

Question 7

Vad är skillnaden mellan linjär och icke-linjär kromatografi?

Answer 7

Linjär = alla bindningsställen är lika tillgängliga för alla molekyler.

Icke-linjär = bindningställena kan inte antas vara lika tillgängliga för alla. Detta då vi har/kan tillsätta stora mängder prov

Question 8

Vad är diffusion och vad är hastigheten proportionellt mot? Hur verkar diffusion på olika avstånd?

Answer 8

Diffusion är stokastisk transport av partiklar med Brownsk rörelse som drivkraft.

Hastigheten för transporten är proportionell mot koncentrationsgradienten (större skillnad –> större hastighet) och omvänt proportionell mot patikelstorleken (större partikel –> långsammare)

Desto mindre avstånd, desto större inverkan.

Question 9

Vad spelar diffusion för roll i kromatografi (lateral, horisontell)?

Answer 9

Desto mer fördelninssteg, desto bättre upplösning. Fördelningsstegen sker horisontellt (in/ut gelkula) –> vill ha mycket horisontell diffusion. Mindre partiklar kan dock diffundera lateralt också, dvs. stokastiskt röra sig med/mot flödet –> vill minska detta eftersom det stör kromatografin och ger försämrade resultat (bredare topp).

Question 10

Vad är diffusionskoefficienten D?

Answer 10

D ger ett värde av hur snabbt det går för en molekyl i ett visst media, kopplat till molekylära egenskaper. Ges av D = RT/(6Npiviskositeten*Rd).

Question 11

Uppskalning av kromatografi kan göras med vätskekromatografi, utfällning etc., men inte elektrofores eller gaskromatogarfi - varför?

Answer 11

Eletrofores baseras på spänning och större gel kräver större spänning. Detta leder till värmeutveckling i gelen som gör den ojämnt fördelad –> dålig upplösning.

Gaskromatografi är byggt för små mängder analyt.

Question 12

Vilka olika körprinciper finns det när det kommer till kromatografi?

Answer 12

Isokratisk (fixt tillstånd, diskret tvåfasfördelning)

Gradient (ändra kompositionen kontinuerligt)

Stegvis (ändra kompositionen i diskreta steg)

Displaccement (provmolekyler konkurrerar med varandra)

Question 13

Upplösningen av en körning beror på två parametrar i resultatet - vilka då?

Answer 13

Toppavståndet (beror på molekylen) och toppbredden (beror på utrustningen)

Question 14

Vad är teoretiska bottnar och höjden av dem?

Answer 14

Teoretiska bottnar, N = Ett formellt prestandamått på kolumneffektiviteten och hur bra upplösning man får och motsvarar hur många diskreta tvåfasfördelningar det skulle krävas för att få den observerade upplösningen.

Höjden av en teoretisk botten ges av H = L/N och normaliserar körningar och olika kolonner - längden spelar roll.

Question 15

Hur är upplösningen relaterad till N och H(L)?

Answer 15

Upplösningen R är proportionerligt mot roten ur N och via H också roten ur L. Alltså krävs det en identisk men 4 ggr längre kolonn för att uppnå dubbelt så bra upplösning

Question 16

Höjden av en teoretisk botten ges av H = A/u + Bu + C där u är flödeshastigheten. Vad innebär de tre parametrarna och hur stor inverkan har de för små och stora molekyler?

Answer 16

A = Kopplat till lateral diffusion, vilkens inverkan ökar med minskat u. Beror av molekylen och matrisens diffusionstal samt elueringsvolym.

B = Kopplat till horisontell diffusion/fördelning, vilkens negativa inverkan ökar med ökat u (blir alltså bättre med minskat u). Beror av matrisens diffusionstal, kulstorlek och elueringsvolym.

C = Konstant term kopplad till kolumnpackningen - desto mindre kulor desto mindre statistisk skillnad mellan hur en molekyl kan fördela sig/vilken väg. Beror av kulstorleken.

Små molekyler löper risk för för mycket diffusion –> A stor och föredrar då ökat u.
Stora molekyler löper risk för för lite (horisontell) diffusion –> vill ha minskat u.

Question 17

Vad är konceptet touching bands?

Answer 17

Används vid icke-linjär kromatografi och fungerar som ett mått på gränsen för avvägning mellan ekonomi och upplösning. Desto mer som skickas in, desto mer ut snabbare men sämre upplösning. När topparna är så nära att man inte kan urskilja de från varandra (touching bands) så går en gräns, då kan man inte längre separera dem.

Question 18

Vad är återvinningskromatografi? Fördelar/nackdelar?

Answer 18

Pumpa igenom prov flera gånger genom samma kolonn, tillslut rent nog. Del av prov kan tas bort innan de kommer tillbaka för att få ut saker snabbare (obs samma mängd tillslut) - peak shaving = ta bort rent nog varje omgång.

Fördelar: Bra och billigt om väl inkört.
Nackdelar:
- Kan ej hantera komplexa prov med för stor skillnad i fördröjning (kommer ikapp)
- Fungerar bara för ett fåtal komponenter

Question 19

Vad är fluidized bed? Fördelar/nackdelar?

Answer 19

Håller den stationära fasen stilla men inte hårt packad genom balans mellan friktion och gravitation mha en optimal flödeshastighet.

Fördelar: Mindre känslig för orenheter.
Nackdelar: Svårt att åstadkomma praktiskt.

Question 20

Vad är moving bed? Fördelar/nackdelar?

Answer 20

Absorberande fas som rör sig mot den mobila fasen, vilket möjliggör att renat kan samlas upp uppströms och nedströms.

Fördelar: Starkt bindande komponenter kommer ut mycket snabbare (uppströms)
Nackdel: Svårt att åstadkomma praktiskt (dock gjorts med MEKC)

Question 21

Hur beräknas den relativa inbindningen alfa?

Answer 21

alfa = B/(B+F)

Question 22

Vad är satsvis adsorption? Fördelar/nackdelar?

Answer 22

Låta saker binda in i lösning och inte i kolonn, vilket motsvarar 1 teoretisk botten men större kapacitet. Efter inbindning så renas komponenter ut mha filter och tillslut konkurrerande substrat.

Fördelar:
- Enkel, uppskalbar
- Snabb
- Mindre känsligt för orenheter
- Stor provvolym om stark bindning

Nackdelar:
- Kräver stark bindning
- Andra komponenter konkurrerar om kapaciteten

Question 23

Vad går vattenbaserade tvåfassystem ut på?

Answer 23

Att dela upp komponenter utifrån en mer finkänslig skala av löslighet inom vattens område. Utnyttjar att polymerer/salter löser sig olika bra i vatten - skapar två olika faser av vatten:polymer/salt lösningar som liknande komponenter kan separeras mellan.

Question 24

Vad driver uppdelningen mellan två polymerer i vattenbaserade tvåfassystem?

Answer 24

Desto längre kedja, desto fler interaktioner per mol. Denna entalpi minskning kompenserar ökningen i entropi av att vara helt blandat med vatten och den andra polymeren - entropin ser bara mol medan entalpi ser interaktioner per mol –> mer uppdelat med längre kedjor.

Polymerer interagerar gärna med sin egen sort då dessa har samma sammansättning och således liknande egenskaper (ex. hydrofobicitet)

Question 25

Vid nog höga koncentrationer av polymerer i ett vattenbaserat tvåfassytem så uppstår just dessa två faser. Vad kallas denna gräns grafiskt?

Answer 25

Binodial

Question 26

Vad motsvarar tie-lines? Om ett system hamnar på en tie-line men vi har mer polymer B än polymer A, vad får vi då?

Answer 26

Olika koncentrationskombinationer i de två faserna (noderna) - vardera tie-line leder till ett par av noder på binodialen.

Har man mer B så kommer den fas med högre halt B finnas i större volym än den fas med högre halt A.

Question 27

[Tvåfassystem] Vad är fördelningskoefficiten K?

Answer 27

K = Cu/Cl - dvs. koncentrationsförhållandet mellan de två faserna

Question 28

[Tvåfassystem] Hur kan pH beroende fördelning uppnås?

Answer 28

Om man har salt med i systemet så kommer detta att föredra ena fasen mer än den andra och därigenom uppstår en elektrisk potential. När man separerar främst proteiner så påverkas deras laddning och således föredragen fas av pH.

Question 29

Redogör för hur Counter Current Distribution fungerar.

Answer 29

CCD utgörs av upprepade fördelningssteg och mellan dessa tillåts lösningen separera till de fördelningar som fås av ex. fördelningskoefficienten. I varje steg kommer överfasen och underfasen gå till nya olika kärl. För en förklarande bild, se s. 49 i anteckningarna.

Question 30

Hur är mängdratio och koncentrationsratio kopplat?

Answer 30

K = Cu/Cl
G = nu/nl

G = K * Vu/Vl

Question 31

[Tvåfassystem] Hur uppnås bästa möjliga upplösning?

Answer 31

Om komponenterna blir symmetriskt fördelade mellan faserna map mängd (ex. 2 vs 1/2 eller 4 vs 1/4)

Question 32

[Tvåfassystem] Hur kan man utveckla orignalet map polymererna?

Answer 32

Lägga till laddning (–> vätske-vätske jonbyte), specificitet, affinitet, hydrofobicitet i form av grupper

Question 33

[Tvåfassystem] För att optimera reningen av en komponent, vad är den huvudsakliga regeln om de ingående komponenterna förekommer i båda faserna?

Answer 33

Vi vill ha så stor skillnad i föredragen över- eller underfas mellan de olika komponenterna som möjligt –> maxa skillnaden mellan de två K!

Question 34

[Enzymreaktorer] Om man har ett enzym och två konkurrerande substrat, vad händer om man ändrar värdet på KM för ena?

Answer 34

KM anger hur bra substrat och enzym binder - minskar detta (bättre bindning) kommer ena substratet att föredras framför det andra i en större utsträckning än innan.

Question 35

[Enzymreaktorer] Det finns olika varianter av bäddar med immobiliserad biokatalyt -ge exempel på några sådana.

Answer 35

Fri biokatalyt (pumpas in med substrat –> måste renas ut)
Fri biokatalyt i tvåfas (substrat, produkt och enzym olika löslighet –> separera sen)

Immobiliserat enzym (ingen rening) via:
- yta (om nog med diffusion)
- partiklar (kontakt utan diffusion)
- monolit (homogen fas där substrat igenom mha tryck)
- membran

Question 36

[Enzymreaktorer] När man ska studera kinetik i dessa, vad bör man tänka på?

Answer 36

Vi ser inte vad som händer inuti så vi kan mäta skillnaden mellan reaktorer (m/u enzym) eller genom att köra olika flödeshastighet - snabbare gör att det som kommer ut kommit kortare in i reaktionen (eftersom enzym lika effektiva men kortare tid på sig).

(dC/dt –> dn/dt = flödeshastighet * DeltaC)