Molekylärbiologiska Metoder

Question 1

Vad är det för skillnad mellan DNA analys och DNA manipulation?

Answer 1

DNA analys:

• analyserar längd och sekvens
• ser om en sekvens är närvarande och/eller uttryckt
• om man bär på genetisk sjukdom
• mutationer i cancer

DNA manipulation
-Man klipper och klistrar genom göra om RNA—>DNA, klona in den i en cell.

Question 2

Vad är rekombinant DNA teknik?

Answer 2

Rekombinant DNA teknik är när man artificiellt kombinerar DNA från 2 celler som normalt inte sitter ihop—> DNA/RNA/protein/funktion kan modifieras

Question 3

Vad gör restriktionsenzymer?

Answer 3

Restriktionsenzymer är endonukleaser som klipper DNAt vid en viss sekvens. Det finns ett 100tal olika RE, finns naturligt i bakterier. Igenkänningssekvensen är ett 4-8 bp palindromspecifik sekvens.

RE kan antingen klyva till blunt ends—> inget överhäng
Eller till sticky/cohesive överhäng—> 3´överhäng/5´överhäng

Question 4

Vad gör ligas?

Answer 4

Ligas katalyserar ligeringen av fosfodiester ryggraden,förutsätter att DNA ändarna stöter på varandra. Det är större chans att ligera om ändarna har sticky ends än blunt ends.

Question 5

Vad är vektorer?

Answer 5

Vektorer är ”fordon”för att föra över DNA. Vanligast är att använda sig av plasmider som Veckorevyn då de har egenskaper som:

* Ligering i specifika säten (”cloning sites”)
* Selektion - antibiotika/B-galaktosidas
* Replikera i värdcell

Question 6

Vad ären polylinker?

Answer 6

En sekvens i plasmiden som innehåller restriktionsenzymers kloning site, dvs där DNAt ska ligeras in.

Question 7

Vad är PCR?

Answer 7

PCR, polymerase Chain reaction,är en metod för att amplifiera DNA från 1startsekvens. Består av 3 processer som upprepas ett antal gånger:

1. Denaturering av DNA - Temperaturen höjs snabbt och kraftigt vilket leder till att DNA strängarna smälts och separeras
2. Bindning till primers/hybridisering - Nerkylning vilket underlättar att primers (2 st oligonukleotider) binder in på varsin sträng ssDNA.
3. Elongering av primers/polymerisation - uppvärmning vilket underlättar att nya strängar DNA syntetiseras mha Taq-polymeras.

I PCR behövs:

• DNA-prov med önskad mål-sekvens
• 2 oligonukleotider (primers)
• Nukleotider
• Taq-polymeras
• buffert för att stabilisera pH samt att rätt saltkoncentration råder.

Question 8

Vad sker efter PCR?

Answer 8

• klyv och ligera in i plasmid
• kör på gel—> jämför med friskt DNA
• analys av DNA

Question 9

Vad är mutagenes?

Answer 9

Ett samlingsnamn för metoder för att framkalla någon typ av mutation på konstgjord väg

Question 10

Vilka typer av mutationer kan ske ?

Answer 10

• Punktmutation - en kvävebas byts ut mot en annan
• Deletion - en eller flera kvävebaser försvinner från sekvensen
• Insertion - en eller flera kvävebaser läggs till i sekvensen.

Question 11

Vad är kassett mutagenes?

Answer 11

Innebär att en hel DNA-sekvens (gene cassette) infogas genom att en mål-sekvens på cDNA i en plasmid först klipps bort med hjälp av restriktionsenzymer, och gen-kassetten sedan infogas. Man skapar alltså en konstgjord insertion

Question 12

Vad är Blotting?

Answer 12

En metod för att kunna hitta olika RNA/DNA-sekvenser.
1. Elektrofores
2. Överför DNA genom blotting till nitrocellulosafilter
3. Addera 52p-labeled DNA probe—> hybridisering
4. Autoradiografi —>hittar målsekvensen
Om RNA—>northern
Om DNA—> Southern

Question 13

Hur kan man manipulera gener i levande celler?

Answer 13

Vid genetiska sjukdomar kan det vara till fördel om man vill antingen stänga av sjuk gen eller ersätta den. Man kan använda sig utav antingen RNAi eller CRISPR.

RNAi

1. Skapa siRNA
2. RISC och siRNA binder och klyver mRNA
3. mRNA ej funktionellt

CRISPR

1. Introducera plasmid (guideRNA+Cas9)
2. Cas9 bryter DNA sträng. Komplementär sträng basparar

Question 14

Vad menas med cDNA?

Answer 14

cDNA är komplementärt DNA som har/ska inkorpereras in i DNAsträngen. cDNA bildas från när RNA—>DNA mha omvänt transkriptas. För att kunna inkorpereras behövs även endonukleaser och ligas.