Microscopy Flashcards

Question 1

Q

Τι είναι φως;

Answer

A

Είναι ηλεκτρομαγνητική ακτινοβολία. Κάθε ηλεκτρομαγνητικό
κύμα απαρτίζεται από ένα ηλεκτρικό (Ε) και ένα μαγνητικό (Β)
πεδίο των οποίων οι εντάσεις αυξομοιούνται ακολουθώντας
ημιτονοειδή καμπύλη σε χρόνο ή χώρο
Αυτό που περιγράφουμε ως «φως» είναι το ορατό τμήμα της
ηλεκτρομαγνητικής ακτινοβολίας με μήκη κύματος μεταξύ 400 nm
και 700 nm

Question 2

Q

Βασικές ιδιότητες του φωτός:

Μήκος κύματος ;

Answer

A

To μήκος κύματος (λ),
είναι η απόσταση που διανύει το ηλεκτρομαγνητικό κύμα σε χρόνο μιας Περιόδου
Συχνότητα (ν),
είναι ο αριθμός των κύκλων ανά δευτερόλεπτο (ν=1/λ)
Το μήκος κύματος (ή τη συχνότητα) της ακτινοβολίας το αντιλαμβανόμαστε ως χρώμα
λ
c = νλ (c = 3 X 107 m/sec)
Ε = hν (h = 6.62 X 10-27 erg . sec)
E = hc/λ

Question 3

Q

Βασικές ιδιότητες του φωτός:

Ένταση ;

Answer

A

Η ένταση του φωτός (Intensity, I) είναι ανάλογη του πλάτους
(amplitude, A) της ταλάντωσης του ηλεκτρομαγνητικού κύματος
Την ένταση της ακτινοβολίας την αντιλαμβανόμαστε ως φωτεινότητα
Ι ανάλογο Α2

Question 4

Q

Βασικές ιδιότητες του φωτός:

Πόλωση;

Answer

A

Πόλωση του φωτός.
• Μη πολωμένο φως: αποτελείται από ηλεκτρομαγνητικά κύματα των οποίων
οι φορείς ηλεκτρικού πεδίου (Ε) ταλαντώνονται σε όλες τις δυνατές γωνίες ως
προς τον άξονα διάδοσης του κύματος
• Πολωμένο φως: οι φορείς ηλεκτρικού πεδίου ταλαντώνονται σε επίπεδα
παράλληλα μεταξύ τους. Η πόλωση δεν γίνεται αντιληπτή με το μάτι
Laser: Μονοχρωματικό και πολωμένο φως

Question 5

Q

Το μάτι του ανθρώπου από τι αποτελείται ;

Answer

A

υδατοειδές υγρό , φακός, υαλώδες σώμα, μύες του ματιού , σκληρός χιτώνας , ίριδα , κερατοειδής χιτώνας , μύες του φακού

Question 6

Q

Τι κάνει ο αμφιβλιστροειδής χιτώνας στο μάτι ;

Answer

A

έχει τους φωτοϋποδοχείς ( ραβδία, κωνία)

Question 7

Q

Τι κάνει το διαφραγμα της ίριδας στο μάτι ;

Answer

A

Ρυθμίζει την ποσότητα του φωτός που

μπαίνει στο μάτι

Question 8

Q

Τι κάνει ο χοριώδης χιτώνας για το μάτι

Answer

A

Το αγγειακό στρώμα του ματιού
τροφοδοτεί με οξυγόνο και θρεπτικές
ουσίες τον Αμφιβληστροειδή

Question 9

Q

Τι κάνει ο σκληρός χιτώνας του ματιού;

Answer

A

ινώδης χιτώνας, δομική σταθερότητα,

το «ασπράδι» του ματιού

Question 10

Q

Τι κάνει το μελάχρουν επιθύλιο στο μάτι ;

Answer

A

Σκοτεινόχρωμη χρωστική μελανίνη του χοριοειδή,
βοηθά στο να περιορίζονται οι ανακλάσεις φωτός στο
εσωτερικό του ματιού και να βελτιώνεται η ποιότητα
της όρασης (εκεί ακουμπούν οι βάσεις των φωτουποδοχέων)

Question 11

Q

Πως λέγεται ο φακός του ματιού ;

Answer

A

Κρυσταλλοειδής φακός

Question 12

Q

Ποια είναι η μικρότερη διάσταση αντικειμένου μπου μπορούμε να διακρίνουμε στα 25 cm

Question 13

Q

τι διαφορά στις τάξεις μεγέθους φωτεινότητας μπορεί να διακρίνει το μάτι

Question 14

Q

Χάρη σε τι μπορεί το μάτι να βλέπει στερρεοσκοπικά;

Answer

A

Χάρις στο Οπτικό
Χίασμα παρατηρούμε
στερεοσκοπικά (έχουμε
αντίληψη του βάθους) και από
το ένα μόνο μάτι αφού οι νευρικές ίνες από κάθε μάτι
διασταυρώνονται και
καταλήγουν οι μισές στον οπτικό
φλοιό του ενός ημισφαιρίου του
εγκεφάλου και οι άλλες μισές
στον οπτικό φλοιό του άλλου
ημισφαιρίου

Question 15

Q

Ποιος φωτουποδοχέας είναι υπεύθυνος για όραση σε έντονο φως ;

Answer

A

κωνίο

Question 16

Q

Ποιος φωτουποδοχέας είναι υπεύθυνος για όρασης σε αμυδρό φως;

Answer

A

ραβδίο

Question 17

Q

Σε ποιο σημείο του αμφιβληστροειδή έχουμε ελάχιστα ραβδία και πολλά κωνία ;

Answer

A

Στο κεντρικό βοθρίο

Question 18

Q

ποιο είδος φωτουποδοχέα είναι ποιο συχνό στα περισότερα σημεία του αμφιβληστροειδούς πλην του κεντρικού βοθρίου

Answer

A

Τα ραβδία

Question 19

Q

φωτευαίσθητη χρωστική των ραβδίων ;

Answer

A

ροδοψίνη

Question 20

Q

φωτουποδοχείς με μεγαλύτερη ευαισθησία και βραδύτερη απόκριση

Answer

A

ραβδία

Question 21

Q

Τι είναι η αντίληψη της αντίθεσης ;

Answer

A

Για να γίνει αντιληπτό το αντικείμενο που παρατηρούμε πρέπει η
φωτεινότητά του να διαφέρει από αυτή του υποβάθρου (background)
και των άλλων αντικειμένων τριγύρω, δηλαδή να παρουσιάζει
αντίθεση (contrast, C)

Question 22

Q

Τι είναι το κατώφλι αντίθεσης ;

Answer

A

Για να γίνει αντιληπτό ένα
αντικείμενο σε καλές συνθήκες φωτισμού πρέπει C > 2-5% ενώ σε χαμηλό
φωτισμό πρέπει C > 200-300%

C = ΔΙ / Ιb
C: Αντίθεση
ΔΙ = Iobj- Ib
Iobj: Φωτεινότητα αντικειμένου
Ιb: Φωτεινότητα υποβάθρου (background)

Question 23

Q

Ποια είναι τα πρωταρχικά και ποια τα δευτερογενή χρώματα ;

Answer

A

μπλε, πράσινο και κόκκινο (πρωταρχικά ή κύρια χρώματα

κυανό (γαλάζιο, μπλε-πράσινο, cyan), κίτρινο και
ιώδες (μωβ, magenta)

Question 24

Q

Πώς αντιλαμβάνεται το μάτι τα πρωταρχικά χρώματα;

Answer

A

Ανάλογα με το μήκος κύματος, η ακτινοβολία απορροφάται από την
κατάλληλη φωτοευαίσθητη χρωστική στα αντίστοιχου είδους κωνία και
οδηγεί σε έκκριση νευροδιαβιβαστών, μεταφορά του σήματος στον
εγκέφαλο και μετάφραση αυτού ως μπλε, πράσινο, κόκκινο χρώμα ή
συνδυασμό χρωμάτων
S-κωνία (μπλε, 419 nm)
Μ-κωνία (πράσινο, 531 nm)
L-κωνία (κόκκινο, 559 nm)

Question 25

Q

Πώς προκύπτουν τα δευτερογενή χρώματα σύμφωνα με τον προσθετικό τρόπο ;

Answer

A

Εφαρμόζεται όταν το μάτι κοιτάζει μια πηγή φωτεινής ακτινοβολίας. Φως
ακτινοβολείται στο μάτι κατευθείαν από την πηγή. Ο τρόπος αυτός χρησιμοποιείται
από τις οθόνες τηλεοράσεων και υπολογιστών
• Η μπλε, πράσινη ή κόκκινη ακτινοβολία ακτινοβολία ενεργοποιεί τα κωνία του
ματιού (μπλε, πράσινες και κόκκινες φωτοευαίσθητες χρωστικές αντίστοιχα) και
μεταφράζεται ως χρώμα
• Αναμιγνύοντας (προσθέτοντας) διαφορετικές εντάσεις μπλε, πράσινης και κόκκινης
ακτινοβολίας ενεργοποιείται συνδυασμός χρωστικών στα κωνία και παράγονται τα
δευτερεύοντα χρώματα κυανό, κίτρινο και magenta. Όταν και τα τρία είδη κωνίων
ενεργοποιούνται εξίσου, αντιλαμβανόμαστε το χρώμα ως λευκό. Έλλειψη
ακτινοβολίας = μαύρο

Question 26

Q

Πώς προκύπτουν τα χρώματα σύμφωνα με τον αφαιρετικό τρόπο ;

Answer

A

Εφαρμόζεται όταν το μάτι κοιτάζει ένα αντικείμενο το οποίο δεν αποτελεί πηγή
φωτεινής ακτινοβολίας. Φως από μία φωτεινή πηγή προσπίπτει στο αντικείμενο
(το φωτίζει) και η ακτινοβολία που ανακλάται προσλαμβάνεται από το μάτι
• Φωτογραφίες, πίνακες, αντικείμενα στο φυσικό περιβάλλον φαίνονται έγχρωμα
διότι απορροφούν ορισμένα μήκη κύματος φωτός ενώ ανακλούν άλλα στο δέκτη
(μάτι)
• Παράδειγμα: Το μήλο φαίνεται κόκκινο διότι ανακλά την ακτινοβολία του φωτός
που αντιστοιχεί στο κόκκινο ενώ απορροφά (αφαιρεί) τις υπόλοιπες. Η
ακτινοβολία αυτή φτάνει στο μάτι, ενεργοποιεί την κόκκινη φωτοευαίσθητη
χρωστική των κωνίων και γίνεται αντιληπτή ως κόκκινο χρώμα

Question 27

Q

Σύμφωνα με την αφαιρετική μέθοδο πότε βλέπουμε ένα αντικείμενο λευκό κια πότε μαύρο ;

Answer

A

Ένα αντικείμενο φαίνεται μαύρο
όταν όλες οι ακτινοβολίες του
ορατού φάσματος του φωτός
απορροφώνται από αυτό και καμία
ακτινοβολία δε φτάνει στο μάτι

Ένα αντικείμενο φαίνεται λευκό
όταν όλες οι ακτινοβολίες του
ορατού φάσματος του φωτός
ανακλώνται και φτάνουν στο
μάτι όπου ενεργοποιούν και τα
τρία είδη φωτοευαίσθητων
χρωστικών των κωνίων

Question 28

Q

Εκτροπές ακτίνας φωτός: Τι είναι Διάθλαση;(refraction)

Answer

A

Ακτίνα φωτός η οποία προσπίπτει σε κάποιο
υλικό, αλλάζει πορεία και διέρχεται μέσα από αυτό. Η γωνία διάθλασης
εξαρτάται από το είδος του υλικού

Question 29

Q

Εκτροπές ακτίνας φωτός: Τι είναι Ανάκλαση;(reflection)

Answer

A

Ακτίνα φωτός η οποία προσπίπτει σε κάποιο
υλικό, αλλάζει πορεία αλλά δεν διέρχεται μέσα από αυτό. Η γωνία
ανάκλασης ισούται με τη γωνία πρόσπτωσης

Question 30

Q

Ποια είναι η πορεία που ακολουθεί το φως σε ένα μικροσκόπιο και γιατί μπορούμε με αυτό να βλέπουμε πράγματα μη ορατά με την απλή όραση ;

Answer

A

Στο μικροσκόπιο, φως από το
αντικείμενο (Α) περνά από τον
αντικειμενικό φακό (objective lens, 2),
τον φακό του σωλήνα του μικροσκοπίου
όταν αυτός υπάρχει (tube lens, 3),
δημιουργείται μεγεθυμένη ενδιάμεση
εικόνα (4) η οποία δεσμεύεται από τον
προσοφθάλμιο φακό (eyepiece lens, 5)
και απεικονίζεται στο μάτι (6)

Η οπτική γωνία δ1>>δ2 στον αμφιβληστροειδή, συνεπώς
«αθέατες» λεπτομέρειες του
παρασκευάσματος κατά την
παρατήρηση με γυμνό μάτι (περίπτωση
Β) γίνονται ορατές με χρήση
μικροσκοπίου (περίπτωση Α)

Question 31

Q

Πως είναι κάθε φακός του μικροσκοπίου και πως ονομάζονται τα είδη τους ανάλογα με το σχήμα ;

Answer

A

Κάθε «φακός» μικροσκοπίου είναι σύνθετος και παχύς και φτιάχνεται
από συγκόλληση πολλών διαφορετικών φακών

Αμφίκυρτος

Επιπεδόκυρτος

Κοιλόκυρτος
θετικός
μηνίσκος

Αμφίκοιλος

Επιπεδόκοιλος

Κοιλόκυρτος
αρνητικός
μηνίσκος

Question 32

Q

Ποιες είναι οι αρχές της γεωμετρικής οπτικής απλού,

λεπτού και αμφίκυρτου φακού ;

Answer

A

Λεπτός αμφίκυρτος φακός, οπτικό κέντρο (κέντρο του φακού), οπτικός άξονας
• Διάθλαση ακτίνων φωτός. Εστιακό κέντρο (Focal point, F), εμπρός και πίσω
• Εστιακό μήκος, f (απόσταση του F από τον φακό) Το εμπρόσθιο εστιακό
μήκος = οπίσθιο εστιακό μήκος όταν ο φακός είναι αμφίκυρτος
• Απόσταση αντικειμένου-φακού (α) και απόσταση ειδώλου-φακού (b)

Question 33

Q

Ποιές είναι οι αρχές διάδοσης ακτινών στους

λεπτούς αμφίκυρτους φακούς;

Answer

A

(a) Ακτίνα που περνά από το
οπτικό κέντρο δεν διαθλάται
(b) Ακτίνα που προσπίπτει παράλληλα με
τον οπτικό άξονα διαθλάται και περνά από
το πίσω εστιακό κέντρο
(c) Ακτίνα που διέρχεται από το εμπρός
εστιακό κέντρο διαθλάται παράλληλα με
τον οπτικό άξονα
(d) Το επίπεδο του ειδώλου (εικόνας)
καθορίζεται από την τομή δύο από των
τριών παραπάνω ακτινών

Question 34

Q

Ποιες μαθηματικές σχέσεις συνδέουν την εικόνα και το αντικείμενο όσο αφορά τη μεγέθυνση αυτού ;(αμφικυρτος φακός)

Answer

A

Μ: Μεγέθυνση (magnification)
M = b/α
1/f = 1/α + 1/b
M = f/(α-f)
Η Μεγέθυνση εξαρτάται από τη
θέση του αντικειμένου στον οπτικό
άξονα!!!

Question 35

Q

Παραδείγματα σχέσεων αντικειμένου-

εικόνας : M>1

Answer

A

Κλασσικός
αντικειμενικός φακός
Real magnified image
2f>α>f

Question 36

Q

Παραδείγματα σχέσεων αντικειμένου-

εικόνας : M<1

Answer

A

Real demagnified image

α>2f

Question 37

Q

Παραδείγματα σχέσεων αντικειμένου-

εικόνας : [M]>1

Answer

A

Κλασσικός προσοφθάλμιος
φακός
Virtual magnified image
α

Question 38

Q

Αντικειμενικός φακός ICS (Image distance ∞) : τι σχέση έχει το a με το f ;

Question 39

Q

Ποια είναι η συστοιχεία φακών ενός συνηθισμένου μικροσκοπίου ;

Answer

A

• Το αντικείμενο σε απόσταση 2f>α>f και η ενδιάμεση εικόνα

σε α’

Question 40

Q

Πως λειτουργεί ένα Modern microscope with ICS (Infinity Colour corrected System) (infinity optics) ;

Answer

A

Στα σύγχρονα μικροσκόπια υπάρχει ένας φακός στο σωλήνα (tube lens) ο οποίος δρα μαζί με
τον αντικειμενικό φακό: οι ακτίνες φωτός μετά τον αντικειμενικό φακό τρέχουν παράλληλα
(αντικείμενο σε απόσταση α = f) έως να διαθλαστούν από τον tube lens
• Θεωρητικά ο σωλήνας του μικροσκοπίου μπορεί να έχει μήκος «άπειρο». Στην πράξη 160-200
mm, μετά η εικόνα σκοτεινιάζει και γίνεται θολή
• Ο αντικειμενικός μαζί με τον tube lens παράγουν την πλήρως διορθωμένη από οπτικά
σφάλματα ενδιάμεση εικόνα. Αυτό επιτρέπει την προσθήκη επιπλέον οπτικών τμημάτων
(όπως φίλτρα φθορισμού) χωρίς να απαιτείται διόρθωση των οπτικών σφαλμάτων που τα
τμήματα αυτά επιφέρουν από τον προσοφθάλμιο φακό
• Τα κλασικά μικροσκόπια με “finite optics” απαιτούν πολλές διορθώσεις οπτικών σφαλμάτων
της εικόνας από τον προσοφθάλμιο φακό

Question 41

Q

Ποια είναι τα είδη οπτικών σφαλμάτων και πως διορθώνονται ;

Answer

A

• Οι απλοί φακοί έχουν σφαιρικές επιφάνειες οι οποίες συσχετίζονται με
οπτικά σφάλματα: διαταραχές της εικόνας (aberrations) και
παραμορφώσεις (distortions)
• Επιδιόρθωση των σφαλμάτων γίνεται πρωταρχικά από τον
αντικειμενικό φακό, o οποίος είναι σύνθετος και αποτελείται από
επιμέρους φακούς
• Τα υπόλοιπα οπτικά σφάλματα μετά το πέρασμα της φωτεινής δέσμης
από τον αντικειμενικό φακό διορθώνονται από τον tube lens
• Στα οπτικά σφάλματα περιλαμβάνονται σφαιρικές διαταραχές,
χρωματικές διαταραχές και παραμόρφωση του οπτικού πεδίου

Question 42

Q

Διαταραχές εικόνας: Σφαιρικές

διαταραχές τι είναι ;

Answer

A

• Οι σφαιρικές επιφάνειες των φακών (η μόνη πρακτική
προσέγγιση για τον κατασκευαστή) έχουν ως
αποτέλεσμα παράλληλες ακτίνες οι οποίες προσπίπτουν
στο κέντρο ή την περιφέρεια του φακού να εστιάζονται σε
ελαφρώς διαφορετικά σημεία του οπτικού άξονα
• Αποτέλεσμα των σφαιρικών διαταραχών είναι κάθε
φωτεινό σημείο να περιβάλλεται από φωτεινό στεφάνι ή
σειρά φωτεινών δακτυλίων και η εικόνα να φαίνεται θολή

Question 43

Q

Διαταραχές εικόνας: Χρωματικές

διαταραχές ;

Answer

A

• Ο φακός διαθλά τις ακτίνες φωτός με διαφορετικό
τρόπο ανάλογα με το μήκος κύματός τους. Το μπλε
φως διαθλάται στο εσωτερικό του οπτικού άξονα σε
σχέση με το ερυθρό φως, ενώ το πράσινο διαθλάται
σε ενδιάμεσο σημείο του οπτικού άξονα
• Αποτέλεσμα των χρωματικών διαταραχών είναι
κάθε φωτεινό σημείο να περιβάλλεται από στεφάνι
χρωμάτων, το χρώμα αυτού να μεταβάλλεται
ανάλογα με το σημείο εστίασης του αντικειμενικού
φακού και η εικόνα να φαίνεται θολή

Question 44

Q

Τι είναι η Παραμόρφωση του οπτικού

πεδίου ;

Answer

A

• Είναι σφάλμα κατά το οποίο το αντικείμενο δεν απεικονίζεται σε
επίπεδη (flat-field) αλλά σφαιρική επιφάνεια
• Δεν μπορούμε να εστιάσουμε σε όλη την εικόνα αλλά μόνο σε τμήμα
αυτής

Question 45

Q

Αναφέρετε δύο από τα κυριότερα κριτήρια ποιότητας ενός

αντικειμενικού φακού .

Answer

A

Διόρθωση σφαιρικών και χρωματικών
διαταραχών (aberration correction)
Επιπεδότητα της ενδιάμεσης εικόνας (διόρθωση
της παραμόρφωσης πεδίου, flat-field correction)

Question 46

Q

Ποια είναι τα είδη αντικειμενικών φακών ;

Answer

A

Achromats
Achroplans
Plan-Neofluar
Plan-Apochromat

Question 47

Q

Ποια είναι τα χαρακτηριστικά των Achromats φακών ;

Answer

A

Kαλή διόρθωση χρωματικών σφαλμάτων για κόκκινο (656 nm) και μπλε
(486 nm) μήκη κύματος. Διόρθωση σφαιρικών διαταραχών για το
πράσινο-κίτρινο (540 nm). Καλή επιπεδότητα στο κέντρο της εικόνας,
απαιτείται επανεστίαση για την περιφέρεια της εικόνας. Οικονομικότεροι
όλων των άλλων

Question 48

Q

Ποια είναι τα χαρακτηριστικά των Achroplans φακών ;

Answer

A

Βελτιωμένοι Αchromat με καλή επιπεδότητα εικόνας σε όλο το εύρος του
πεδίου. Χρησιμοποιούνται σε μικροσκοπία αντίθεσης φάσεως (phase
contrast microscopy, Achroplan-Ph)

Question 49

Q

Ποια είναι τα χαρακτηριστικά των Plan-Neofluar φακών ;

Answer

A

Εξαιρετική διόρθωση χρωματικών σφαλμάτων για κόκκινο, πράσινο και
μπλε χρώμα. Εξαιρετική επιπεδότητα εικόνας για όλο το οπτικό πεδίο.
Διαπερατοί από υπεριώδη ακτινοβολία (UV, 365 nm) γεγονός σημαντικό
για πειράματα φθορισμού. Μπορούν να χρησιμοποιηθούν σε ποικίλες
μεθόδους μικροσκοπίας όπως φθορισμού, Differential Interference
Contrast (DIC), time-lapse microscopy, κ.ά.

Question 50

Q

Ποια είναι τα χαρακτηριστικά των Plan-Apochromat φακών ;

Answer

A

Εξαιρετικοί και πολύ ακριβοί φακοί. Εξαιρετική διόρθωση χρωματικών
σφαλμάτων για κόκκινο, πράσινο, μπλε και βαθύ μπλε χρώμα. Τέλεια
επιπεδότητα εικόνας. Με αυτούς επιτυγχάνεται η καλύτερη δυνατή
διακριτική ικανότητα. Χρησιμοποιούνται σε συνεστιακή μικροσκοπία
(confocal microscopy) και όλες τις σύγχρονες εξειδικευμένες εφαρμογές
όπως Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM), Fluorescence
Recovery After Photobleaching (FRAP), Total Internal Reflection
Fluorescence (TIRF), κ.ά.

Question 51

Q

Ποια πλεονεκτήματα έχουν οι Plan-Apochromat σε σχέση με τους Achroplan αντικειμενικούς φακούς ;

Answer

A

Οι Plan-Apochromat φακοί περιέχουν 12 ή περισσότερα στοιχεία φακών
ώστε να επιτύχουν την καλύτερη δυνατή διόρθωση χρωματικών
σφαλμάτων σε όλο το φάσμα του ορατού φωτός και τέλεια επιπεδότητα
εικόνας. Οι Achroplan φακοί αποτελούνται από λιγότερα τμήματα

Question 52

Q

Πως ορίζεται η μεγέθυνση του μικροσκοπείου ;

Answer

A

Μεγέθυνση από τον αντικειμενικό φακό
x
Μεγέθυνση από τον προσοφθάλμιο φακό

Προσοχή: Μεγαλύτερη μεγέθυνση δεν σημαίνει απαραίτητα καλύτερη
παρατήρηση των λεπτομερειών του παρασκευάσματος!!

Question 53

Q

Τι είναι διακριτικό όριο;

Answer

A

Είναι η ελάχιστη απόσταση στην οποία δύο σημεία μπορούν να
γίνουν αντιληπτά ως ξεχωριστά
Θεωρητικά η απόσταση αυτή τείνει στο μηδέν. Στην πράξη, λόγω του
φαινόμενου της περίθλασης (diffraction) κάθε φωτεινό σημείο
απεικονίζεται ως κηλίδα φωτός (δίσκος περίθλασης Airy) η οποία
περιβάλλεται από ομόκεντρα δαχτυλίδια περίθλασης

Question 54

Q

Από τι εξαρτάται το Διακριτικό όριο του μικροσκοπίου

Answer

A

Στην πράξη το διακριτικό όριο (d) ισούται με τη διάμετρο του δίσκου
Airy
Δεν υπάρχει φακός που να μπορεί να διορθώσει το φαινόμενο της
περίθλασης
Το διακριτικό όριο του αντικειμενικού φακού, d (και κατά συνέπεια του
μικροσκοπίου), εξαρτάται από το μήκος κύματος της φωτεινής
ακτινοβολίας (λ) και το αριθμητικό άνοιγμα του φακού (Numerical
Aperture, NA)
d = 1.22 λ/2NA
Μεγαλύτερο ΝΑ = μικρότερο d,
άρα καλύτερη παρατήρηση
μικρότερων λεπτομερειών του
αντικειμένου!!

Question 55

Q

Τι είναι το Αριθμητικό άνοιγμα του φακού;

Answer

A

Είναι ένα νούμερο που χαρακτηρίζει τη μέγιστη γωνία με την οποία ο
αντικειμενικός φακός μπορεί να δεχτεί φως από το
παρασκεύασμα

ΝΑ = n sinθ

Και n είναι ο δείκτης διάθλασης του μέσου
μέσα στο οποίο ευρίσκεται ο φακός
Όπου θ είναι η γωνία που σχηματίζει
η οριακή ακτίνα με τον οπτικό άξονα

Question 56

Q

Τι είναι ο δείκτης διάθλασης ;

Answer

A

Ο δείκτης διάθλασης n είναι ένα μέτρο του
πόσο ελαττώνεται η ταχύτητα του φωτός κατά
τη διέλευση αυτού από ένα μέσο. Για
παράδειγμα:
Για κενό (ή αέρα) n = 1.00 (ξηροί, dry
objectives)
Για νερό n = 1.33 (υδατοκαταδυτικοί, water
objectives)
Για καλυπτρίδα n = 1.52 (ελαιοκαταδυτικοί, oil
objectives)
Θεωρητικά θmax θεωρητικό = 90ο, συνεπώς ΝΑmax θεωρητικό= n
Στην πράξη θmax πραγματικό ~ 70ο, συνεπώς ΝΑmax πραγματικό < n

Question 57

Q

Το αριθμητικό άνοιγμα ή η

μεγέθυνση καθορίζουν το διακριτικό όριο;

Answer

A

Αντικειμενικός φακός με μεγαλύτερο NA
συγκεντρώνει περισσότερο φως από το
παρασκεύασμα και διακρίνει μικρότερες
λεπτομέρειες

Question 58

Q

Ένας αντικειμενικός φακός 40Χ με ΝΑ = 0.65 τι
προσοφθάλμιο φακό χρειάζεται ώστε να αξιοποιήσουμε
πλήρως τις δυνατότητές του;

Answer

A

Εμπειρικός κανόνας: Για να εκμεταλλευτούμε το ΝΑ του φακού απαιτείται
μεγέθυνση μικροσκοπίου 1000 Χ ΝΑ (μέγιστη ωφέλιμη μεγέθυνση)
Πάνω από τη μέγιστη ωφέλιμη μεγέθυνση η εικόνα μεγαλώνει αλλά δεν
διακρίνουμε περισσότερες λεπτομέρειες του αντικειμένου

Απαιτείται μέγιστη ωφέλιμη μεγέθυνση περίπου 1000 Χ 0.65 = 650
Μεγέθυνση μικροσκοπίου = Μεγέθυνση αντικειμενικού Χ Μεγέθυνση προσοφθάλμιου
Δηλαδή:
650 = 40 Χ Μεγέθυνση προσοφθάλμιου,
άρα χρειάζεται προσοφθάλμιος περίπου 16Χ

Question 59

Q

Τι πρέπει να γνωρίζουμε για την απόσταση εργασίας αντικειμενικών φακών ;

Answer

A

• Γενικά η απόσταση εργασίας μειώνεται καθώς η μεγέθυνση και το αριθμητικό άνοιγμα
αυξάνονται
• Μεγαλύτερες αποστάσεις εργασίας απαιτούνται όταν παρατηρούμε παρασκευάσματα μέσα
από χοντρά τοιχώματα (π.χ. στη χημεία ή μεταλλουργία)
• Οι καταδυτικοί φακοί απαιτούν μικρότερες αποστάσεις εργασίας από τους ξηρούς φακούς
ώστε να υπάρχει ένα ομοιόμορφο υγρό μέσο μεταξύ παρασκευάσματος και φακού αλλά
δύνανται να επιτύχουν καλύτερο διακριτικό όριο

Question 60

Q

Ποια είναι τα βασικά εξαρτήματα του μικροσκοπίου που εξυπηρετούν τον φωτισμό ;

Answer

A

Condenser lens, Condenser diaphragm and

screws, Lamp switch, field stop diaphragm

Question 61

Q

Ποιοι παράγοντες παίζουν ρόλο στον βέλτιστο φωτισμό ενός δείγματος ;

Answer

A

• Ομοιογενής φωτισμός του δείγματος
• Μεγαλύτερη μεγέθυνση = μεγαλύτερο
εύρος πεδίου και απαιτείται εντονότερος
φωτισμός
• «Επιπλέον» φως εκτός οπτικού πεδίου
μειώνει τη ικανότητα παρατήρησης λόγω
εσωτερικών ανακλάσεων
• Απαιτείται ισορροπία μεταξύ ικανής
έντασης φωτός (intensity) και βέλτιστης
αντίθεσης εικόνας (contrast)

Question 62

Q

Από τι ρυθμίζεται ο φωτισμός σε ένα οπτικό μικροσκόπιο;

Answer

A

Ο φωτισμός του δέιγματος στο οπτικό μικροσκόπιο ρυθμίζεται από τον
πυκνωτή (condenser) και το διάφραγμα πεδίου (field stop diaphragm)

Question 63

Q

Πως ο φωτισμός Köhler πετυχαίνει το βέλτιστο φωτισμό ;

Answer

A

Με τον φωτισμό Köhler πετυχαίνουμε να έχουμε τόσο φως
ώστε να μην προκαλεί εσωτερικές ανακλάσεις που μειώνουν
την αντίθεση και ταυτόχρονα ιδανική τοποθέτηση του
πυκνωτή ώστε με την ρύθμιση του διαφράγματος του να
επιτυγχάνουμε ιδανική σχέση αντίθεσης – διακριτικής
ικανότητας

Question 64

Q

Περιγράψτε τα 5 στάδια επίτευξης φωτισμού Köhler .

Answer

A

1) Αρχική εικόνα χωρίς φωτισμό Köhler
Εστιάζουμε στο παρασκεύασμα
2)Κλείνουμε το διάφραγμα πεδίου αρκετά ώστε να
σκοτεινιάσει το πεδίο αλλά να εξακολουθούμε να
βλέπουμε το παρασκεύασμα
Κινούμε τον πυκνωτή πάνω-κάτω ώστε να δούμε
καθαρή εικόνα
3)Χρησιμοποιώντας τις βίδες
προσανατολισμού του πυκνωτή
φέρνουμε την εικόνα του διαφράγματος
στο κέντρο της εικόνας
4)Ανοίγουμε το διάφραγμα πεδίου όσο
απαιτείται ώστε να βλέπουμε ολόκληρο το
οπτικό πεδίο
5)Ρυθμίζουμε το διάφραγμα του
πυκνωτή ώστε να επιτύχουμε
μέγιστη αντίθεση

Answer 62

A

Επιτρέπει την παρατήρηση δειγμάτων ζωντανών κυττάρων τα

οποία μεγαλώνουν στον πυθμένα του δοχείου (flask, petri dish, etc)

Answer 63

A

Αντικειμενικός φακός
Αντικειμενικός και προσοφθάλμιος φακός
Αντικειμενικός και ενδιάμεσος ή προσοφθάλμιος
φακός
Διάφραγμα φωτεινού πεδίου
Διάφραγμα πυκνωτή

Answer 64

A

Διακριτικό όριο (d)
Ωφέλιμη μεγέθυνση
Επιδιόρθωση οπτικών σφαλμάτων
Φωτεινότητα εικόνας (Ι)
Αντίθεση εικόνας (C)

Answer 65

A

Για να παρατηρήσουμε βιολογικά
δείγματα (ζωντανά ή μονιμοποιημένα)
πρέπει να δημιουργήσουμε κατάλληλες
συνθήκες αντίθεσης (contrast)
Ανάλογα με την τεχνική αντίθεσης που
επιλέγεται, συχνά απαιτείται σήμανση
(χρώση) συστατικών του κυττάρου

Answer 66

A

Μικροσκοπία φωτεινού πεδίου (Brightfield microscopy)
Μικροσκοπία σκοτεινού πεδίου (Darkfield)
Μικροσκοπία αντίθεσης φάσεως (Phase Contrast)
Μικροσκοπία πολωμένου φωτός (Polarization Contrast)
Differential Interference Contrast (DIC)
Μικροσκοπία φθορισμού (Fluorescence Contrast)

Answer 67

A

Δέσμη φωτός πέφτει στο
παρασκεύασμα, διέρχεται από αυτό και
μέσω της οπτικής οδού του
μικροσκοπίου η εικόνα φτάνει στο
όργανο παρατήρησης (μάτι, camera)

Answer 68

A

Η μικροσκοπία φωτεινού πεδίου απαιτεί απλά (μη
εξειδικευμένα) μικροσκόπια και χρήστες
• Εύκολη και φτηνή
• Εφαρμόζεται ευρέως για την παρατήρηση ιστολογικών
δειγμάτων (π.χ. βιοψίες)

•Τα βιολογικά δείγματα απορροφούν ελάχιστο φως
• Σε φωτεινό υπόβαθρο το μάτι αντιλαμβάνεται διαφορές
στην ένταση του φωτός μεγαλύτερες του 10%
• Η διαφορά στην ένταση του διερχόμενου φωτός μεταξύ
παρασκευάσματος και υποβάθρου είναι μικρή, συνεπώς η αντίθεση είναι μικρή και το παρασκεύασμα δυσδιάκριτο
Για παρατήρηση βιολογικών δειγμάτων σε
συνθήκες φωτεινού πεδίου απαιτείται χρώση αυτών
• Με τη χρώση, οπτικά χαρακτηριστικά του δείγματος
τα οποία είναι αόρατα για το μάτι μεταφράζονται σε
ορατές διαφορές έντασης του φωτός

Answer 69

A

Παρασκευή ιστολογικών δειγμάτων

2. Χρώση ιστολογικών δειγμάτων

Answer 70

A

1.Μονιμοποίηση
Σταματά την αυτόλυση του ιστού
Διαφυλάσσει τη δομική σταθερότητα των κυττάρων
Κατάλληλα μονιμοποιητικά υλικά είναι αλδεΰδες (φορμαλδεΰδη,
γλουταραλδεΰδη), άλατα του υδραργύρου, κ.ά.
2. Αφυδάτωση
Σταδιακή αφυδάτωση του ιστού με τη βοήθεια διαλυμάτων αιθανόλης
3. Διαύγαση
Ανταλλάσσεται το μέσο αφυδάτωσης με διαλύτη συμβατό με το μέσο
έγκλεισης, για παράδειγμα ξυλόλη
4. Έγκλειση
Ο ιστός περιβάλλεται με υλικό που του δίνει δομική σταθερότητα ώστε
να κόβεται με ακρίβεια σε λεπτές τομές. Για τομές μέχρι 0.5 μm
χρησιμοποιείται παραφίνη
5. Μικροτομή
Κόψιμο δειγμάτων και συλλογή τομών με τη βοήθεια μικροτόμου και
κατάλληλου μαχαιριού από ατσάλι
6. Διάλυση του μέσου έγκλεισης και ενυδάτωση
7. Χρώση ώστε να γίνουν ορατά τα στοιχεία του ιστού
8. Κάλυψη με καλυπτρίδα και παρατήρηση στο οπτικό μικροσκόπιο

Answer 71

A

Ο μικροτόμος χρησιμοποιείται για την παραγωγή λεπτών τομών
παραφίνης. Υπάρχουν πολλοί τύποι μικροτόμου με πιο σύγχρονο
τον περιστροφικό

Answer 72

A

Μονιμοποίηση με διάλυμα φορμαλδεΰδης (2% – 4%)
Σταδιακή αφυδάτωση με διαλύματα 50%, 70%, 90% και 100% αιθανόλης
Διαύγαση με ξυλόλη
Έγκλειση σε λιωμένη παραφίνη σε ειδικά καψίδια (κασέτες) στους 55 – 65 οC για
να εμποτιστεί ο ιστός με παραφίνη
Στερεοποίηση σε θερμοκρασία δωματίου και μικροτομή
Χρήση τομών για ιστοχημικές ή ανοσοϊστοχημικές χρώσεις

Answer 73

A

Φρέσκα (όχι μονιμοποιημένα) δείγματα καλύπτονται με ειδικό
υδατοδιαλυτό υλικό κάλυψης και παγώνονται με εμβάπτιση σε
ισοπεντάνιο στους -40 οC με χρήση ξηρού πάγου ή υγρού αζώτου
Τα δείγματα κόβονται σε θερμοκρασία -10 οC έως -30 οC και
συλλέγονται σε αντικειμενοφόρους πλάκες για ιστολογική ή
ανοσο-ιστοχημική ανάλυση
Στις κρυοτομές η δομή του ιστού δεν διατηρείται τόσο καλά όσο σε
αυτές της παραφίνης, είναι όμως ευκολότερες και ταχύτερες στην
παρασκευή (π.χ. ταχείες βιοψίες)

Answer 74

A

Ο κρυοστατικός
μικροτόμος είναι
τοποθετημένος σε ένα
καταψύκτη ώστε να
διατηρούνται χαμηλές
θερμοκρασίες κατά το
κόψιμο του δείγματος

Answer 75

A

Είναι η παρατήρηση της μορφολογίας κυττάρων ή ιστών στο οπτικό
μικροσκόπιο μετά από χρήση χρωστικών (χρώση δειγμάτων με χρωστικές)

Answer 76

A

Η χρώση Αιματοξυλίνης-Ιωσίνης (Haematoxylin-Eosin) είναι από τις πιο
διαδεδομένες στην Ιστολογία. Χρησιμοποιείται για γενική εκτίμηση της
εικόνας του ιστού
Η Αιματοξυλίνη προσδένεται σε
νουκλεϊκά οξέα και χρωματίζει
μπλε περιοχές όπως ο
πυρήνας και τα ριβοσώματα
Η Ιωσίνη προσδένεται σε
πρωτεΐνες και χρωματίζει ροζ
το κυτταρόπλασμα και έντονα
κόκκινα τα ερυθροκύτταρα

Answer 77

A

Είναι ο εντοπισμός συγκεκριμένων πρωτεϊνικών αντιγόνων σε δείγματα
κυττάρων ή ιστών με χρήση κατάλληλων αντισωμάτων συνδεδεμένων
με χρωμοφόρες ουσίες (χρώση με αντισώματα συνδεδεμένα σε
χρωμοφόρες ουσίες, π.χ. υπεροξειδάση)

Η μέθοδος εξαρτάται από την ειδικότητα του αντισώματος

Answer 78

A

Χρησιμοποιείται ευρέως για τη διάγνωση και ταυτοποίηση νεοπλασιών
Έκφραση συγκεκριμένων πρωτεϊνών χαρακτηρίζει την ύπαρξη νεοπλασιών ή
και το είδος της νεοπλασίας. Τέτοια πρωτεϊνικά αντιγόνα (καρκινικοί δείκτες)
δύνανται να ανιχνευθούν με ανοσοϊστοχημεία σε ιστολογικά δείγματα
ασθενών
Παραδείγματα καρκινικών δεικτών:
• Carcinoembryonic antigen (CEA): Ταυτοποίηση αδενοκαρκινωμάτων
οποιασδήποτε προέλευσης
• CD117 (KIT): Καρκίνος του συνδετικού ιστού του γαστρικού συστήματος και
του λεπτού εντέρου

Answer 79

A

Είναι διαμεμβρανική γλυκοπρωτεΐνη η οποία συμμετέχει στην κυτταρική
πρόσδεση (cell adhesion). Εκφράζεται κατά την εμβρυική ανάπτυξη και η
παραγωγή της σταματά πριν τη γέννηση
Υπερέκφραση του CEA εμφανίζεται σε
νεοπλασίες του γαστρικού συστήματος, του
παχέος εντέρου, των πνευμόνων, του
ήπατος και του στήθους
Δείγματα με υψηλά επίπεδα CEA
εντοπίζονται με ανοσοϊστοχημεία με χρήση
ειδικών μονοκλωνικών αντισωμάτων

Answer 80

A

Είναι διαμεμβρανικός υποδοχέας της κυτοκίνης SCF (stem cell factor). Έχει
ενεργότητα κινάσης Τυροσίνης και συμμετέχει στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό
Υπερέκφραση της πρωτεΐνης KIT εμφανίζεται σε ποσοστό 85-90% καρκίνων του
συνδετικού ιστού του γαστρικού συστήματος και του λεπτού εντέρου
(gastrointestinal stromal tumour, GIST)

Answer 81

A

Η φωτεινή δέσμη περνά από τη διάταξη του πυκνωτή, ο κώνος φωτός πέφτει στο
αντικείμενο παρατήρησης και όλες οι ακτίνες της φωτεινής δέσμης (διαθλώμενες και μη)
δεσμεύονται από τον αντικειμενικό φακό για τη δημιουργία ειδώλου Δέσμη φωτός διέρχεται
μέσω της οπτικής οδού του
μικροσκοπίου η εικόνα φτάνει στο
όργανο παρατήρησης (μάτι, camera)

Answer 82

A

• Η μικροσκοπία φωτεινού πεδίου χρησιμοποιείται ευρέως για
παρατήρηση ιστολογικών τομών (π.χ. βιοψίες)
• Για δημιουργία αντίθεσης και παρατήρηση, απαιτείται μονιμοποίηση
και χρώση των βιολογικών δειγμάτων (Ιστοχημική ή ανοσο-ιστοχημική)

Answer 83

A

Στην πράξη δεν μπορούμε πάντα να έχουμε βαμμένα
βιολογικά δείγματα ώστε να τα παρατηρούμε με
μικροσκοπία φωτεινού πεδίου:
• H χρώση συνήθως απαιτεί μονιμοποίηση του δείγματος
συνεπώς δεν είναι δυνατή η παρατήρηση ζωντανών
κυττάρων

Answer 84

A

1. Σε φωτεινό υπόβαθρο το μάτι χρειάζεται
διαφορές στην ένταση του φωτός
τουλάχιστον 10-20% ώστε να μπορέσει να
διακρίνει τα αντικείμενα
2. Σε σκοτεινό υπόβαθρο και με πλάγιο
φωτισμό οι λεπτομέρειες των αντικειμένων
φαίνονται καθαρότερα

Answer 85

A

Ακτίνα φωτός η οποία προσπίπτει σε
κάποιο υλικό, αλλάζει πορεία και διέρχεται
μέσα από αυτό.
Η γωνία διάθλασης εξαρτάται από το είδος
του υλικού (δείκτης διάθλασης, n).
n = c/ u
c = η σχετική ταχύτητα του κύματος στο κενό και
u = η ταχύτητα του κύματος στο υλικό
Το γυαλί έχει n = 1.5, δηλαδή το φως ταξιδεύει στο γυαλί με
ταχύτητα 1/ 1.5 = 0.66 την ταχύτητα του φωτός στο κενό
Εάν ni < nr, τότε θi > θr

Answer 86

A

Η μικροσκοπία σκοτεινού πεδίου αξιοποιεί το
φαινόμενο της διάθλασης του φωτός το οποίο
διέρχεται από το παρασκεύασμα για τη
δημιουργία αντίθεσης

Answer 87

A

• Δημιουργία σκοτεινού υποβάθρου με χρήση κυκλικού διαφράγματος στον πυκνωτή
• Ο φακός του πυκνωτή φωτίζει το αντικείμενο με «κούφιο» κώνο φωτός
• Μετά την πρόσπτωση στο αντικείμενο, το φως που δεν έχει εκτραπεί (διαθλαστεί) από το
αντικείμενο περνά έξω από τον αντικειμενικό φακό
• Μόνο φως από διάθλαση (φως που έχει εκτραπεί, πλάγιο) δεσμεύεται από τον αντικειμενικό
φακό για τη δημιουργία ειδώλου και το αντικείμενο γίνεται ορατό σε σκοτεινό (μαύρο) φόντο

Answer 88

A

Τα σύγχρονα μικροσκόπια σκοτεινού πεδίου χρησιμοποιούν μεταβλητό διάφραγμα ίριδας ώστε
να αποκλείουν τη διέλευση του φωτός το οποίο δεν έχει εκτραπεί από το αντικείμενο. Ολόκληρος
ο κώνος φωτός δεσμεύεται από τον αντικειμενικό φακό αλλά μόνο το φως από διάθλαση
χρησιμοποιείται για τη δημιουργία ειδώλου
• Τέτοια μικροσκόπια σκοτεινού πεδίου επιτρέπουν τη χρήση αντικειμενικών φακών με μεγάλο
αριθμητικό άνοιγμα

Answer 89

A

• Επιτρέπει την ανίχνευση μικρών δομικών λεπτομερειών του
παρασκευάσματος χωρίς να χρειάζεται μονιμοποίηση και χρώση αυτού
• Μικρά δείγματα όπως λυσοσώματα, μαστίγια βακτηρίων, διάτομα είναι
ευκρινώς ορατά με μικροσκοπία σκοτεινού πεδίου
• Εύκολη και φτηνή σε σχέση με άλλα είδη μικροσκοπίας τα οποία
απαιτούν εξειδικευμένους αντικειμενικούς φακούς (π.χ. αντίθεσης φάσεως
και DIC)

Answer 90

A

• Κατά την παρατήρηση με darkfield, τα μεγαλύτερα αντικείμενα εκτρέπουν
το φως πιο έντονα από ό,τι τα μικρότερα και έτσι οι λεπτομέρειες των
τελευταίων «σκεπάζονται»
• Το περίγραμμα των αντικειμένων δεν είναι σαφές
• Στις μέρες μας η μικροσκοπία σκοτεινού πεδίου έχει περιορισμένες
εφαρμογές και δεν χρησιμοποιείται ευρέως στην Κυτταρική Βιολογία
(συνήθως παρατηρούμε τα μη μονιμοποιημένα παρασκευάσματα με phase
contrast ή DIC)

Answer 91

A

• Δύο κύματα με ίδια συχνότητα έχουν διαφορά φάσης αν παρουσιάζουν
διαφορετικό πλάτος την ίδια χρονική στιγμή
Συχνότητα = ο αριθμός επαναλήψεων στη μονάδα του χρόνου
Πλάτος κύματος = η μέγιστη σε ύψος μετατόπιση ενός σημείου, από το σημείο
ισορροπίας του κατά τη διέλευση του κύματος
• Το κύμα β έχει διαφορά φάσης λ/4 από το κύμα α (Το κύμα β καθυστερεί από το
κύμα α κατά λ/4)

Answer 92

A

Όταν το φως διέρχεται από μη βαμμένα βιολογικά παρασκευάσματα (π.χ κύτταρα)
επέρχεται απορρόφηση μέρους αυτού αλλά και αλλαγή της φάσης (επιβράδυνση)
του φωτεινού κύματος
Όσο πιο παχύ είναι το διαφανές αντικείμενο ή όσο μεγαλύτερος ο δείκτης
διάθλασης αυτού, τόσο μεγαλύτερη είναι η επιβράδυνση του φωτεινού κύματος

Answer 93

A

•Τα κύτταρα έχουν πάχος 5-10 μm πάνω από τον πυρήνα και μόλις 1 μm πάνω από το
κυτταρόπλασμα. Συνεπώς ο πυρήνας απορροφά και επιβραδύνει το διερχόμενο φως
διαφορετικά από ό,τι το κυτταρόπλασμα
• Η απορρόφηση ορατού φωτός (μείωση του πλάτους της ταλάντωσης) δεν είναι από μόνη
της αρκετή ώστε να παρατηρήσουμε τα κύτταρα με ευκολία
• Επιπλέον, επέρχεται αλλαγή της φάσης (επιβράδυνση) του διερχόμενου φωτός. Το μάτι δεν
αντιλαμβάνεται τη διαφορά φάσης αλλά η μικροσκοπία αντίθεσης φάσεως μετατρέπει τις
διαφορές φάσης σε διαφορές έντασης του φωτός οι οποίες γίνονται ορατές από το μάτι
• Ταυτόχρονα, το φως που αλληλεπιδρά με το παρασκεύασμα διαθλάται

Answer 94

A

• Τόσο το διαθλώμενο όσο και το μη
διαθλώμενο από το παρασκεύασμα φως
δεσμεύονται από τον αντικειμενικό φακό
• Το μη διαθλώμενο φως περνά από
ημιδιαφανές phase ring όπου και
επιβραδύνεται ενώ ταυτόχρονα
απορροφάται περίπου 70% της έντασής
του
• Το φως από διάθλαση δεν περνά από το
phase ring, συνεπώς δεν επιβραδύνεται
περεταίρω ούτε μειώνεται περισσότερο η
έντασή του

Answer 95

A

• Κατά τη διέλευση από το phase ring, το κύμα υποβάθρου μειώνεται σε ένταση και
τροποποιείται η φάση αυτού ώστε να είναι σύγχρονο με το κύμα από το αντικείμενο
• Η διαφορά στο πλάτος ταλάντωσης (Α) μεταξύ τελικού (σύνθετου) κύματος, το οποίο
προκύπτει από τη συμβολή (σύνθεση) διαθλώμενου και μη διαθλώμενου φωτός, και υποβάθρου
είναι μεγαλύτερη με χρήση phase ring από ό,τι χωρίς αυτό
• Η διαφορά στην ένταση (I) μεταξύ τελικού (σύνθετου) κύματος και υποβάθρου είναι μεγαλύτερη
με χρήση phase ring από ό,τι χωρίς αυτό
• Καλύτερη αντίθεση (C) και παρατήρηση αντικειμένου με phase ring

Answer 96

A

2a. Με phase ring
Δ=0
Κύτταρα φωτεινότερα
από το υπόβαθρο

2b. Με phase ring
Δ= 180 μοίρες
Κύτταρα πιο σκοτεινά
από το υπόβαθρο

Answer 97

A

• Χρησιμοποιείται για παρατήρηση ζωντανών κυττάρων διεσπαρμένων σε
λεπτό υπόστρωμα
• Πολύ μεγαλύτερη ευκρίνεια από τη μικροσκοπία darkfield

Answer 98

A

• Αν και πολύ καλής ποιότητας, η εικόνα με phase contrast δεν είναι τέλεια
• Διαταραχές εικόνας (phase artifacts):
Στεφάνι (phase halos). Οφείλεται στο ότι στην πράξη, περίπου 25% των
διαθλώμενων ακτινών περνά από το phase ring
Για αντικείμενα φωτεινότερα του υποβάθρου το στεφάνι είναι σκούρο ενώ για
αντικείμενα σκοτεινότερα του υποβάθρου το στεφάνι είναι φωτεινό

Answer 99

A

Η διάταξη που παράγει πολωμένο φως ονομάζεται
πολωτής (polarizer), αποτελείται από διαφανείς κρυστάλλους ανθρακικού
ασβεστίου (CaCO3) και χρησιμοποιείται στη μικροσκοπία πολωμένου φωτός

Answer 100

A

Ο αναλυτής (analyzer) είναι φίλτρο το οποίο επιτρέπει τη διέλευση
κυμάτων πολωμένου φωτός τα οποία ταλαντώνονται κατά το
επίπεδο που αυτός ορίζει και απορροφά αυτά τα οποία
ταλαντώνονται σε διαφορετικά επίπεδα

Answer 101

A

Οι κρύσταλλοι είναι στερεά υλικά των οποίων τα δομικά στοιχεία
(άτομα, μόρια ή ιόντα) διατάσσονται με κανονικά επαναλαμβανόμενο
τρόπο (συμμετρικά) και στις τρεις διαστάσεις. Ασύμμετρα υλικά =
άμορφα
Όταν πολωμένο φως διέρχεται από κρυστάλλους ή υλικά με συμμετρία
των συστατικών τους μορίων η διεύθυνση ταλάντωσης (το επίπεδο
πόλωσης) αυτού αλλάζει

Answer 102

A

Αρχή της μεθόδου. Πολωμένο φως (μέσω του
πολωτή) χρησιμοποιείται για φωτισμό του
παρασκευάσματος
Μόνο όταν η διεύθυνση ταλάντωσης του
πολωμένου φωτός αλλάξει (μετά από διάθλαση σε
παρασκεύασμα με εσωτερική συμμετρία) μπορεί
φως να περάσει από τον αναλυτή
Το δείγμα φαίνεται φωτεινό και το υπόβαθρο μαύρο

Answer 103

A

• Χρησιμοποιείται για παρατήρηση κρυστάλλων και πολυμερών
• Τα βιολογικά παρασκευάσματα περιέχουν πολυμερή ασύμμετρων βιομορίων
(ινίδια ακτίνης, κυτταρίνη, κ.ά)
• Μπορεί να χρησιμοποιηθεί για μελέτη δομών σε ζωντανά κύτταρα όπως:
Ινιδίων κυτταρίνης στο κυτταρικό τοίχωμα φυτικών κυττάρων και ιικών
καψιδίων

Answer 104

A

Παρατήρηση ζωντανών και μη βαμμένων κυττάρων
• Εξαιρετική ευκρίνεια και καθαρότητα εικόνας απαλλαγμένη από οπτικά
σφάλματα όπως “στεφάνια” (halos)
• Απαιτεί διαφανή δείγματα συνεπώς δεν μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τομές
ιστών
• Χρησιμοποιείται για βιολογικά δείγματα και όχι για παρατήρηση κρυστάλλων
ή βιοπολυμερών τα οποία δύνανται να τροποποιήσουν τα επίπεδα πόλωσης
των γειτονικών ακτίνων φωτός

Answer 105

A

Για το φωτισμό του δείγματος χρησιμοποιείται
πολωμένο φως.
Το φως περνά από ένα διπλοθλαστικό πρίσμα του
πυκνωτή και χωρίζεται σε δυο ακτίνες που μεταδίδονται
παράλληλα με πολύ μικρό διαχωρισμό (συνήθως 0.2 μm)
και επίπεδα πόλωσης 0 και 90 μοίρες.
Οι ακτίνες αυτές περνούν από γειτονικά σημεία του
δείγματος. Εάν τα σημεία αυτά έχουν διαφορετικό πάχος
ή δείκτη διάθλασης τότε αλλάζει η φάση τους (το πιο
οπτικά πυκνό υλικό επιβραδύνει περισσότερο την ακτίνα
φωτός.
Τα ζεύγη ακτίνων έχουν τώρα πληροφορία από ζεύγη
γειτονικών σημείων με τη μορφή διαφορών φάσης
(αόρατες στο μάτι). Τα διαφορετικά επίπεδα πόλωσης
εμποδίζουν τη συμβολή (σύνθεση) των δύο κυμάτων τη
στιγμή αυτή.
Το φως περνά από τον αντικειμενικό φακό και διέρχεται
από ένα δεύτερο πρίσμα με αποτέλεσμα οι δύο ακτίνες
φωτός να ενώνονται σε μία με επίπεδο πόλωσης 135μοίρες.
Αυτό οδηγεί σε συμβολή (σύνθεση) των κυμάτων,
μείωση ή αύξηση του πλάτους ταλάντωσης του σύνθετου
κύματος στο σημείο εκείνο ανάλογα με τη φάση των επί
μέρους κυμάτων και συνεπώς σε σκοτεινότερη ή
φωτεινότερη εικόνα.
Η σύνθεση είναι όχι μεταξύ δύο ακτίνων που περνούν
από το ίδιο σημείο (μικροσκοπία αντίθεσης φάσης) αλλά
μεταξύ ακτίνων που περνούν από γειτονικά σημεία.
Τέλος το φως περνά από αναλυτή πόλωσης ώστε να
αποκλείονται οι μη διαθλασμένες ακτίνες και να έχουμε
καλή αντίθεση (μαύρο φόντο)

Answer 106

A

• Εντοπισμός μακρομορίων (πρωτεΐνες, μεταβολίτες, κ.ά.) στο κύτταρο
• Παρατήρηση δομών όπως μεμβράνες, κυτταροσκελετός, χρωματίνη,
λυσοσσώματα, κ.ά.
• Μελέτη της κίνησης μακρομορίων, κυστιδίων και κυττάρων
• Μελέτη κυτταρικών λειτουργιών όπως απόπτωση, κυτταρική διαίρεση,
ενδοκύτωση, εξωκύτωση, κυτταρική διήθηση, μετάσταση, κ.ά.

Answer 107

A

» Wide-field fluorescence microscopy (Μικροσκοπία
φθορισμού ευρέως πεδίου)
»Confocal laser scanning microscopy, CLSM
(Συνεστιακή Μικροσκοπία)
» 2-photon

Answer 108

A

» FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching)
και Photoactivation
Τεχνικές Μικροσκοπίας Φθορισμού
• Μελέτη πολύ δυναμικών διαδικασιών (διάχυση και κίνηση μακρομορίων)
» FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)
» FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging)
• Μελέτη αλληλεπιδράσεων πρωτεϊνών
» TIRF (Total Internal Reflection Fluorescence)
• Μελέτη δομών του κυτταροσκελετού με μεγάλη ευαισθησία

Answer 109

A

Μακρομόρια του κυττάρου (πρωτεΐνες,
DNA) σημαίνονται με ειδικές φθορίζουσες
χρωστικές και παρατηρούνται ως
διαφορετικά χρώματα στο μικροσκόπιο
φθορισμού
Ανάλογα με το είδος του μικροσκόπιου
φθορισμού, μπορούμε να
παρατηρήσουμε ταυτόχρονα 1, 2 ή 3
φθορίζουσες χρωστικές (χρώματα)!!

Answer 110

A

• Άτομα ή μόρια διεγείρονται από ακτινοβολία κατάλληλου μήκους κύματος,
δηλαδή απορροφούν ενέργεια με αποτέλεσμα ηλεκτρόνια αυτών να
μετακινούνται παροδικά σε υψηλότερη ενεργειακή στοιβάδα. Κατά την
επαναφορά των ηλεκτρονίων αυτών στη βασική στοιβάδα εκπέμπεται
ακτινοβολία (φθορισμού) μεγαλύτερου μήκους κύματος (μικρότερης ενέργειας,
Ε = hc/λ). Ο χρόνος μεταξύ απορρόφησης και εκπομπής κατά το φθορισμό
είναι 10-9-10-12 seconds

Answer 111

A

• Μόρια τα οποία μπορούν να φθορίζουν ονομάζονται φθορίζοντα μόρια/ ουσίες/ χρωστικές
(fluorescent molecules, fluorochromes, fluorescent dyes)
• Κάθε φθορίζουσα ουσία έχει χαρακτηριστικά φάσματα απορρόφησης/ εκπομπής
ακτινοβολίας τα οποία εξαρτώνται από τη δομή των ατόμων και των ηλεκτρονίων αυτής
• Παρατηρείται διαφορά μεταξύ των μέγιστων μηκών κύματος απορρόφησης και εκπομπής
(Stokes shift)

Answer 112

A

Ακτινοβολία συγκεκριμένου μήκους
κύματος δύναται να απορροφηθεί
από περισσότερες από μία
φθορίζουσες ουσίες και να τις
διεγείρει
Συχνά υπάρχει επικάλυψη μεταξύ
φασμάτων εκπομπής διαφορετικών
φθοριζόντων ουσιών
Όταν χρησιμοποιούμε περισσότερες
από μία φθορίζουσες χρωστικές για
να σημάνουμε μακρομόρια,
προσπαθούμε να επιλέξουμε
συνδυασμούς χρωστικών που έχουν
όσο περισσότερο διακριτά φάσματα
εκπομπής/ απορρόφησης γίνεται

Answer 113

A

DAPI, FITC-IgG, TRITC

Answer 114

A

a) Φωτεινή πηγή (light source)
b) Exciter (excitation) filter
c) Dichroic mirror (beamsplitter)
d) Emission filter
e) Αντικειμενικός φακός υψηλής
ποιότητας και NA για μεγιστοποίηση
διακριτικού ορίου και αντίθεσης
f) Για αποτελεσματική μικροσκόπηση, η
φωτεινή πηγή και ο αντικειμενικός
φακός ευρίσκονται στην ίδια πλευρά
του παρασκευάσματος. Αυτή η διάταξη
παροχής φωτός ονομάζεται epiilluminator
(αντίθετο: transilluminator)
• Ο αντικειμενικός φακός λειτουργεί ως
πυκνωτής και διοχετεύει φως στο
παρασκεύασμα, αλλά και ως φακός
συλλέγοντας από το δείγμα τη
φθορίζουσα ακτινοβολία

Answer 115

A

• Χρησιμοποιούνται φωτεινές πηγές
μεγάλης έντασης διότι μόνο ένα στενό
φάσμα μηκών κύματος χρησιμοποιούνται
για να διεγείρουν το χρωμοφόρο
• Συνήθως χρησιμοποιούνται λάμπες
Υδραργύρου (Hg) ή Ξένου (Xe)

Answer 116

A

• Χρησιμοποιούνται για την απομόνωση ακτινοβολιών συγκεκριμένων μηκών
κύματος
• Προστασία του δείγματος από ακτινοβολία UV και υπέρυθρη από πηγή φωτισμού
• Όταν χρησιμοποιούμε περισσότερες της μιας φθορίζουσες χρωστικές μπορεί τα
φάσματα απορρόφησης και εκπομπής των χρωστικών να επικαλύπτονται με
αποτέλεσμα να πρέπει να τα διαχωρίσουμε

Answer 117

A

• Είναι ένα ειδικό long-pass φίλτρο ειδικά σχεδιασμένο ώστε να
επιτρέπει τη διέλευση ακτινοβολιών συγκεκριμένων μηκών κύματος και
να ανακλά τις υπόλοιπες
• Τοποθετείται σε γωνία 45μοίρες ως προς τον οπτικό άξονα του δείγματος
και «βλέπει» τη φωτεινή πηγή
• Ανακλά το φως διέγερσης (μικρότερου
μήκους κύματος) σε γωνία 90μοίρες και το
κατευθύνει προς το δείγμα ενώ επιτρέπει
τη διέλευση της ακτινοβολίας φθορισμού
(μεγαλύτερου μήκους κύματος) η οποία
δεσμεύεται από τον αντικειμενικό φακό
για τη δημιουργία εικόνας

Answer 118

A

• Τα φίλτρα excitation και emission δεν
αντιστοιχούν υποχρεωτικά επακριβώς
στα excitation και emission μέγιστα της
χρωστικής
• Τα όρια της διερχόμενης από τα φίλτρα
ακτινοβολίας είναι πολύ απότομα
• Ο διχροϊκός καθρέπτης ανακλά το 100%
της ακτινοβολίας η οποία διεγείρει την
FITC, διέλευση (Transmission, T) = 0%, και
επιτρέπει τη διέλευση του 80-90% της
ακτινοβολίας εκπομπής της FITC
(πράσινη)

Answer 119

A

Εντοπισμός μακρομορίων (πρωτεΐνες, DNA) στο κύτταρο
• Παρατήρηση κυτταρικών δομών όπως μεμβράνες,
κυτταροσκελετός, χρωματίνη, λυσοσσώματα, κ.ά.
• Μελέτη κυτταρικών λειτουργιών όπως απόπτωση, κυτταρική
διαίρεση, ενδοκύτωση, εξωκύτωση, κυτταρική διήθηση, κ.ά.
Κλασσικές

Answer 120

A

• Για την ανίχνευση των συστατικών του δείγματος που θέλουμε να
μελετήσουμε, μπορούν να χρησιμοποιηθούν αντισώματα έναντι αυτών
συνδεδεμένα ή σημασμένα με φθορίζοντα μόρια

Πέρα από αντισώματα - σημασμένα με φθορίζοντα μόρια, μπορούν
να χρησιμοποιηθούν και ορισμένες φθορίζουσες ουσίες οι οποίες
προσδένονται απευθείας σε συγκεκριμένα συστατικά του κυττάρου
Για παράδειγμα:
• DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole). Προσδένεται και σημαίνει το
DNA. Excitation max: 350 nm, Emission max: 470 nm (μπλε)
• PI (Propidium Iodide). Προσδένεται και σημαίνει το DNA. Excitation
max: 536 nm, Emission max: 620-670 nm (κόκκινο)
• Phalloidin. Τοξίνη η οποία προσδένεται και σημαίνει ινίδια
ακτίνης. Υπάρχουν παραλλαγές αυτής στο εμπόριο για φθορισμό
στο πράσινο ή στο κόκκινο μήκος κύματος

Answer 121

A

• Ανάλογα με τις δυνατότητες του μικροσκοπίου μας (αριθμός φίλτρων,
είδος φωτεινής πηγής) μπορούμε να ανιχνεύσουμε ταυτόχρονα ένα,
δύο ή τρία συστατικά του παρασκευάσματος, σημαίνοντας αυτά με
διαφορετικές φθορίζουσες χρωστικές οι οποίες έχουν διακριτά φάσματα
απορρόφησης και εκπομπής

Answer 122

A

Paraformaldehyde (PFA) fixation
• Fixation σε 3% PFA σε phosphate buffer saline (PBS)
• Permeabilisation σε 0.5% Triton σε PBS
• Χρώση με κατάλληλα πρωτογενή και δευτερογενή (χρωμοφόρα)
αντισώματα
Methanol fixation
• Fixation σε καθαρή (απόλυτη) Μεθανόλη
• Χρώση με κατάλληλα πρωτογενή και δευτερογενή (χρωμοφόρα)
αντισώματα

Answer 123

A

• Αποτελείται από 298 αμινοξέα (MW: 26.9 kDa) και φθορίζει πράσινη
όταν διεγερθεί από μπλε φως
• GFP «φυσικού τύπου»: Μέγιστο διέγερσης στα 395 nm και μέγιστο
εκπομπής στα 509 nm
• Δεν είναι τοξική για τα κύτταρα και μπορεί να χρησιμοποιηθεί για
παρατήρηση ζωντανών κυττάρων με μικροσκοπία φθορισμού!!
• Αποτελείται από 11 β-πτυχωτές επιφάνειες οι οποίες σχηματίζουν
δομή βαρελιού
• Το χρωμοφόρο μόριο ευρίσκεται εσωτερικά του βαρελιού και
προστατεύεται από αλλαγές του pH
• Κατά την εκπομπή φθορισμού έχουμε κυκλοποίηση και οξείδωση
των αμινοξέων Ser65-Tyr66-Gly67

Answer 124

A

Η GFP και Μεταλλαγμένα παράγωγα της GFP:
• EGFP (enhanced GFP): S56T μετάλλαξη της GFP, πιο διαρκής
φθορισμός και μέγιστο διέγερσης στα 488 nm το οποίο ταιριάζει με τα
φασματοσκοπικά χαρακτηριστικά των φίλτρων για FITC. Μέγιστο
εκπομπής 509 nm
• EBFP (enhanced Blue Fluorescent Protein),
• ECFP (enhanced Cyan Fluorescent Protein),
• EYFP (enhanced Yellow Fluorescent Protein), προέρχονται όλες από
σημειακές μεταλλάξεις της EGFP
Ds-Red (RFP): Red Fluorescent Protein, απομονώθηκε από τη θαλάσσια
ανεμώνη Discosoma coral (Διαφορετική πρωτεΐνη από την GFP)
Φθορίζουσες

Answer 125

A

Κατασκευάζουμε μια υβριδική πρωτεΐνη στην οποία η GFP έχει
κολληθεί (fused) στο Ν- ή στο C-τελικό άκρο της πρωτεΐνης που
μελετούμε

Answer 126

A

Είναι σημαντικό να ελέγξουμε ότι η υβριδική πρωτεΐνη

συμπεριφέρεται όμοια με τη πρωτεΐνη που μας ενδιαφέρει

Answer 127

A

Μπορούμε να σημάνουμε τη χρωματίνη του κυττάρου ώστε να
παρατηρούμε αλλαγές στη μορφολογία του DNA σε ζωντανά κύτταρα
με την τεχνική της βιντεομικροσκοπίας
Παράδειγμα: Κατασκευάζουμε και εκφράζουμε στα κύτταρα μια
υβριδική μορφή Ιστόνης με GFP (histone H2B:GFP)

Answer 128

A

• Inverted μικροσκόπιο φθορισμού
(για ζωντανά κύτταρα)
• Videocamera φωτογραφίζει το
ζωντανό παρασκεύασμα κάθε 1-2
min επί όσες ώρες απαιτείται
(Φθορισμός ή/ και DIC/ phase)
• Μελέτη κυτταρικών λειτουργιών
σε ζωντανά κύτταρα (όπως
κυτταρική διαίρεση, απόπτωση,
κ.ά.)
• Software μπορεί να συμπιέσει
τις φωτογραφίες σε video-
ταινία

Answer 129

A

Φθορίζοντα παρασκευάσματα με σημαντικό πάχος όπως
στρογγυλά κύτταρα ή τομές ιστών δεν απεικονίζονται καλά
με μικροσκοπία φθορισμού ευρέως πεδίου διότι φθορίζοντα
σήματα από μόρια που ευρίσκονται εκτός αλλά κοντά στο
επίπεδο εστίασης ανιχνεύονται, αυξάνουν το background
και δίνουν εικόνες με χαμηλή αντίθεση (contrast)
H συνεστιακή μικροσκοπία (confocal laser scanning
microscopy) επιλύει το πρόβλημα διότι απορρίπτει σήματα
από κοντινά αντικείμενα πάνω ή κάτω από το επίπεδο
εστίασης
Με τη συνεστιακή μικροσκοπία παρατηρούμε οπτικές
«τομές» του παρασκευάσματος!!

Answer 130

A

Αποτελείται από μικροσκόπιο φθορισμού, πολλαπλές πηγές φωτός laser, την
κεφαλή σάρωσης (scan head) με οπτικά και ηλεκτρονικά στοιχεία, ηλεκτρονικό
υπολογιστή, software και οθόνες για συλλογή, επεξεργασία και ανάλυση της
εικόνας

Answer 131

A

Το laser παρέχει τη φωτεινή δέσμη η οποία υπό τον έλεγχο ηλεκτρονικού
υπολογιστή «σαρώνει» το παρασκεύασμα. Η κεφαλή σάρωσης του confocal
κατευθύνει τα φθορίζοντα σήματα από το παρασκεύασμα στην pinhole και τον
φωτοπολλαπλασιαστή (photomultiplier, PMT). Ο ηλεκτρονικός υπολογιστής
μετατρέπει τις διαφορές έντασης φωτός σε ψηφιακή εικόνα.
Η εικόνα του confocal δεν δημιουργείται στο μικροσκόπιο και μπορούμε να τη
δούμε μόνο στην οθόνη του ηλεκτρονικού υπολογιστή.

Answer 132

A

• Διάταξη εισαγωγής φωτός laser
• Φίλτρα φθορισμού
• Μηχανισμός σάρωσης (scanning) του
παρασκευάσματος
• Διάφραγμα Pinhole
• Φωτοπολλαπλασιαστής (PMT)

Answer 133

A

• Epi-illumination
• H δέσμη laser επικεντρώνεται σε ένα σημείο
του παρασκευάσματος και σαρώνει το
επίπεδο εστίασης από δεξιά προς τα αριστερά
και από επάνω προς τα κάτω
• Η pinhole ευρίσκεται στο επίπεδο
σχηματισμού του ειδώλου. Δέχεται τα
φωτόνια φθορισμού από το σημείο του
παρασκευάσματος το οποίο σαρώνει η δέσμη
laser και αποκλείει το φθορισμό από σημεία
εκτός του επιπέδου εστίασης
• Ο PMT δέχεται συνεχή ροή φωτονίων η
οποία μετατρέπεται σε αλλαγές ηλεκτρικής
τάσεως
• Ο ηλεκτρονικός υπολογιστής μετατρέπει τις
αλλαγές τάσεως σε ψηφιακό φωτεινό σήμα
στην οθόνη

Answer 134

A

• Ο μηχανισμός περιλαμβάνει δύο
καθρέπτες στο εσωτερικό του confocal
scan head (στο σχήμα φαίνεται ο ένας) οι
οποίοι ταλαντώνονται σε διευθύνσεις
κάθετες μεταξύ τους
• Ο ένας καθρέπτης ελέγχει τη σάρωση
του παρασκευάσματος κατά τον άξονα χ
και ο άλλος κατά τον άξονα ψ
• Η ταχύτητα σάρωσης και η έκταση της
περιοχής που σαρώνεται ελέγχονται από
τον χρήστη

Answer 135

A

• Φθορίζουσα ακτινοβολία η οποία εκπέμπεται
από σημείο του παρασκευάσματος στο επίπεδο
εστίασης (σάρωσης), σχηματίζει στο διάφραγμα
της pinhole μικρό φωτεινό σημείο
• Φθορίζουσα ακτινοβολία η οποία εκπέμπεται
από σημεία του παρασκευάσματος πάνω ή κάτω
από το επίπεδο εστίασης (σάρωσης) σχηματίζει
στο διάφραγμα της pinhole φωτεινό δίσκο
• Μόνο ελάχιστο ποσοστό ακτινοβολίας από
θέσεις εκτός επιπέδου εστίασης συλλέγεται από
τον ανιχνευτή PMT, έτσι επιτυγχάνεται καλύτερη
παρατήρηση λεπτομερειών του
παρασκευάσματος από ό,τι με μικροσκοπία
φθορισμού ευρέως πεδίου

Answer 136

A

• Αφού γίνει Διαδοχική σάρωση του παρασκευάσματος σε πολλαπλά επίπεδα (οπτικές
τομές) με προκαθορισμένη απόσταση (step) μεταξύ τους κατά τον άξονα z
• Deconvolution software: Προβολή των οπτικών τομών σε ένα επίπεδο ή
τρισδιάστατη αναπαράσταση

Answer 137

A

Διακριτικό όριο
Ένταση φωτεινού σήματος
Λόγος σήματος προς θόρυβο

Answer 138

A

• Αριθμητικό άνοιγμα, μεγέθυνση και διόρθωση
σφαλμάτων από τον αντικειμενικό φακό
• Ρυθμίσεις offset και gain του PMT
• Ρυθμίσεις pinhole
• Ταχύτητα σάρωσης
• Zoom εικόνας

Answer 139

A

Οι ρυθμίσεις gain και offset (αντιστάθμιση) γίνονται ηλεκτρονικά από
τον χρήστη και βελτιώνουν το λόγο: σήμα/ θόρυβος
Το offset καθορίζει το κατώφλι ανίχνευσης φωτός από τον PMT
Το gain αυξάνει το σήμα πολλαπλασιάζοντας την τάση που βγαίνει
από τον PMT επί ένα σταθερό συντελεστή πριν αυτή μετατραπεί σε
ψηφιακό σήμα. Το gain ρυθμίζεται μετά από το offset

Answer 140

A

Μεγαλύτερη pinhole = παρατήρηση πιο
παχιάς «τομής» του παρασκευάσματος
Μεγαλύτερη pinhole = μεγαλύτερη
ένταση σήματος φθορισμού
• Μεγαλύτερη pinhole = μικρότερη
διακριτική ικανότητα λόγω πρόσληψης
φθορίζουσας ακτινοβολίας από σημεία
εκτός του επιπέδου εστίασης
• Η ρύθμιση του μεγέθους της pinhole
γίνεται ηλεκτρονικά

Answer 141

A

Μικρότερη ταχύτητα σάρωσης =
καθυστερεί η δέσμη laser περισσότερο
χρόνο σε κάθε σημείο του
παρασκευάσματος (ρύθμιση ταχύτητας
ηλεκτρονικά)
• Μικρότερη ταχύτητα σάρωσης =
μεγαλύτερη ένταση σήματος
• Μικρότερη ταχύτητα σάρωσης = πιο
γρήγορη εξασθένηση του σήματος από
τη συνεχή έκθεση του χρωμοφόρου σε
ακτίνα laser υψηλής εντάσεως
(photobleaching)

Answer 142

A

• Αυξάνοντας το ηλεκτρονικό zoom της εικόνας (ρύθμιση ηλεκτρονικά)
η δέσμη laser σαρώνει μικρότερη περιοχή του παρασκευάσματος
• Επειδή η zoomed εικόνα έχει ίδιο αριθμό pixels, η εικόνα εμφανίζεται
μεγεθυμένη στην οθόνη
• Το πόσο «ωφέλιμη» είναι η μεγέθυνση (zoom) εξαρτάται από το
αριθμητικό άνοιγμα του φακο

Answer 143

A

• Μπορούμε να δούμε με ευκρίνεια οπτικές τομές σε
παρασκευάσματα με πάχος 10-80 μm (π.χ. ιστολογικές τομές)
• Καλύτερη ευκρίνεια εικόνας ακόμα και σε λεπτά
παρασκευάσματα (π.χ. λεπτή στρώση κυττάρων)
• Παίρνοντας «στοίβα» τομών κατά τον κατακόρυφο άξονα (zstacks)
μπορούμε να επιτύχουμε προβολή των οπτικών
τομών σε ένα επίπεδο, τρισδιάστατη απεικόνιση, περιστροφή,
εγκάρσια όψη του παρασκευάσματος, κ.ά.

Answer 144

A

Παρατήρηση φθοριζόντων βιολογικών δομών
• Λεπτομερής παρατήρηση ενδοκυτταρικών δομών όπως μεμβράνες,
κυτταροσκελετός, χρωματίνη, λυσοσσώματα, κ.ά.
• Ακριβής εντοπισμός μακρομορίων στο κύτταρο
• Συνεντοπισμός μακρομορίων (π.χ. πρωτεϊνών) στο κύτταρο
• Παρατήρηση μονιμοποιημένων δειγμάτων
• Παρατήρηση ζωντανών κυττάρων με βιντεομικροσκοπία (GFP-σημασμένα
μακρομόρια)

Answer 145

A

Η ίδια ενέργεια διέγερσης Ε μπορεί να επιτευχθεί με δύο φωτόνια, κάθε
ένα από τα οποία έχει τη μισή συχνότητα (ή το διπλάσιο μήκος
κύματος) ενός φωτονίου διέγερσης, Ε = h (v/2 + v/2)

Answer 146

A

Χρησιμοποιούνται ακτινοβολίες μεγαλύτερου μήκους κύματος (στο
υπέρυθρο) και άρα μικρότερης ενέργειας από τα άλλα είδη μικροσκοπίας
φθορισμού
􀂙 H δέσμη laser πρέπει να είναι πολύ στενά εστιασμένη διότι με μια πιο
διάχυτη δέσμη η πιθανότητα το ίδιο χρωμοφόρο να δεσμεύσει δεύτερο
φωτόνιο όσον χρόνο είναι διεγερμένο από το πρώτο, είναι αμελητέα
􀂙 Διέγερση με 2 φωτόνια συμβαίνει μόνο στο επίπεδο εστίασης, άρα δεν
χρειάζεται pinhole

Answer 147

A

• Σε λεπτά δείγματα (10- 50 μm), για παράδειγμα λίγες στρώσεις
κυττάρων, η ευκρίνεια και των δύο μεθόδων είναι παρόμοια.
Όμως το photobleaching φθοριζόντων μορίων πάνω και κάτω
από το επίπεδο εστίασης είναι πολύ μικρότερο στη 2-photon
• Η υπέρυθρη ακτινοβολία διαπερνά μεγαλύτερο πάχος
παρασκευάσματος από αυτήν μεγαλύτερης συχνότητας
• Είναι λιγότερο φωτοτοξική λόγω μικρότερης ενέργειας
Η 2-photon χρησιμοποιείται για απεικόνιση παχέων ιστών
(deep tissue imaging) βάθους έως 1 mm σε ζωντανούς
οργανισμούς (in vivo imaging)

Answer 148

A

• Παρατήρηση ζωντανών εμβρύων
Έμβρυα ποντικού βάφτηκαν με μη τοξική φθορίζουσα
χρωστική η οποία δεσμεύεται στα μιτοχόνδρια και μελετήθηκαν
σε πειράματα κυτταροκαλλιέργειας
Με παρατήρηση με confocal microscopy η ανάπτυξη του
εμβρύου σταμάτησε μετά από λίγα λεπτά
Με 2-photon-microscopy τα έμβρυα επέζησαν και η ανάπτυξή
τους μελετήθηκε επί 2 περίπου ημέρες

Answer 149

A

Μετρούν την ικανότητα βιομορίων (συνήθως
πρωτεϊνών) να αλληλεπιδρούν κάτω από διάφορες
συνθήκες
FRET και FLIM

Answer 150

A

Βιοχημικές μέθοδοι (ανοσοκατακρήμνιση)
Ο συνεντοπισμός (colocalisation) δύο πρωτεϊνών είναι μια
καλή ένδειξη για αλληλεπίδραση αυτών
Μελέτη συνεντοπισμού πρωτεϊνών με συνεστιακή
μικροσκοπία:
• Σήμανση των πρωτεϊνών με φθορίζουσες χρωστικές
• Παρατήρηση

Answer 151

A

protein-A:FITC (πράσινο)
protein-B:TRITC (κόκκινο)
Οι πρωτεΐνες A και B συνεντοπίζονται
(κίτρινο) (εγγύτητα 50-100 nm)
Αυτή είναι μια καλή ένδειξη για
αλληλεπίδραση των δύο πρωτεϊνών

Answer 152

A

• Μέθοδος για περαιτέρω διερεύνηση μοριακών
αλληλεπιδράσεων φθοριζόντων μορίων (συνήθως
πρωτεϊνών)
• Ανιχνεύει εγγύτητα μορίων περίπου 1-10 nm
(Εκπέμπεται φθορισμός από μεταφορά ενέργειας
μεταξύ φθοριζόντων μορίων - FRET)

Answer 153

A

• Αρχή της μεθόδου: Ο χρήστης διεγείρει το μόριο δότη ενέργειας το
οποίο εκπέμπει φθορισμό μικρότερου μήκους κύματος (π.χ πράσινο)
και ανιχνεύει φθορισμό από το μόριο δέκτη ενέργειας, το οποίο
εκπέμπει σε μεγαλύτερο μήκος κύματος (π.χ. κόκκινο)
• Εάν τα φθορίζοντα μόρια είναι πολύ κοντά μεταξύ τους ώστε να
αλληλεπιδρούν, μέρος της ενέργειας εκπομπής του δότη απορροφάται
από το μόριο-δέκτη και προκαλεί φθορισμό του τελευταίου

Answer 154

A

Διέγερση του
δότη (FITC) αλλά ανίχνευση
εκπομπής μόνο του δέκτη (TRITC)

Αν δεν ανιχνεύεται (TRITC) φθορισμός στα 620 nm
(κόκκινο) τότε έχουμε ΝΟ FRET

Answer 155

A

Χρησιμοποιείται για τη διερεύνηση μοριακών αλληλεπιδράσεων

πρωτεϊνών (1-10 nm) σε ζωντανά ή μονιμοποιημένα κύτταρα

Answer 156

A

Κατάλληλο ζευγάρι φθοριζουσών
χρωστικών για FRET
• Επικάλυψη μεταξύ φάσματος
εκπομπής δότη (Donor) και φάσματος
απορρόφησης δέκτη (Acceptor)
• Διακριτά φάσματα εκπομπής δότη και
δέκτη

Answer 157

A

• Η ένταση του σήματος FRET εξαρτάται όχι μόνο από την αλληλεπίδραση
μεταξύ δότη και δέκτη, αλλά και τη συγκέντρωση των μορίων του δέκτη
• Εάν χρησιμοποιείται ως δέκτης φθορίζον αντίσωμα έναντι της πρωτεΐνης,
η ένταση του σήματος FRET εξαρτάται από τη συγκέντρωση του
αντισώματος και την ικανότητα αυτού να αναγνωρίζει τον αντίστοιχο
επίτοπο της πρωτεΐνης

Answer 158

A

confocal με το

κατάλληλο software

Answer 159

A

• Μετράει το χρόνο ζωής (lifetime) της
διεγερμένης κατάστασης του φθορίζοντος
μορίου δότη
• Κάθε μόριο έχει ιδιαίτερο χρόνο ζωής της
διεγερμένης κατάστασης
• Αυτός ο χρόνος μπορεί να μεταβληθεί από το
τοπικό περιβάλλον:
􀀹 Συγκεντρώσεις ιόντων
􀀹 Συγκέντρωση οξυγόνου
􀀹 pH
􀀹 Αλληλεπιδράσεις (FRET) με άλλα
φθορίζοντα μόρια

NO FRET = Δt1
FRET = Δt2 (< Δt1)

Answer 160

A

Εξακολουθεί να απαιτείται:
Κατάλληλο ζευγάρι φθοριζόντων χρωστικών για FRET
Όμως:
• Δεν επηρεάζεται η μέτρηση από τη συγκέντρωση των φθοριζόντων
μορίων του δέκτη ή την ποιότητα του αντισώματος έναντι του δέκτη

Answer 161

A

• Μετρούν την ικανότητα βιομορίων (πρωτεΐνες, λιπίδια, υδατάνθρακες)
να μετακινούνται κάτω από διάφορες συνθήκες
• Μελέτη δυναμικών κυτταρικών διεργασιών όπως μεταφορά μορίων από
μεμβράνες, αναδιοργάνωση του κυτταροσκελετού, κυτταρική κίνηση, κ.ά.
• Ζωντανά κύτταρα
• Ομοιοπολική πρόσδεση ή υβρίδια (fusion) των βιομορίων που θέλουμε
να μελετήσουμε με φθορίζοντα μόρια
• Χρησιμοποιείται point-detection/scanning μικροσκόπιο confocal

Answer 162

A

Οι φθορίζουσες χρωστικές διεγείρονται από φως κατάλληλης
συχνότητας και εκπέμπουν ακτινοβολία φθορισμού
Εάν η ακτινοβολία διέγερσης είναι μεγάλης έντασης, η
φθορίζουσα χρωστική θα «ξεβάψει» πολύ γρήγορα
(photobleaching) και δεν θα μπορεί να εκπέμψει ακτινοβολία
φθορισμού από εκεί και πέρα
Στην FRAP μετράμε πόσο γρήγορα αυτή η περιοχή με τα
«ξεβαμμένα» μόρια θα αρχίσει να φθορίζει και πάλι λόγω
κίνησης φθοριζόντων μορίων από γειτονικές περιοχές

Answer 163

A

Καθώς ο φθορισμός επανέρχεται
στη φθορίζουσα περιοχή
προσδιορίζονται δύο παράμετροι:
• Πόσος φθορισμός επανακτάται
μετά το photobleaching
(Recovery = Υ/ Χ 100%)
B. Πόσο γρήγορα γίνεται η
επανάκτηση
(κλίση της καμπύλης 3)
Όσο πιο ταχεία και πλήρης η
επανάκτηση του φθορισμού τόσο
πιο γρήγορη και ελεύθερη η
κίνηση των μορίων

Answer 164

A

• Όπως και η FRAP, μετράει την ικανότητα βιομορίων (πρωτεΐνες,
λιπίδια, υδατάνθρακες) να μετακινούνται κάτω από διάφορες συνθήκες
• Εφαρμόζεται σε ζωντανά κύτταρα
• Χρησιμοποιείται point-detection/scanning μικροσκόπιο confocal

Answer 165

A

Τα βιομόρια που μελετούμε σημαίνονται με φθορίζουσες ουσίες-
παράγωγα της GFP (photoactivated GFP, PA-GFP) τα οποία εκπέμπουν
έως 100 φορές πιο έντονα από την «απλή» GFP

Answer 166

A

Όσο πιο ταχεία και πλήρης η
μείωση του φθορισμού τόσο
πιο γρήγορη και ελεύθερη η
κίνηση των μορίων.

Answer 167

A

• Τεχνική η οποία επιτρέπει εξαιρετικά λεπτές οπτικές τομές στην
επιφάνεια επαφής των κυττάρων με το γυάλινο υπόστρωμα πάνω στο
οποίο μεγαλώνουν
• Χρησιμοποιείται κυρίως σε ζωντανά κύτταρα για μελέτη λειτουργιών
της κυτταρικής μεμβράνης, παρατήρηση της δυναμικής του
κυτταροσκελετού, μελέτη της διακίνησης πρωτεϊνών και κυστιδίων, της
κυτταρικής πρόσδεσης και κίνησης, κ.ά.
• Πρωτεΐνες προς παρατήρηση υβριδικές (fused) με παράγωγα της GFP
• H TIRF ονομάζεται έτσι διότι απαιτεί ολική ανάκλαση της ακτινοβολίας
διέγερσης

Answer 168

A

• Η ακτινοβολία διέγερσης πρέπει να πέσει στη διαχωριστική επιφάνεια
γυαλιού-υδάτινου μέσου με συγκεκριμένη γωνία ώστε να ανακλαστεί ολόκληρη
• Στην επιφάνεια αυτή δημιουργείται λεπτή ζώνη (~100 nm) παροδικής
φθορίζουσας ακτινοβολίας (evanescent wave region)
• To παροδικό ηλεκτρομαγνητικό κύμα χρησιμοποιείται για τη δημιουργία
εικόνας φθορισμού

Answer 169

A

• Επειδή η παροδική ακτινοβολία
προέρχεται από λεπτή περιοχή του
κυττάρου (~100 nm), το background είναι
πολύ μικρότερο σε σχέση π.χ. με τη
μικροσκοπία confocal (πάχος οπτικής
τομής ~500 nm) και ασθενικά φθορίζοντα
σήματα γίνονται ορατά με μεγαλύτερη
ευκρίνεια
• Επειδή η παροδική ακτινοβολία δημιουργείται στην οριακή ζώνη κυττάρου-
γυάλινου slide, είναι κατάλληλη για μελέτη της κυτταρικής μεμβράνης (πάχους ~
15 nm) και της κοντινής σε αυτήν περιοχής του κυτταροπλάσματος

Answer 170

A

• Για TIRF απαιτείται ειδικό μικροσκόπιο φθορισμού wide-field με αντικειμενικούς
φακούς μεγάλου ΝΑ και πυκνωτή με ρυθμιζόμενη γωνία πρόσπτωσης του φωτός

Brainscape's Knowledge GenomeTM

Microscopy Flashcards

Brainscape's Knowledge Genome^TM