Microscopie Flashcards
On peut voir à l’oeil nu jusqu’à :
200 microns = 0,2 mm
La limite de résolution théorique de la microscopie optique est de …
200 nm (elle est du au caractère ondulatoire de la lumière)
Principe de la MO :
Une source de lumière est concentrée sur l’échantillon via une série de lentilles (=condensateur).
Un objectif permet d’augmenter le signal et d’obtenir une image.
Les objectifs vont de …
2,5 à 100
Fixation =
On fige la structure du tissu par des agents chimiques bifonctionnels comme le glutaraldéhyde ou le formol
Rigidification =
Inclusion en résine, en paraffine
Coupe =
Au microtome
Les cellules perdent leur couleurs lors de…
La déshydratation. C’est pourquoi des colorants sont nécessaires pour les visualiser.
La fixation et la coloration entrainent …
La mort de la cellule et des réarrangements
Un colorant permet :
d’amplifier la différence de longueur d’onde produite lors de la traversée des structures cellulaires. Ils peuvent être spécifiques d’activité ou de structures cellulaires.
La microscopie à contraste de phase :
Permet d’augmenter le déphasage des ondes ondes, déphasées par les modifications de diffraction rencontrées lors de la traversée cellulaire.
Le contraste est lié aux variations des indices de réfractions dans les milieux cellulaires.
Avantages de la microscopie à contraste de phase :
Ne tue pas les cellules (car pas besoin de les fixer)
L’image est + contrastée (mais + sombre et -brillante)
En microscopie à contraste de phase, il y a possibilité de …
Microscopie Time-Lapse = microcinema
Fluorescence =
Capacité d’absorber de l’énergie lumineuse et puis de la restituer très rapidement sous forme de lumière d’énergie inférieure et de longueur d’onde + grande.
Miroir dichroïque :
Permet de laisser passer uniquement certaines longueurs d’ondes.
La fluorescence naturelle est appelée …
Bioluminescence (ex : lucioles, méduses à GFP)
Tout sur la GFP :
C’est une protéine naturellement fluorescente.
Elle a une forme de tonneau avec au milieu 3 AA =son chromophore (Glycine - Tyrosine - Thréonine)
Elle émet dans le vert.
la GFP possèdent 2 maximas d’excitation :
à 395 nm (UV) et à 475 nm (Bleu)
la CFP :
Est obtenue en remplaçant la tyrosine de la GFP par un tryptophane. Elle émet dans le bleu ciel.
La fluorescence est une propriété …. de la GFP
Intrinsèque.
Exemples de fluorochromes qui peuvent être fixé sur une molécule pour l’étudier :
Ce sont de petites molécules.
Exemples : La Fluorescéine (bleu -> vert) et la Rhodamine (vert -> rouge)
Comment introduire la fluorescence dans une cellule (4 méthodes) :
- Par micro-injection
- Par électroporation
- Par vectorisation par vésicules
- En exprimant un gène
Comment exprimer un gène fluorescent :
On introduit le gène + son promoteur par transfection dans le noyau. Pour étudier une protéine X, on greffe les gènes de la GFP + gènes de X par fusion traductionnelle et la cellule créé la protéine hybride X-GFP, dont on peut étudier la localisation.
FRET =
Fluorescence resonance Energy Transfer
C’est un transfert d’énergie non radiatif et quasi immédiat, entre deux molécules si leur distance est inférieure à 10 nm.
Pour qu’il y a ait FRET il faut absolument :
Que le spectre d’émission du donneur recouvre le spectre d’excitation du receveur
Il peut y avoir FRET entre:
Deux molécules ( FRET intermoléculaire)
Ou dans la même molécule (FRET intramoléculaire)
Le FRET intramoléculaire permet ….
L’étude de la conformation : il y a FRET si les deux extrémités se rapprochent.
Un exemple de FRET intramoléculaire :
la sonde calcique “caméléon” :
la calmoduline permet de fixer jusqu’à 4 calcium en changeant de conformation.
=> + il y a de calcium, + un FRET produira de la fluorescence !
Photobleaching =
On tue irréversiblement la fluorescence, par overdose de lumière d’excitation.