Microscopie Flashcards
On peut voir à l’oeil nu jusqu’à :
200 microns = 0,2 mm
La limite de résolution théorique de la microscopie optique est de …
200 nm (elle est du au caractère ondulatoire de la lumière)
Principe de la MO :
Une source de lumière est concentrée sur l’échantillon via une série de lentilles (=condensateur).
Un objectif permet d’augmenter le signal et d’obtenir une image.
Les objectifs vont de …
2,5 à 100
Fixation =
On fige la structure du tissu par des agents chimiques bifonctionnels comme le glutaraldéhyde ou le formol
Rigidification =
Inclusion en résine, en paraffine
Coupe =
Au microtome
Les cellules perdent leur couleurs lors de…
La déshydratation. C’est pourquoi des colorants sont nécessaires pour les visualiser.
La fixation et la coloration entrainent …
La mort de la cellule et des réarrangements
Un colorant permet :
d’amplifier la différence de longueur d’onde produite lors de la traversée des structures cellulaires. Ils peuvent être spécifiques d’activité ou de structures cellulaires.
La microscopie à contraste de phase :
Permet d’augmenter le déphasage des ondes ondes, déphasées par les modifications de diffraction rencontrées lors de la traversée cellulaire.
Le contraste est lié aux variations des indices de réfractions dans les milieux cellulaires.
Avantages de la microscopie à contraste de phase :
Ne tue pas les cellules (car pas besoin de les fixer)
L’image est + contrastée (mais + sombre et -brillante)
En microscopie à contraste de phase, il y a possibilité de …
Microscopie Time-Lapse = microcinema
Fluorescence =
Capacité d’absorber de l’énergie lumineuse et puis de la restituer très rapidement sous forme de lumière d’énergie inférieure et de longueur d’onde + grande.
Miroir dichroïque :
Permet de laisser passer uniquement certaines longueurs d’ondes.
La fluorescence naturelle est appelée …
Bioluminescence (ex : lucioles, méduses à GFP)
Tout sur la GFP :
C’est une protéine naturellement fluorescente.
Elle a une forme de tonneau avec au milieu 3 AA =son chromophore (Glycine - Tyrosine - Thréonine)
Elle émet dans le vert.
la GFP possèdent 2 maximas d’excitation :
à 395 nm (UV) et à 475 nm (Bleu)
la CFP :
Est obtenue en remplaçant la tyrosine de la GFP par un tryptophane. Elle émet dans le bleu ciel.
La fluorescence est une propriété …. de la GFP
Intrinsèque.
Exemples de fluorochromes qui peuvent être fixé sur une molécule pour l’étudier :
Ce sont de petites molécules.
Exemples : La Fluorescéine (bleu -> vert) et la Rhodamine (vert -> rouge)
Comment introduire la fluorescence dans une cellule (4 méthodes) :
- Par micro-injection
- Par électroporation
- Par vectorisation par vésicules
- En exprimant un gène
Comment exprimer un gène fluorescent :
On introduit le gène + son promoteur par transfection dans le noyau. Pour étudier une protéine X, on greffe les gènes de la GFP + gènes de X par fusion traductionnelle et la cellule créé la protéine hybride X-GFP, dont on peut étudier la localisation.
FRET =
Fluorescence resonance Energy Transfer
C’est un transfert d’énergie non radiatif et quasi immédiat, entre deux molécules si leur distance est inférieure à 10 nm.
Pour qu’il y a ait FRET il faut absolument :
Que le spectre d’émission du donneur recouvre le spectre d’excitation du receveur
Il peut y avoir FRET entre:
Deux molécules ( FRET intermoléculaire)
Ou dans la même molécule (FRET intramoléculaire)
Le FRET intramoléculaire permet ….
L’étude de la conformation : il y a FRET si les deux extrémités se rapprochent.
Un exemple de FRET intramoléculaire :
la sonde calcique “caméléon” :
la calmoduline permet de fixer jusqu’à 4 calcium en changeant de conformation.
=> + il y a de calcium, + un FRET produira de la fluorescence !
Photobleaching =
On tue irréversiblement la fluorescence, par overdose de lumière d’excitation.
FRAP =
Fluorescence Recovery After Photobleaching
On irradie pendant un certain temps un endroit précis de la cellule et on y observe le retour (ou non) de la fluorescence
FLIP =
Fluorescence Lost In Photobleaching
On irradie en continu une zone précise de la cellule et on observe une autre zone, pour voir si la fluorescence y disparaît.
(permet de connaitre la vitesse de déplacement des molécules au sein de la cellule)
FLIP et FRAP nous renseignent :
Sur la dynamie des molécules
Fluorescence induite =
Un colorant devient fluorescent lorsqu’il se fixe sur la molécule étudiée (++ pour les acides nucléiques)
La fluorescence induite repose sur deux types de composés :
-> Des colorants sur paires de bases
Hoescht et Dapi, sur bases A-T
OU bien :
-> Des intercalants de l’ADN qui se fixent entre les brins de manière non spécifique
Bromure d’ethidium et Iodure de propidium
Exemple de fluorescence induite : FURA 2
Sa fluorescence est modifiée en fct de sa fixation au calcium.
Plus il y a de calcium, + elle devient rouge.
Immunofluorescence indirecte =
Technique immunochimique utilisant plusieurs anticorps dont un couplé à un fluorochrome
(Elle peut aussi être directe, si il y a un seul anticorps couplé à un fluorochrome)
Structure d’un anticorps :
2 chaines légères et 2 chaines lourdes
Des parties sont constantes et d’autres sont variables, aux extrémités, et permettent la fixation spécifique des antigènes.
Epitope =
C’est la partie d’un antigène reconnue par des anticorps. Un antigène en possède plusieurs, différents.
Anticorps polyclonaux =
ils reconnaissent plusieurs épitopes d’un antigène
Anticorps monoclonaux =
ils reconnaissent un seul épitope
Comment obtenir des anticorps polyclonaux ?
Par injection de l’antigène dans un animal : on récupère ensuite le serum
Comment obtenir des anticorps monoclonaux ?
Par la technique de criblage d’hybridome
Un hybridome est une cellule immortalisée et productrice d’anticorps monoclonaux, obtenue par fusion de lymphocytes B et de cellules cancéreuses de myélome
Il existe 2 voies de synthèse des voies puriques et pyrimidiques, nécessaires à la synthèse de l’ADN :
- la voie endogène (inhibée par l’aminoptérine, par un milieu HAT)
- la voie exogène, via l’enzyme HGPRT
Les anticorps monoclonaux sont utilisés pour :
- > Visualisation spécifique d’une protéine
- > Purification par chromatographie d’affinité
- > Outils diagnostiques : Grossesse, SIDA
- > Mdcs (cancer, infections, greffes, allergies)
FISH =
Fluorescent In Situ Hybridization (= Hybridation in situ d’acides nucléiques avec des molécules fluorescentes)
Cela permet la visualisation de certains acides nucléiques via des sondes spécifiques d’une séquence d’ADN ou d’ARN, spécifiques d’un gène.
Le FISH repose sur une propriété intrinsèque des acides nucléiques :
L’hybridation avec une séquence complémentaire
Avec de l’ADN, le FISH se fait en plusieurs étapes :
- Dénaturation des liaisons H pour obtenir un seul brin
par chaleur ou traitement chimique (acide ou alcalin)
2.On rajoute la sonde :
Si il y a hybridation, le gène est présent et il y a un spot de fluorescence.
Si pas de fluorescence, le gène n’est pas présent.
Comment rendre la sonde directement fluorescente, dans le cadre d’un FISH ?
En incorporant à la sonde des nucléotides marqués (technique de Nick-Translation = coupure/déplacement)
Comment rendre la sonde indirectement fluorescente, dans le cadre d’un FISH ?
Avec un complexe antigène/anticorps : la sonde est marquée par des haptènes ( biotine ou digoxigénine) qui sont révélés par immunoréaction avec des Acs couplés à des fluorochromes
Cette technique permet l’amplification du signal mais est + longue et il y a + de risques de bruits de fond.
Le FISH permet :
- la recherche d’anomalies génétiques constitutionnelles
- la recherche d’aneuploidies
- la recherche d’anomalies génétiques acquises
ex : amplification d’HER2 sur le chromosome 17
Le SKY =
Permet d’obtenir un caryotype spectral
On colore tous les chromosomes humains (en 24 couleurs différentes)
La microscopie optique confocale =
Un faisceau de laser monochromatique traverse deux pin-holes (=diaphragmes) et les photons sont concentrés sur un seul plan focal.
Cela permet d’analyser l’échantillon dans son épaisseur et d’obtenir des modèles en 3D. On peut faire des sections.
Microscopie optique à super résolution =
Permet de s’affranchir de la limite de la résolution à 200 nm.
On prend une succession d’images où les molécules étudiées ne sont pas fluorescentes en même temps et on reconstruit leurs centres.
On obtient ainsi une meilleure résolution mais c’est + cher
Microscopie électronique :
La résolution peut aller jusqu’à 0.2 nm, ce qui permet un accès direct aux molécules.
Il faut une préparation spéciale car les électrons ont un pouvoir de pénétration inférieur à celui des photons.
Les observations se font toujours sous vide !
Microscopie électronique à transmission =
Des électrons sont envoyé par un canon à électron sur la préparation et ils la traversent (ou pas)
L’image obtenue dépend du contraste entre les zones perméables aux électrons et les imperméables.
S’ils ne traversent pas, c’est noir (zone dense aux électrons)
S’ils traversent, c’est blanc
Pour la microscopie électronique à transmission, il faut plusieurs étapes de préparation :
- On fixe l’échantillon avec des agents bivalents (glutaraldéhyde)
- On le déshydrate avec des bains d’alcool
- On l’inclu dans une résine Epoxy pour ensuite le couper très finement au microtome : l’échantillon a une épaisseur de 50 à 100 nm.
Pour la microscopie électronique à transmission, il est capital d’utiliser :
Des agents de contraste = des sels de métaux lourds comme l’uranyle ou le plomb
Ils permettent de retenir les électrons et de créer du contraste.
La microscopie électronique à transmission permet de très bien visualiser :
les contours de la cellule et des organites
Marquage à l’or =
permet de marquer spécifiquement des molécules, des protéines. Une molécule d’or colloidal se fixe à un anticorps spécifique d’une protéine d’intérêt.
L’or stoppe les électrons.
Une molécule d’or colloïdal se compose :
- > D’ une protéine de staphylocoque = Protéine A ou G, qui est un fixateur général des anticorps
- > Couplée à l’or
Ombrage =
On réalise un moulage de l’objet pour étudier sa surface : c’est une technique de visualisation indirecte.
Les électrons ne traversent pas du tout cette réplique !
Méthode de l’ombrage :
- L’échantillon est disposé sur une surface de mica
- Il est recouvert de métaux lourds via une électrode chauffée
- Un film de carbone rigidifie l’ensemble : on obtient une réplique de métal
- L’échantillon, en dessous, est dissous dans un bain d’acide
- On étudie la réplique
Cryomicroscopie =
Cryofracture
Principe de la cryomicroscopie :
- On congèle l’échantillon sous vide, à -150 degré dans l’azote liquide
- Fracturation sous vie : on fait passer une lame et celle ci coupe entre les 2 feuillets des membranes, dans la zone hydrophobe.
- On augmente le relief par sublimation de la couche superficielle de glace
- On vaporise une couche de platine et de carbone : cela créé un moule de la surface
- On étudie cette réplique au ME
(les zones riches en platine apparaîtront noires)
La cryomicroscopie permet d’éviter :
La fixation et la déshydratation, donc la dénaturation
La microscopie électronique à balayage =
Les électrons sont tous réfléchis à la surface de l’échantillon : on explore le volume et les surfaces en recueillant l’émission des électrons secondaires réfléchis.
On peut ainsi visualiser en 3D
Les électrons sont accélérés à très forte tension
L’échantillon est fixé et recouvert de métaux lourds
La microscopie électronique à balayage à une moins bonne résolution, elle est de :
10 nm
Microscopie à force atomique =
Microscopie à champs rapproché
On obtient une image directe de l’échantillon à l’échelle atomique ( à condition que la surface soit peu rugueuse)
Principe de la microscopie à force atomique :
- Une pointe analyse l’échantillon
- Dès qu’une surface s’en approche , des forces de proximité la déplacent légèrement (déflexion) et cela induit une force sur un levier.
- La force est enregistrée par un dispositif laser
- Le laser se réfléchit sur une photo diode
- la photo diode enregistre les mouvements
- Un ordinateur convertit ces données en image, en relief
En microscopie à force atomique, la résolution dépend de :
la finesse de la pointe
Avantages de la microscopie à force atomique :
- Meilleure résolution
- Etude de volume, en 3D
- Non destructif
- Peut être utilisé dans n’importe quel milieu : dans un liquide, à l’air libre
- Pas de coloration nécessaire
- C’est moins cher
- Pas besoin de fixation
En microscopie à force atomique, un système permet de maintenir les forces d’interactions constantes et de les fixer à une position, pour les étudier :
c’est le système de retro-action
Les microscopes à force atomique doivent impérativement être :
Isolés des forces et vibrations extérieures
Ils sont accrochés à des ressorts ou bien sur des socles en caoutchouc
La microscopie à force atomique permet :
- L’étude des interactions ADN/protéines et la cartographie des protéines sur l’ADN
- La cartographie des changements de conformation de l’ADN
