microscopes Flashcards
taille moyenne de la cellule
20 microm
tout d’abord, on avait
microscopes optiques + photoniques
puis on va mettre a profit
rayonnements + efffets physiques
microscope c’est s optique composé
d’au moins 2 lentilles convergentes
puissance est aussi appelle
grossissement
puissance - grossissement c’est un
produit su grossissement de l’objectif et de l’oculaire
resolution est egale a
distance minimale entre 2 points contigus
resolution: formule
0.61* lambda / n sin alpha
puissance ou grossissement c’est
rapport de l’angle sous lequel l’observateur voit l’objet sur angle sous lequel ons l verrait sans micro
n c’est
indice de reffraction
alpha -
demi angle du cone de vision
+ puissance importante
+ objet doit etre proche
il y a … modes differentes du travail
3
transmission
reflexion
reemission
transmission compte … modes diff:
2
absorption - lumiere blanche
contraste de phase - theorie ondulatoire
on a besoin de 2 photons de meme longueur pour travailler en
contrastede phase
preparation doit avoir les points de reffraction … pour avoir une difference de phase
differents
difference de phase depend de 2 choses
truc 1: epaisseur
truc 2: difference d’indice de r
frenges d’interference ou fentes de Young sont typiques pour micro en phase de
contraste de phase
difference de phase est
invisible
difference d’amplitude est
visible
diagramme de Jablonski c’est pour micro en phase de
fluorescence
UV
400 nm
IR >
800 nm
role des anneaux de phase: 2
- arrete rayons transmis
capte diffracté
contraste de phase n’est pas possible pour
coupes histo
c de phase esr applicable aux
cellules en culture
reflexion capte
rayons reflechis par les parois
reflexion ne donne pas l’image de
la structure interne, slmt surface
reflexion n’est pas applicabe aux
coupes histo - de tissus
intensite +++ dans microscope
en reflexion
eclairage … permet de collecter + de rayons reflechis
lateral
loupes binoc, stereomicroscopes , au fond noir- 3 types de m en
reflexion
reemision jour sur la theorie
quantique de la lumiere
photon illuminant peut etre capte par
orbitales peripheriques
on utilise les lampes de mercure ou laser en
reemission
les enzymes lytiques sont dans les
peroxysomes, lysosomes..
liste de procedures:
- fixation ( aldehydes + parrafine )
- deshydratation (alcools >) + xylene
- enrobage - paraffine
- coupe
- rehydratation
- observation
fixation est par
formol, glutaraldehydes dilués
temperature paraffine fixation:
50 degres
apres fixation, l’eau reste le … abondant
plus
temperature de p en enrobage
50-60 degres
xylene tue les
lipides
enrobage est longue, car parrafine est
+ visqueuse
microtome donne coupes
qq microns - dixaines de microns
porte objets sont enduites d’une solution d’
ovalbumine ()
duree de chaque bain de rehydratation se fait en
1 min
il y a 2 colorants
cytochim/ histochim
signaletiques/ topographiques
signaletiques/topo ont affinite
faible
cytochim/hitochim ont affinite
specifique
les colorants signaletiques ou topo sont
hematoxyline, eosine, bleus
hemaxyline:
colorant …
colore ….
region dite …
basique
noyau, an, lysosomes, REG
basophile
eosine:
colorant …
colore …
region dite …
acide
proteines, vesicules de secretion proteiques, appareil contractile des muscles
acidophile / eosinophile
trichrome de masson:se fixe
sur les glucides de la MEC du TC - marron!
May Grumvald Giemsa contient
methylene bleu + eosine
GM utile est de
- 1000
on congele echantillon … par …
directement + CO2
on realise des coupes
plus epais
les coupes extemporanees sont pas
fixes -> enzymes actives
on peut analyser grace au congelation …. des enzymes, mais aussi les
activite + localisation
lipides visualisables
sur frottis: les enzymes
ne fonctionnenet pas, car ipso facto inactives
boite de petri: max grossissement
X5
puissance max est de
X40
toutes les techniques sont applicables au microscope
inverse, mais +++ fluo, trans->absorption, contrastes de phase
GM de stereo:
80
GM aux UV
1.000
resolution — avec
fluorescence
deconvolution:
bille calibree
confocal: usage
fluo + transmission - visible
meme si on utilise confocal, la
petite partie de l’intensite des points voisins va etre detectee
confocal:
2 types
2D -> 3D
on peut voir des coupes de 100 microm grace au
m confocal
Ruska 1929
ME
resolution pratique ME
2-3 nm
100 fois mieux que MO
MET: bref
2 fixations (OSO4) + glutaraldehyde enrobage araldite, cyanolite, metacrylate
coupes MET sont
ultrafines -> 50 nm
on utilise ultramicrotome pour
MET
on fait l’enrobage avant
l’inclusion
resines epoxy: +++ pour
MET
MEB ou SEM: travaillent
en reflexion
donne image de surface
ombrage metallique - vaporise Pb ou Au - angle oblique - MEB
electrones IIaires -
MEB
localisation cell vivantes:
GFP, FRAP, sondes metabo
on place GFP sur
3’
marquage spe de proteine, possib de recommencer l’analyse caracterise les
FRAP
photodegradation est
irreversible
FURA2 +:
vagues Ca2+
Carboxyfluorescine:
pH
rhodamine123
mito vivantes et actives
rhodamine 123 ne met pas en evidence des
lysosomes
PAS: cellules
mortes
PAS: ouvre les cycles grace au
acide periodique IO4H
IO4H trouve les
groupements alpha glycol vicinaux COH_COH
puis on applique le r de Schniff qui colore en rouge si on a des
polysacch
alpha amylase elimine
glycogene
si on colore, c’est
pas glycogene
si reste incolore
il s’agit de glycogene
peroxydases sont mis en evidence par
couleur est
H2O2 + DAB
brun doré
MET: x
- 000
MEB: x
100.000
anticorps qui reconnait un epitope est un
ac monoclonal
anticorps sur 2 ag diff -
commun, partagé
CAM peut etre
Ca2+ dependante ou pas
SAM determine les
polysaccharides
compte globule mesure
la resistance
L’intensité du courant est proportionnelle à la
diminution de surface de l’orifice
cytometre de flux: 4 etapes
- suspesion + fluorochromes sur ac
- suspension passe dans un capillaire
- flux eclaire par laser
- sortie du c-re, gouttes + charges e
(champ magnetique)
FAcS c’est
Fluorescence activator cell center
lyse menagee:
RE -> microsomes, vesicules
lyse mecanique:
uktrasons, cavitation, lyse osmotique
au dela de 10.000 g, on parle de
ultracentrifugation
on utilise de saccharose dans la
centrifugation differentielle
cohesines ne persistent pas que
centromere
bras long
q
bras court
p petit
constrictions 2aires sont sous
les telomeres
5 paires avec satellites
13 14 15 21 22
impedancemetrie caracterise
compte - globule
