microscope Flashcards
pouvoir de séparation de l’œil
100 µm à une distance de 25 cm
Une cellule animale type a un diamètre de
10 à 20 µm, ce qui est 5 fois inférieur au diamètre de la
plus petite des particules visibles à l’œil nu.
La cellule est l’unité
structurale et fonctionnelle des organismes vivants.
10**-10 m
1A
cellule végétale :
100 µm
bactérie
1 µm
virus, ribosome:
entre 10 et 100 nm
molécule
1 nm
atome
0,1 nm
Microscope photonique :
0,5 µm – 5 mm
Microscope électronique
0,5 nm – 100 µm
Microscopie photonique / optique
Source d’énergie
photon
la propriété la plus importante d’un microscope est
son pouvoir de résolution = sa
capacité à distinguer 2 objets très proches.
La limite de résolution d’un microscope photonique classique est
voisine de 0,2 µm (200 nm).
Les microscopes de super-résolution sont conçus pour
« dépasser » cette barrière de résolution.
A contraste de phase
Ce type de microscope est utilisé
l’observation d’objets
incolores et mobiles (bactéries, spermatozoïdes) et permet
d’obtenir des images fortement contrastées.
On joue sur les différents indices de réfraction (n), les ondes
lumineuses conservent la même amplitude, mais peuvent être
déphasées si elles traversent des milieux d’indices différents.
Le faisceau résultant est plus intense lorsque les ondes sont en phase et plus faible s’il y a déphasage.
A épifluorescence
Ce microscope permet
détecter des substances fluorescentes.
Une substance est fluorescente quand elle absorbe la lumière d’une certaine longueur d’onde (λ
excitation) et émet de la lumière visible de longueur d’onde
déterminée et supérieure.
Rhodamine
Fluorescéine
DAPI
Rhodamine : molécule fluorescente dans le rouge
Fluorescéine : molécule fluorescente dans le vert-jaune
DAPI : molécule fluorescente dans le bleu.
Confocal à balayage laser
Son principe est
Son principe est de découper en tranche virtuelle très fine une cellule à l’aide d’un laser pour
reconstituer l’image en 3D de cette même cellule.
L’image est construite point par point par balayage (X,Y) du champ analysé à l’aide de miroirs de
déflexion de la source lumineuse.
Microscopie électronique
Source d’énergie
électrons
Microscopie électronique à transmission (MET)
(5)
- Des bobines électromagnétiques dirige le faisceau d’électron à travers l’échantillon.
- L’image se forme sur un écran fluorescent et la mise au point se fait au moyen d’une loupe
binoculaire. - zone foncé
- plus le numéro atomique augmente plus la densité augmente
- préparation imprégnée par sels de métaux lourds (acétate d’uranium / citrate de plomb).
Microscopie électronique à balayage (MEB)
(5)
- l’étude de la surface d’objets entiers, en donnant une image de leur relief.
- L’échantillon n’est pas traversé, mais balayé par un faisceau convergent d’électrons.
- certains électrons sont émis par l’échantillon (électrons
secondaires). - La quantité d’électrons secondaires émis à partir de chaque point de l’échantillon est mesurée par un
détecteur, ce qui permet la construction d’une image sur un écran vidéo. - Plus le faisceau est incliné par rapport à la surface de l’échantillon, plus le phénomène des électrons
secondaires est important.
Microscopie optique
Il y a 5 étapes
fixation
o empêche autolyse
o fixateur : alcool
déshydratation
o pour imprégnation au milieu d’inclusion
enrobage / inclusion
-
-
o avec paraffine solidification
-
-
coupe
o 5 à 10 µm
o microtome
o dépôt sur une lame de verre
coloration
o hématoxyline pour macromolécules chargées négativement
Microscopie électronique classique
étapes
fixation
o empêche autolyse
o fixateur : glutaraldéhyde
déshydratation
enrobage / inclusion
coupe
-
o 50 à 100 nm
o ultramicrotome
o dépôt sur une grille
coloration positive
o sels de métaux lourds
Microscopie électronique = autres techniques
a) Coloration négative
La coloration négative est utilisée pour des petits échantillons comme les virus.
Enrobage : dans une cible phosphotungstique ou molybdique (métaux lourds).
Séchage : un film très mince recouvre la grille sauf à l’endroit où se trouvent les virus.
Résultat : les virus sont perméables aux électrons, contrairement à la cible métallique.
On obtient une image de contraste inverse ou négative.
Microscopie électronique = autres techniques
Ombrage
L’échantillon est vaporisé de métaux lourds avec un angle particulier.
On voit que les sels de métaux lourds s’accumulent du côté de la vaporisation.
On dépose sur tout l’échantillon un film de carbone de renforcement.
On obtient un moulage qui est exposé à un solvant organique qui dissout
l’échantillon.
Le moulage est lavé et déposé sur la grille d’analyse.
Microscopie électronique = autres techniques
c) Cryofracture et cryodécapage
Exploration des feuillets membranaires cellulaires et des organites.
Congélation rapide des cellules dans l’azote liquide (-196°C) en présence d’un cryoprotecteur.
Fracture : Le bloc congelé est fracturé, sous vide et à basse température (-110°C)
Décapage : Le niveau de la glace est abaissé autour des cellules par sublimation de la glace en
augmentant la température
