Méthodologie de l'ADN recombinant - DESPOUY Flashcards
1
Q
Rôle organisme donneur
A
extraction et coupure de l’ADN en fragment contenant un à plusieurs fragment d’interêt
2
Q
Définition vecteur
A
fragment d’ADN capable de réplication autonome
rôle : transporter l’ADN et l’introduire dans un autre organisme
3
Q
Principe de l’ADN recombinant
A
fragments d’ADN d’organisme donneur inséré dans une molécule vecteur –> obtention de l’ADN recombinant –> amplification –> purification/extraction –> introduction dans un organisme = OGM
4
Q
3 familles d’enzymes utilisées pour corriger les erreurs de l’ADN
A
- nucléases : pour couper
- polymérases : pour repolymériser le brin complémentaire
- ligases : pour relier
5
Q
Rôle nucléases
A
hydrolyser les liaisons phosphodiester des acides nucléiques –> couper ADN
6
Q
Lieux d’action des nucléases
A
- à l’extrémité d’une chaîne –> exonucléase
- au sein d’une chaîne –> endonucléase
7
Q
Différentes sortes de nucléases
A
- DNase I
- RNase H
- Nucléase SI
8
Q
DNase I
A
= Désoxyribonucléase I
- endonucléase
- dégradation d’ADN simple ou double brin
- coupe après une pyrimidine
9
Q
RNase H
A
- endonucléase
- dégradation du brin d’ARN
10
Q
Nucléase SI
A
- endonucléase
- dégradation d’ADN ou ARN simple brin seulement
11
Q
Enzymes de restriction
A
DNase qui agit en milieu de chaîne double brin
= endonucléase spécifique à l’ADN double brin
12
Q
2 utilisations des enzymes de restriction
A
- analyse facilitée de l’ADN génomique
- construction molécules d’ADN recombinants
13
Q
Différent types d’enzymes de restriction
A
- type I : enzyme reconnaît la séquence et coupe à 1000-5000pb
- type II : coupe au niveau de la séquence reconnue
- type III : coupe à 20pb de la séquence reconnue
14
Q
Nomenclature des enzymes de restriction
A
1) 1 majuscule + 2 minuscules : abréviation organisme hôte (espèce + genre)
2) (facultatif) 1 majuscule : nom de souche
3) chiffre romain : n° découverte enzyme dans la même bactérie
15
Q
Séquence reconnue chez les enzymes de type II
A
4 à 8pb, forme un palindrome avec les complémentaires
16
Q
2 types de coupure réalisées par les enzymes de restriction
A
- bouts francs : coupures au même endroit sur les 2 brins
- bouts cohésifs : coupures décalées, pas en face, pas au même endroit sur les 2 brins
17
Q
2 types de schizomères
A
- isoschizomères : coupe au même niveau que les autres enzymes de restriction
- néoschizomères : coupe à un endroit différent que les autres enzymes de restriction
18
Q
Rôle ligases
A
assurer une ligature grâce à une liaison phosphodiester entre 3’-OH et 5’-P de 2 nucléotides déjà incorporés dans ADN ou ARN
19
Q
Différentes sortes de ligases
A
- T4 ARN ligase
- T4 ADN ligase
- ADN ligase E. Coli
20
Q
T4 ARN ligase
A
ligature entre 2 ARN distincts
21
Q
T4 ADN ligase
A
ligature entre 2 ADN
(plus efficace lorsqu’ils sont à bout franc) en hydrolysant de l’ATP
22
Q
ADN ligase E. Coli
A
ligature si 2 bouts sont correctement positionnés l’un par rapport à l’autre
- après extrémité cohésive
- après coupure simple brin dans ADN double brin
23
Q
Rôle polymérase
A
former des molécules d’ADN ou ARN
24
Q
Sens de lecture du brin matrice
A
dans le sens 3’ –> 5’
25
Sens de synthèse du nouveau brin
dans le sens 5' --> 3'
26
Taq polymérase
ADN polymérase thermostable = résistante à de hautes températures
27
ADN polymérase I d'E. Coli
enzyme tri-fonctionnelle :
- polymérase 5' --> 3'
- exonucléase 5' --> 3'
- exonucléase 3' --> 5'
28
Transcriptase inverse
- ADN polymérase ARN-dépendante : n'a pas besoin de matrice d'ADN mais d'une matrice d'ARN
- possède activité DNase H
- permettre créer brin complémentaire à l'ARN => ADN
29
ARN synthétisé
- complémentaire du brin matrice = non-codant = anti-sens
- donc même séquence que brin non-matrice = codant = sens (mais contient U au lieu de T)
30
Définition clonage moléculaire
isoler, purifier et multiplier un gène ou fragment d'ADN en l'insérant dans une molécule d'ADN porteuse (= vecteur)
31
Définition vecteur de clonage
séquence nucléotidique capable de s'autorépliquer et utilisé pour la ligature d'un fragment l'ADN et son amplification extra-chromosomique
32
Définition vecteur d'expression
vecteur de clonage avec promoteur fort et terminateur en plus
--> permet expression de gène par organisme hôte
33
Définition site de clonage multiple = SCM = MCS
court segment d'ADN qui contient de nombreux sites de restriction
34
Définition Ori = Origine de réplication bactérienne
point de départ de l'initiation de la réplication de l'ADN
35
Rôle gène de sélection
repérer/sélectionner facilement les cellules qui ont intégré le vecteur
36
Vecteurs de clonage principal
plasmide
37
Différentes sortes de plasmides
- plasmide de clonage
- plasmide d'expression
38
Différentes sortes de plasmide de clonage
- PBR322
- pUC19
- Gène LacZ
39
Différentes sortes de plasmides d'expression
- procaryote avec étiquette
- eucaryote avec étiquette
- eucaryote
40
Définition plasmide
molécule circulaire d'ADN bactérien, porte des gènes qui servent à l'adaptation de la bactérie
41
Caractéristiques plasmide de clonage
- réplication dans cellule hôte de manière autonome
- taille petite
- sites de coupures uniques
- sélection simple des bactéries
- persistance dans hôte sans modification
- pas de perturbation dans cellules hôte
- purification aisée
42
Rôle plasmide d'expression
permet transcription de l'ADNc dans l'hôte
43
Étapes du clonage moléculaire
1) préparation du vecteur :
- ouverture avec enzymes de restriction (bout franc ou cohésif)
- traitement pour éviter qu'il se referme
2) préparation de l'ADN à cloner :
- enzymes restriction (bout franc ou cohésif : comme vecteur)
3) ligature :
- ADN ligase
- ratio insert / vecteur
44
Ligature dans le cas d'un vecteur et insert avec 2 extrémités cohésives identiques
2 sens d'insertion possible
45
Ligature dans le cas d'un vecteur et insert avec 2 extrémités cohésives différentes
1 seul sens d'insertion possible
46
Ligature dans le cas d'un vecteur et insert avec 2 bouts francs
2 sens d'insertion possible
47
Pourquoi choix des bactéries pour le clonage d'un fragment d'ADN
- multiplication rapide
- facile à manier
- peu onéreuses
- non pathogènes
48
Différentes étapes de propagation de la molécule recombinante
- clonage d'un fragment d'ADN
- choix de l'hôte
- transformation
- sélection
- extraction / purification de l'ADN plasmidique
- extraction / purification de l'ADN génomique
- électrophorèse d'ADN
49
Étapes de la transformation
- mise en compétence de la bactérie avec Cacl2
- transformation des bactéries compétentes avec ADN recombinant
50
Traitement pour mettre en compétences les bactéries
Traitement par CaCl2 : altération de la perméabilité des bactéries
51
Transformation des bactéries compétentes avec ADN recombinant
Choc thermique : alternance plusieurs fois entre 42° et 4°C --> création de pores --> entrée de ADN recombinant dans bactérie
52
Différentes étapes de l'extraction / purification d'ADN plasmidique
1) lyse alcaline
2) dénaturation
3) renaturation ADN plasmidique
4) élimination des protéines
5) précipitation de l'ADN plasmidique
53
Différentes étapes de l'extraction / purification d'ADN génomique
1) lyse avec un détergent
2) dissociation des protéines
3) élimination des protéines et ADN génomique
4) précipitation de l'ADN
5) conservation
54
Dénaturation de l'ADN
augmentation du pH basique --> séparation des 2 brins
55
Renaturation de l'ADN plasmidique
diminution du pH rapide --> seul l'ADN plasmidique a le temps de se renaturer (il devient soluble), l'ADN génomique n'a pas le temps car il est très long
56
Protéine permettant dissociation des protéines
protéase
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Élimination des protéines
- par extraction phénol-chloroforme
- par chromatographie
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Précipitation de l'ADN
- par éthanol
- par isopropanol
59
Définition lyse
dénaturation de la paroi de la bactérie
60
Rôle électrophorèse d'ADN
contrôler l'ADN recombinant pour être sur qu'il est bien celui qu'on voulait obtenir
61
Facteur variation de vitesse de migration en életrophorèse
- masse moléculaire
- concentration en agarose ou acrylamide du gel
- distance de migration
62
Étapes de l'électrophorèse
1) coulage du gel et du montage
2) chargement
3) migration
4) visualisation sous UVs
5) Photo
63
Chargement pendant l'électrophorèse
- ajout de bleu de dépôt pour visualiser l'échantillon
- ajout de glycérol pour que le gel tombe dans le puit
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Coloration pour visualiser échantillon lors d'électrophorèse
- bleu de Xylème cyanol
- bleu de bromophénol
65
Différentes sortes d'électrophorèse
- analytique : analyse la taille de tous les fragments
- préparation : isole une bande ou un fragment particulier
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Agent pour révélation d'un gel d'électrophorèse
BET ou SYBR Safe
67
Rôle BET (bromure d'éthidium)
s'intercale entre les bandes de l'ADN --> fluorescence 20 fois plus intense sous UV lorsqu'il est lié à l'ADN -->
68
Rôle SYBR Safe
marqueur de masse moléculaire ADN double brin
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Définition marqueur de masse moléculaire
ensemble de fragments de taille connue servant à déterminer la masse moléculaire de fragments
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Conditions pour électrophorèse ADN plasmidique
uniquement sur plasmide digéré = ADN linéaire
--> ne fonctionne pas sur ADN plasmide non digéré
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Définition fragments de restriction
fragments d'ADN obtenu par action des enzymes de restriction
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Définition carte de restriction
classement par taille des fragments obtenus après action des enzymes de restriction sur une région donnée de l'ADN
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Utilisations du séquençage d'ADN
- séquençage des génomes
- alignement des séquences
- recherche de mutations
- recherche de motifs ou structures consensus
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Différents tests génétiques
- test de paternité / maternité
- comparaison d'empreintes génétiques
- recherche de mutations connues sur des gènes précis
- tests prénataux
- pharmacogénomique
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