Méthodologie de l'ADN recombinant - DESPOUY Flashcards
Rôle organisme donneur
extraction et coupure de l’ADN en fragment contenant un à plusieurs fragment d’interêt
Définition vecteur
fragment d’ADN capable de réplication autonome
rôle : transporter l’ADN et l’introduire dans un autre organisme
Principe de l’ADN recombinant
fragments d’ADN d’organisme donneur inséré dans une molécule vecteur –> obtention de l’ADN recombinant –> amplification –> purification/extraction –> introduction dans un organisme = OGM
3 familles d’enzymes utilisées pour corriger les erreurs de l’ADN
- nucléases : pour couper
- polymérases : pour repolymériser le brin complémentaire
- ligases : pour relier
Rôle nucléases
hydrolyser les liaisons phosphodiester des acides nucléiques –> couper ADN
Lieux d’action des nucléases
- à l’extrémité d’une chaîne –> exonucléase
- au sein d’une chaîne –> endonucléase
Différentes sortes de nucléases
- DNase I
- RNase H
- Nucléase SI
DNase I
= Désoxyribonucléase I
- endonucléase
- dégradation d’ADN simple ou double brin
- coupe après une pyrimidine
RNase H
- endonucléase
- dégradation du brin d’ARN
Nucléase SI
- endonucléase
- dégradation d’ADN ou ARN simple brin seulement
Enzymes de restriction
DNase qui agit en milieu de chaîne double brin
= endonucléase spécifique à l’ADN double brin
2 utilisations des enzymes de restriction
- analyse facilitée de l’ADN génomique
- construction molécules d’ADN recombinants
Différent types d’enzymes de restriction
- type I : enzyme reconnaît la séquence et coupe à 1000-5000pb
- type II : coupe au niveau de la séquence reconnue
- type III : coupe à 20pb de la séquence reconnue
Nomenclature des enzymes de restriction
1) 1 majuscule + 2 minuscules : abréviation organisme hôte (espèce + genre)
2) (facultatif) 1 majuscule : nom de souche
3) chiffre romain : n° découverte enzyme dans la même bactérie
Séquence reconnue chez les enzymes de type II
4 à 8pb, forme un palindrome avec les complémentaires
2 types de coupure réalisées par les enzymes de restriction
- bouts francs : coupures au même endroit sur les 2 brins
- bouts cohésifs : coupures décalées, pas en face, pas au même endroit sur les 2 brins
2 types de schizomères
- isoschizomères : coupe au même niveau que les autres enzymes de restriction
- néoschizomères : coupe à un endroit différent que les autres enzymes de restriction
Rôle ligases
assurer une ligature grâce à une liaison phosphodiester entre 3’-OH et 5’-P de 2 nucléotides déjà incorporés dans ADN ou ARN
Différentes sortes de ligases
- T4 ARN ligase
- T4 ADN ligase
- ADN ligase E. Coli
T4 ARN ligase
ligature entre 2 ARN distincts
T4 ADN ligase
ligature entre 2 ADN
(plus efficace lorsqu’ils sont à bout franc) en hydrolysant de l’ATP
ADN ligase E. Coli
ligature si 2 bouts sont correctement positionnés l’un par rapport à l’autre
- après extrémité cohésive
- après coupure simple brin dans ADN double brin
Rôle polymérase
former des molécules d’ADN ou ARN
Sens de lecture du brin matrice
dans le sens 3’ –> 5’
Sens de synthèse du nouveau brin
dans le sens 5’ –> 3’
Taq polymérase
ADN polymérase thermostable = résistante à de hautes températures
ADN polymérase I d’E. Coli
enzyme tri-fonctionnelle :
- polymérase 5’ –> 3’
- exonucléase 5’ –> 3’
- exonucléase 3’ –> 5’
Transcriptase inverse
- ADN polymérase ARN-dépendante : n’a pas besoin de matrice d’ADN mais d’une matrice d’ARN
- possède activité DNase H
- permettre créer brin complémentaire à l’ARN => ADN
ARN synthétisé
- complémentaire du brin matrice = non-codant = anti-sens
- donc même séquence que brin non-matrice = codant = sens (mais contient U au lieu de T)
Définition clonage moléculaire
isoler, purifier et multiplier un gène ou fragment d’ADN en l’insérant dans une molécule d’ADN porteuse (= vecteur)
Définition vecteur de clonage
séquence nucléotidique capable de s’autorépliquer et utilisé pour la ligature d’un fragment l’ADN et son amplification extra-chromosomique
Définition vecteur d’expression
vecteur de clonage avec promoteur fort et terminateur en plus
–> permet expression de gène par organisme hôte
Définition site de clonage multiple = SCM = MCS
court segment d’ADN qui contient de nombreux sites de restriction
Définition Ori = Origine de réplication bactérienne
point de départ de l’initiation de la réplication de l’ADN
Rôle gène de sélection
repérer/sélectionner facilement les cellules qui ont intégré le vecteur
Vecteurs de clonage principal
plasmide
Différentes sortes de plasmides
- plasmide de clonage
- plasmide d’expression
Différentes sortes de plasmide de clonage
- PBR322
- pUC19
- Gène LacZ
Différentes sortes de plasmides d’expression
- procaryote avec étiquette
- eucaryote avec étiquette
- eucaryote
Définition plasmide
molécule circulaire d’ADN bactérien, porte des gènes qui servent à l’adaptation de la bactérie
Caractéristiques plasmide de clonage
- réplication dans cellule hôte de manière autonome
- taille petite
- sites de coupures uniques
- sélection simple des bactéries
- persistance dans hôte sans modification
- pas de perturbation dans cellules hôte
- purification aisée
Rôle plasmide d’expression
permet transcription de l’ADNc dans l’hôte
Étapes du clonage moléculaire
1) préparation du vecteur :
- ouverture avec enzymes de restriction (bout franc ou cohésif)
- traitement pour éviter qu’il se referme
2) préparation de l’ADN à cloner :
- enzymes restriction (bout franc ou cohésif : comme vecteur)
3) ligature :
- ADN ligase
- ratio insert / vecteur
Ligature dans le cas d’un vecteur et insert avec 2 extrémités cohésives identiques
2 sens d’insertion possible
Ligature dans le cas d’un vecteur et insert avec 2 extrémités cohésives différentes
1 seul sens d’insertion possible
Ligature dans le cas d’un vecteur et insert avec 2 bouts francs
2 sens d’insertion possible
Pourquoi choix des bactéries pour le clonage d’un fragment d’ADN
- multiplication rapide
- facile à manier
- peu onéreuses
- non pathogènes
Différentes étapes de propagation de la molécule recombinante
- clonage d’un fragment d’ADN
- choix de l’hôte
- transformation
- sélection
- extraction / purification de l’ADN plasmidique
- extraction / purification de l’ADN génomique
- électrophorèse d’ADN
Étapes de la transformation
- mise en compétence de la bactérie avec Cacl2
- transformation des bactéries compétentes avec ADN recombinant
Traitement pour mettre en compétences les bactéries
Traitement par CaCl2 : altération de la perméabilité des bactéries
Transformation des bactéries compétentes avec ADN recombinant
Choc thermique : alternance plusieurs fois entre 42° et 4°C –> création de pores –> entrée de ADN recombinant dans bactérie
Différentes étapes de l’extraction / purification d’ADN plasmidique
1) lyse alcaline
2) dénaturation
3) renaturation ADN plasmidique
4) élimination des protéines
5) précipitation de l’ADN plasmidique
Différentes étapes de l’extraction / purification d’ADN génomique
1) lyse avec un détergent
2) dissociation des protéines
3) élimination des protéines et ADN génomique
4) précipitation de l’ADN
5) conservation
Dénaturation de l’ADN
augmentation du pH basique –> séparation des 2 brins
Renaturation de l’ADN plasmidique
diminution du pH rapide –> seul l’ADN plasmidique a le temps de se renaturer (il devient soluble), l’ADN génomique n’a pas le temps car il est très long
Protéine permettant dissociation des protéines
protéase
Élimination des protéines
- par extraction phénol-chloroforme
- par chromatographie
Précipitation de l’ADN
- par éthanol
- par isopropanol
Définition lyse
dénaturation de la paroi de la bactérie
Rôle électrophorèse d’ADN
contrôler l’ADN recombinant pour être sur qu’il est bien celui qu’on voulait obtenir
Facteur variation de vitesse de migration en életrophorèse
- masse moléculaire
- concentration en agarose ou acrylamide du gel
- distance de migration
Étapes de l’électrophorèse
1) coulage du gel et du montage
2) chargement
3) migration
4) visualisation sous UVs
5) Photo
Chargement pendant l’électrophorèse
- ajout de bleu de dépôt pour visualiser l’échantillon
- ajout de glycérol pour que le gel tombe dans le puit
Coloration pour visualiser échantillon lors d’électrophorèse
- bleu de Xylème cyanol
- bleu de bromophénol
Différentes sortes d’électrophorèse
- analytique : analyse la taille de tous les fragments
- préparation : isole une bande ou un fragment particulier
Agent pour révélation d’un gel d’électrophorèse
BET ou SYBR Safe
Rôle BET (bromure d’éthidium)
s’intercale entre les bandes de l’ADN –> fluorescence 20 fois plus intense sous UV lorsqu’il est lié à l’ADN –>
Rôle SYBR Safe
marqueur de masse moléculaire ADN double brin
Définition marqueur de masse moléculaire
ensemble de fragments de taille connue servant à déterminer la masse moléculaire de fragments
Conditions pour électrophorèse ADN plasmidique
uniquement sur plasmide digéré = ADN linéaire
–> ne fonctionne pas sur ADN plasmide non digéré
Définition fragments de restriction
fragments d’ADN obtenu par action des enzymes de restriction
Définition carte de restriction
classement par taille des fragments obtenus après action des enzymes de restriction sur une région donnée de l’ADN
Utilisations du séquençage d’ADN
- séquençage des génomes
- alignement des séquences
- recherche de mutations
- recherche de motifs ou structures consensus
Différents tests génétiques
- test de paternité / maternité
- comparaison d’empreintes génétiques
- recherche de mutations connues sur des gènes précis
- tests prénataux
- pharmacogénomique
