Méthodes de fabrication de matrice implantable Flashcards
Methode par porogènes
Moulage
solvant casting
gas foaming
freeze drying
Moulage principe
1- Polymérisation (addition, condensation …)
2- Mise sous forme de granules (thermoplastiques
seulement)
3- Polymère fondu, puis mis en forme par :
» Moulage par compression : Granules dans moule chauffé sous
pression puis refroidi
» Moulage par extrusion: Granules fondus dans filière avec vis
» Moulage par injection: Granules fondues dans petite vis puis injectée sous pression dans un moule froid
solvant casting avantages et limites
Avantages :
facile ;
taille des pores peut être controllé par la quantité et la taille des porogène
Utilise moins de polymère
Limites :
forme des pores et leur interconnectivité est difficile à controler
Risque de toxicité si solvent toxique
Solvant casting les 2 méthodes
Pour former films
Pour former structure 3D avec
porogène
Gas foaming principe
Saturer le polymere de gaz CO2 à haute pression pendant 72h, puis réduire à
pression atmosphérique
Nucléation et croissance de bulles de gas CO2
Porosité jusqu’à 93% peut être obtenu ainsi
Gas foaming avantage et limites
Avantage: Elimine la nécessité de solvent et porogène chimiques
Limites: difficulté de controler la porosité et interconnectivité
freeze drying principe
1- Congeler la solution de polymère –> formation de cristaux de glace provenant
du solvant (ex: eau), entouré d’aggrégats de polymère
2- Réduire la pression en dessous de la pression
d’équilibre du solvent (sublimation des
cristaux solides en gaz) –> Matrice polymérique avec pores
interconnectés
Pq production de fibres par electrofilage?
- Pour fibres plus fines (<100 nm de diamètre)
- Forme des matrices dont la structure ressemble à la
MEC des tissus biologiques
Instrumentation electrofilage?
Seringue avec aiguille métallique : solution concentrée en polymère
Pompe
Générateur à haute tension
Collecteur relié à la terre
Principe electrofilage
- Polymère est sous forme de solution
- Application d’une tension élevée entre l’aiguille et le collecteur
- Une goutte de polymère perle à la pointe de l’aiguille
- Lorsque la force électrostatique surmonte la force de tension superficielle de la solution de polymère
- Projection d’un jet de polymère chargé du bout de l’aiguille vers le collecteur
- Évaporation du solvant
→ Nanofibres
Electrofilage : types de paramètres modulables
- Liés à la solution polymérique
- Liés au procédé
- Liés aux conditions ambiantes
Electrofilage : paramètres modulables liés a la solution polymérique
- Concentration en polymère
- Viscosité
- Poids moléculaire du polymère
- Tension superficielle de la solution (solvant)
- Conductivité électrique de la solution
- Densité de charge en surface
Electrofilage : paramètres modulables liés au procédé
- Champ électrique appliqué
- Débit
- Distance entre la pointe de l’aiguille et le collecteur
- Type de collecteur : composition et géométrie
Electrofilage : paramètres modulables aux conditions ambiantes
- Température
- Humidité
Electrofilage : Types de polymères
Gamme large de polymères
- Synthétique : polycaprolactone
(PCL), acide polylactique (PLA)
-Naturel : collagène, chitine,
acétate de cellulose, …
liaisons aux cellules (porteurs de séquences protéiniques)
Exemple : Mélange (protéines, polysaccharides, …)
→ pour générer matériaux aux propriétés voulues
→ Plus de 200 polymères électrofilés
Gamme large de structures
- Peut créer des nanofibres réparties aléatoirement (isotrope)
ou orientées (anisotropes) - Possibilité de co- électrofilage (mélanges de fibres, fibres creuses ou remplies d’une solution de médicament (électrofilage co-axial)
Avantages/limites de l’électofilage
Avantages:
- Possibilité de créer des structures ressemblant à la MEC des tissus biologiques
- Large gamme de polymères et de structures
Limites :
- Pas de contrôle parfait de la structure
- Épaisseur limitée
Impression 3D – additive
manufacturing –> Principaux procédés
- Fused deposition modeling (FDM) : filament de
polymère ou métal chauffé et extrudé - Frittage laser (Selective laser sintering): chauffe et
fusionne les grains de poudre métallique - Stereolithographie : photopolymérisation par
lumière UV, couche par couche
Technologie FDM (Fused Deposition
Modeling) principe
Fonctionne avec des thermoplastiques.
Les imprimantes 3D basées sur la technologie FDM fabriquent des pièces couche après couche, de bas en haut, en chauffant un matériau solide de manière à le ramollir et en
l’extrudant.
Matériaux les plus couramment utilisé en FDM
PLA et ABS (ABS beaucoup
plus résistant)
quels critères regarder pour les matériaux de FDM pour le monde médical
Biocompatible? Stérilisable ?
–> Stratasys : 3 matériaux testés et répondant dans une certaine mesure aux
exigences
» ULTEM
» ABS-M30i
» PC-ISO
Ont passé certains tests de biocompatibilité ISO10993 et/ou USP Classe VI.
Sont stérilisables
Utilisés comme dispositifs médicaux (pas encore comme implants)
Structures flexibles ?
–> Cette technologie peut maintenant imprimer des matières relativement souples
comme le silicone ou le caoutchouc.
Ex : TPU92A
Selective laser sintering/frittage principe + materiaux
Principe : Utiliser un laser pour chauffer et fritter une poudre seulement selon pattern pré-établi
–> La poudre non fritée sert de support
- En polymère (Nylon)
- En métal : DMLS (Direct Metal Laser Sintering)
Matériaux : acier inoxydable, Aluminum, alliage de nickel,
titane, Cobalt Chrome
Implant en titane (titane poreux)
Stereolithographie principe
couche par couche avec un masque qui va cacher les uv
polymere qui sont photopolymérisant = qui vont polymériser avec les rayon uv
Impression 3D de matériaux
céramiques par lithographie. Principe?
Poudre de céramique dans un polymère photosensible, polymérisé selon pattern
Puis polymère supprimé et poudre frittée
Limites de l’approche ‘classique’
1- Ajout des cellules dans la matrice a posteriori
2- Difficile de disperser les cellules de façon homogène dans une matrice 3D (par aiguille, par perfusion etc.) ;
3- Dommage aux cellules lorsqu’injectées par aiguille dans une simple solution
4- Beaucoup de perte de cellules, qui n’accrochent pas à la matrice (faible rétention cellulaire)
5- Risque de mortalité cellulaire si assèchement (cellules ont besoin d’eau)
Approche sans biomatériau - principe ?
Faire générer la matrice par les cellules (ECM)
Cellules en culture
Utilisation d’acide ascorbique
Secrètent leur matrice extracellulaire
Peuvent être roulées
Maturation (biomécanique, biochimique) dans des bioréacteurs pour
renforcer les propriétés mécaniques
Cell sheets principe?
Quelle approche?
–> Approche sans biomateriau
–> utilisation d’un polymère thermo-sensible (PIPAAm) pour
détacher la couche cellulaire. Puis assemblage couche sur couche
nb: = polymère thermosensible qui en milieu aqueux subit une transition réversible autour de 32 °C. Sous cette température critique inférieure de solubilité, il est hydrophile et gonflé ; au-delà, il devient hydrophobe et se recroqueville (shrinkage)
Hydrogels injectables - Pincipe?
- Biomatériau (généralement hydrogel) contenant des cellules : injecté par aiguille, catheter ou autre pour remplir la cavité /défaut
- Prend la forme de la cavité / espace disponible
- Doit être injectable mais solidifier rapidement in vivo pour ne pas être dispersé dans le tissu
Hydrogel injectable - Avantages et limites
Avantages :
- Minimalement invasif
- Cellules protégé du cisaillement par la solution visqueuse
- Rempli parfaitement le défaut
Limites :
1- Difficile de créer une structure poreuse
2- Moins de controle sur la structure 3D
3- Difficile d’avoir à la fois une injectabilité et glification rapide
4- Ne permet pas l’utilisation d’UV ou agents réticulants toxiques puisqu’injecté
in vivo
5- Pas de structure ‘prévascularisée’ possible
Biomatériaux injectables (propriétés)
1- Riche en eau (hydrogels)
2- pH physiologique (proche de 7)
3- Iso-osmolalité ( env 300 mOsm/L) (varie un peu en fonction des tissus)
4- Pas de composants toxiques (notamment agents de réticulation etc.)
5- Propriétés rhéofluidifiantes (‘shear thinning’) pour injectabilité
6- Ou gélifie in situ (photopolymérisaiton, ou hydrogel intelligent (‘smart’) (thermosensible, pH sensitive etc…)
7- Propriétés mécaniques après gélification/polymérisation doivent être similaires au tissu remplacé.
Hydrogels injectables (exemples)
Hydrogels PEG, modifiés
Collagène
Acide hyaluronique (HA)
poly(vinyl alcohol) [PVA]
poly(N-isopropylacrylamide) [PNIPAAm]
Alginate+Ca2+
Chitosane
Gélatine réticulée par transglutaminase
Souvent modifiés pour y greffer un peptide d’adhésion de type
RDG (integrin-binding peptide)
Défi : les hydrogels ont des propriétés mécaniques généralement
très faibles
Bio Impression 3D - Les 2 types et leur principes
Scaffold-based printing
Scaffold-free printing
Scaffold-based printing :
Les cellules sont imprimées sur un support (hydrogel)
En même temps ou après l’impression du support
Colonisation du support par les cellules
Biodégradation (ou retrait) du support
Scaffold-free printing
Cellules directement imprimées dans un substrat sans support
La bio-impression 3D def et classification
Définition : La bio-impression consiste à imprimer, grâce aux différentes techniques d’impression 3D, des tissus vivants à partir de l’assemblage, couches par couche de cellules, avec matrice.
Classification :
- Ink jet based
- Laser based
- Extrustion based
La bio-impression implique une 4ème dimension : la dimension temporelle au cours de laquelle les cellules imprimées vont s’organiser, migrer et se différencier de manière autonome pour former des tissus fonctionnels.
Extrusion-based bioprinting - Avantages et limites
Avantages:
* Matériaux/cellules variés
* Production évolutive
* Polymères synthétiques
*Rapidité
Inconvénients:
* Faible resolution
(>100μm)
*Très cher
*Gélification lente
Jetting-based bioprinting - Avantage et limites
Avantages:
*Coût plus faible
* Matériaux/cellules variés
*Haute resolution (20μm)
*Viabilité cellulaire (95%)
Limites
*Matériaux de faible viscosité
*Faible densité cellulaire
*Petite échelle
*Très lent
Etapes de biofabrication pour bio impression 3D
Cellules : isolées, préférablement d’une source autologue (du patient) (moelle osseuse, tissu adipeux…); Multipliées et différentiées si nécessaire
Mélange dans biomatériau sous forme liquide : Bioink (bioencre)
Mise dans cartouche
Impression couche par couche – formation de la structure 3D (préalablement designée par CAD)
Bioréacteur- Buts
1) Apporter les nutriments, O2 et CO2 nécessaire aux cellules durant la formation du tissu, et éliminer les déchets
» Mesure des paramètres (pH, T°, concentration O2
» Éléments: Chambre de perfusion, pompe pulsatile, senseurs
» Système dans incubateur ou bioréacteur indépendant
2) Ajouter des sollicitations favorisant la croissance des cellules et tissu – ou
pour étudier les mécanismes impliqués
» Sollicitations mécaniques (notamment pour tissus musculaires, cardiaques, tendons…)
» Sollicitations électriques (tissu nerveux, cardiaque)
Avantages de la bioimpression
3D sur les autres approches
- Porosité controllable
- Meilleur contrôle
de la distribution
des cellules à
l’intérieur de la
matrice - Géométrie
personnalisée - Prévascularisation
possible du tissu
Applications de la biomimpression 3D
Médecine régénérative
- Impression de tissus et d’organes: traitements maladies, blessures
- Impression de matrices pour régénérer des tissus
Remplacement d’organes ou tissus
- Solution aux manques de dons d’organes?
Chirurgie
- Prothèses, implants personnalisés
- Modèles anatomiques pour pratiquer
Recherche médicale (modèles 3D)
- Tester des molécules sur tissus 3D, vivants
- Comprendre des structures biologiques complexes
Pharmacologie
- Tester des médicaments sur des tissus vivants
- Médicaments personnalisés (dose optimale, ingrédients multiples)
Cosmétique
- Tester des produits sur des tissus vivants
- Plus de modèles animaux/humains ?
Exemple de realisation bioprinting 3D
cf tab cours p77
Quels sont les paramètres importants en
bioimpression 3D?
1- obtenir un tissu viable: Minimiser les dommages cellulaires
2- obtenir un tissu résistant => Bioencre liquide ou visqueuse pour être injectable mais doit être cohésive et résistante mécaniquement dès que déposée sur le substrat (ou en tout cas après procédé final)
3- obtenir un tissu précis et reproductible => filament et goutte de petite taille, et ne doit pas s’étaler sur la surface une fois déposé et recouvert des autres couches
Quels sont les risques de dommages cellulaires pdt la bioimpression 3D :
– Contraintes de cisaillement
– Suspension dans un liquide et température non physiologique
– Manque d’adhésion au substrat une fois durci
– Possible agent toxique dans la bioencre
– Assèchement
– Manque de nutriment et d’oxygène
Donner 5 exemples de matériaux utilisés comme bioencre
Alginate : gélifie immédiatement si immergé dans un bain de CaCl2 mais cela gêne
le processus de bioimpression. Possibilité de bioimpression co-axiale. Manque
d’adhésion cellulaire (ajout de gélatine) Dégradation non contrôlée par échange des
ions.
Collagène : excellente biocompatibilité et adhésion cellulaire (si gel à pH
physiologique) mais faibles propriétés mécaniques et remodelage par les cellules
(changement drastique de la géométrie.
Acide Hyaluronique
Fibrine : adhérence des cellules, et forme rapidement un gel lors du mélange
fibrinogène + thrombine, mais dégradation très rapide in vivo et faible propriétés
mécaniques
Gelatine : adhérence des cellules, mais gélatine soluble à 37°C
-Utilisée comme encre sacrificielle
- Réticulation
–> Gelatine-transglutaminase
– >GelMA : Gelatine modifiée par groupement méthacrylate pour
réticulation par photopolymérisation
Donner les 4 types de bioencres avancées
Mélanges
Réseaux interpénétrants (IPN)
Nanoparticules
Supra moléculaires
PQ Réticulation pré/post impression
Réticulant ajouté au polymère avant l’impression – légère réticulation permettant au gel de se tenir
Réticulation post-printing (par exemple par UV) : pour gel plus robuste
Encre sacrificielle - Definition
Donner 4 exemples
Encre pouvant être éliminée/dissoute après l’impression, pour créer porosité ou canal vide (perfusion sanguine) ou pour support de la structure durant l’impression
» Pluronic F-127
» Sucres
» Gelatine (soluble à 37°C)
» Alginate (citrate capture les ions Ca2+ , donc redissout le gel
d’alginate formé par ions Ca2+)
Pluronic®F-127 lire les infos au verso de la carte
lire sur diapo p 85 [21 sur 41]
Pluronic®F-127 –> propriétés
Injectable et thermoréversible (mécanisme de gélification réversible)
Liquide à 4 °C et semi-solide à 37 °C.
Redeviennent liquide si on diminue la température
- Peut être liquéfié en baissant la température, donc être éliminé
- Utilisation comme encre sacrificielle en bioimpression 3D
- laisser place à des canaux vides (par exemple pour la perfusion
sanguine)
Relativement biocompatible
Utilisé pour l’encapsulation de médicaments et parfois de cellules
L’approche FRESH - Nom complet et principe
(freeform reversible
embedding of suspended hydrogels)
principe = Impression dans un bain de support, qui offre un support
mécanique, réduit la dispersion du gel
Dans notre cas : aide aussi la gélification à 37C
Le bain de support le plus utilisé : microparticules de gélatine, qui
fond à 37C
Limites et directions futures de la bioimpression 3D
Domaine encore dans son enfance
Plusieurs défis de taille :
» Resolution
» Répétabilité
» Viabilité cellulaire
» Stérilité du produit final
» Densité cellulaire suffisante
» Vitesse de solidification
» Propriétés mécaniques généralement faibles
Encapsulation cellulaire def
Cellules enrobées dans un biomatériau
- Format macro
- Format micro (microsphères etc.)
- Cellules surtout utilisée pour leur fonction paracrine (produits qu’elles
secrètent) vs génie tissulaire (surtout pour leur capacité à fabriquer la
matrice extracellulaire (MEC) qui remplacera le biomatériau pour
fabriquer le nouveau tissu)
Buts de l’encapsulation cellulaire [3]
Pour la thérapie cellulaire - délivrer des cellules in vivo, en :
- Augmentant la rétention des cellules
- Augmentant leur survie
- Les protégeant contre le système immunitaire
Microencapsulation - Principe
Enrober cellule dans une microsphere (généralement hydrogel)
A quoi sert le biomateriau en microencapsulation?
Le biomatériau sert de membrane semipermeable qui :
Protège les cellules des stress mécaniques et chimiques
Protège de la réponse immunitaire
Haut ratio surface /volume ; Permet une bonne diffusion bi-directionelle des
nutriment, oxygène, déchets et molecules secrétées par les cellules
Bonne survie cellulaire
Bonne efficacité de liberation de produits paracrines
Facteurs importants pour la
microencapsulation?
Il y en a 7
Taille des billes (<400 um)
Uniformité de la taille
Uniformité du nombre de cellules encapsulées
Viabilité et fonction des cellules encapsulées
Facilité à fabriquer de grandes quantité de billes (pour applications cliniques)
Biodégradabilité (parfois requise, parfois non désirable)
Perméabilité du matériau (diffusion des nutriments – protection contre réaction immunitaire)
Micro encapsulation par extrusion - Principe
Goutte pendante
Goutte se détache sous l’effet de
son poids (taille dépend de la
densité, tension de surface et
diamètre de l’aiguille)
-forme des gouttes >1 mm
Pour réduire la taille des gouttes,
plusieurs méthodes employées:
- Electrospray (potentiel
électrique)
- Air comprimé
- vibration
Micro encapsulation par Lithographie - Principe
(a) Soft lithography : fabrication d’un moule dans lequel est moulé
la solution d’hydrogel contenant les cellules, qui est ensuite gélifié
(b) Photolithography : solution de gel+cellules est photopolymérisée par lampe (UV)
Micro encapsulation par Microfluidics - principe
Utilise des fluides dans des microenvironnements
Solution de gel+cellules dans un micro-canal, entre en contact avec autre phase (ex : solution d’alginate liquide + CaCl2)
Micro encapsulation par Emulsion - principe
Emulsion: mélange de deux liquides non miscibles, l’un dispersé en petite
gouttes dans l’autre
biomatériau le plus utilisé pour la microencapsulation?
Et ses limites
Alginate - Hydrogel naturel
Limites :
Variabilité de l’alginate (source)
Non biodégradable (soluble lorsque ions Ca2+ remplacés par ions
positifs monovalents (Na+ etc.) : dégradation non contrôlée
