Méthodes d'exploration de la cellule montier

Question 1

taille d’une cellule

Answer 1

entre 10-30 μm

Question 2

Protozoaires

Answer 2

eucaryotes unicellulaire animaux

Question 3

Protophytes

Answer 3

eucaryotes unicellulaire végétaux

Question 4

metazoaires

Answer 4

eucaryotes pluricellulaire animaux

Question 5

metaphytes

Answer 5

eucaryotes pluricellulaires végétaux

Question 6

Milieux de culture classique

Answer 6

Pour cellules lambda
37°C
- Substances nutritives élémentaires
- Suppléments pour la division comme SVF

Question 7

Milieux de culture chimiquement défini sans sérum

Answer 7

Pour cellules très différenciées
- Substances nutritives de bases
- Insuline
- Transferrine
- Albumine
- FC : EGF, NGF, IL-2

Question 8

rouge phénol

Answer 8

Indicateur coloré ajouté dans les milieux stériles

• Orange/jaune : pH < 7 (métaboliquement actif, division des cellules ou infection bactérienne)
• Rouge : pH = 7,2 - 7,4 (pas d’infection) -> physiologique.
• Violet : pH > 7,8 (pas de divisions ou infection par des champignons)

Question 9

Élevage des cultures dans la stérilité

Answer 9

à 37°C, avec un CO2 à 5% (idem à l’atmosphère). Les milieux de culture sont manipulés avec un incubateur et sous une hotte pour garantir la stérilité de la manipulation.

Question 10

culture primaire

Answer 10

pas immortelle (on arrive à les garder 1 semaine maximum)
- les cellules sont soumises au phénomène de sénescence (vieillissement et mort des cellules) plus ou moins rapidement,
- ralentissement des divisions.
- Les cellules in vitro expriment les propriétés de leur tissu d’origine.

Question 11

culture secondaire

Answer 11

• cellules de culture primaire repiquer dans une nouvelle boîte de culture avec du milieu de culture neuf
• Les cellules in vitro expriment les propriétés de leur tissu d’origine

Question 12

Les cellules normales = saines en culture

Answer 12

• Prolifération contrôlée (taille normale, état de l’ADN, l’environnement est
  maintenu = nécessité de facteurs de croissance et d’ancrage dans l’environnement créé dans la boîte)
• Nombre limité de divisions voire pas de division -> en raison des raccourcissements des télomères a chaque division (perte de 40-200 nucléotides par division)

50 divisions pour les fibroblastes => peuvent être utilisés pour une culture secondaire

Question 13

cellules cancéreuses

Answer 13

Il n’y a pas de contrôle (elles sont autonomisées et ne répondent donc pas aux signaux envoyés par l’organisme => elles prolifèrent alors qu’elles reçoivent des messages antiprolifératifs).

• Il n’y a pas d’ancrage nécessaire, peu de facteurs de croissance, ainsi qu’une perte d’inhibition de contact dû à une dédifférenciation
• Cellules assez éloignées de leur tissu d’origine.
• Elles sont immortelles en culture (conservation très longue) et ceci grâce à une activité télomérase

Question 14

1ère étape nécessaires à l’isolement des cellules

Answer 14

Dissociation mécanique des tissus (dissection, tranches) => dissociation grossière mais nécessaire.

Question 15

2ème étape nécessaires à l’isolement des cellules

Answer 15

Dissociation enzymatique (= par des protéines) pour obtenir des cellules isolées :

o Pour des cellules de la MEC (Matrice Extracellulaire), on utilise des enzymes protéolytiques (trypsine)

o Pour des cellules de jonctions, on utilise des agents chélateurs (= emprisonneurs) du Ca2+ (EDTA = Éthylène Diamine Tétra Acétique) → dissociation chimique

Question 16

3ème étape nécessaires à l’isolement des cellules

Answer 16

Identifier les cellules et enrichir les différentes populations cellulaires grâce :
- Aux propriétés physiques : taille, capacité d’adhérence (ex : fibroblastes= adhère au fond de la boite, plus vie assez longtemps), densité (gradient de Ficoll = gradient de sucre qui va permettre de différencier les cellules en fct de leur densité, polysaccharide hydrophile)

o En utilisant les anticorps spécifiques couplés à un support ou à un colorant fluorescent (= fluorochrome) pour le cytomètre en flux/tri (=FACS)

o Par microdissection laser

Question 17

FACS déscription

Answer 17

Cette technique permet d’analyser les cellules individuellement et de façon automatique.

Peut mesurer les propriétés optiques (taille et complexité interne) de cellules transportées dans un liquide vecteur (flux) jusqu’à une source d’excitation lumineuse (souvent un laser).

Le faisceau de PHOTONS va passer à travers la chambre et va ainsi permettre de caractériser chaque cellules (vivantes ou non).

Question 18

Anticorps couplés à un support

Answer 18

Cette technique permet de repérer un antigène qui doit se trouver à la surface de la cellule (soit sur sa membrane). Elle ne permet pas de séparer des cellules en fonction de ce qu’il y a à l’intérieur de celles-ci.

Question 19

FACS avantages

Answer 19

• La rapidité et le haut débit : + 10 000 cellules en quelques minutes
• L’application aux cellules vivantes (selon leur taille, complexité interne = taille du noyau et différents organites présents, marquage*).
• L’intégration de plusieurs paramètres et les marquages multiples (permettant d’isoler des populations très spécifiques)
• Le fait que les cellules peuvent également être remises en culture.
• Marquages multiples : plusieurs marqueurs fluorescents couplés à différents types d’anticorps.

Question 20

FACS permet

Answer 20

• L’étude du cycle cellulaire (variation de q° d’ADN, iodure de propidium, intensité de fluorescence)
• Isoler des sous-populations
• quantifier et repartition des sous populations -> permet détablir des formules sanguines

Question 21

MET

Grossisement, limite de résolution et principe.

Answer 21

Grossissement : de 1 500 jusqu’à 500 000 fois
Limite de résolution : ≥ 2 nm (= 2.10^-9m)

Principe : se résume à faire passer un faisceau d’ELECTRONS, dans un environnement « rempli » de vide, à travers une coupe ultrafine (≈ 50 nm) d’un échantillon biologique, contrastée par un dépôt métallique. Ce faisceau est ensuite agrandi par des électroaimants et vient former une image sur un écran fluorescent ou sur un film photographique.

Question 22

MEB

Grossisement, limite de résolution et principe.

Préparation des échantillons:

Answer 22

Grossissement : de 20 à 400 000 fois

Limite de résolution : ≥ à 10 nm
Profondeur de champ (inexistante en MET) : qlq mm (permet l’effet de relief)

Principe : les électrons sont réfléchis sur l’objet et repris par un détecteur. Les dessiccations (l’eau est retirée) se font sans rétraction et on y dépose de l’or.

Question 23

Préparation des échantillons pour visualisation au MEB :

Answer 23

• prélèvement,
• fixation au glutaraldéhyde,
• déshydratation à l’acétone,
• métallisation avec de l’or ou de la platine.

/!\ Il n’y a pas de coupes au MEB.

On obtient une image tridimensionnelle (on ne voit pas l’intérieur !) où on observe les cellules intactes (mortes mais en l’état car pas de coupe) ainsi que les constituants cellulaires.
On observe par exemple la forme biconcave des GR (globules rouges), les cils ou flagelles cellulaires ou encore les microvillosités intestinales.

Question 24

Fractionnement subcellulaire = centrifugation et ultracentrifuge

Answer 24

Le but est de séparer, isoler et purifier les organites et les macromolécules sans les altérer pour étudier leurs fonctions. À partir d’un homogénat cellulaire, on centrifuge et ultracentrifuge avec des vitesses croissantes : les constituants de grande taille ou de grande densité sédimentent en premier (noyau, puis mitochondries…).

Homogénat cellulaire -> 1000 g / 10 min
Culot : Cellules entières + noyau + débrit
Surnagent -> 20 000g / 20 min
Culot : mt + lysosomes + péroxysomes
Surnagent -> 80 000g / 60 min
Culot : microsomes = fragment de RE
Surnagent -> 150 000g / 3h
Culot : ribosomes, virus, macromolécules.

Question 25

Les techniques de Southern-Northern–Western Blot

Étapes :

Answer 25

S : ADN / N : ARN / W : PROT

On part d’un gel (d’agarose par exemple). Elles se déroulent en plusieurs étapes :

Première : Électrophorèse (= migration électrophorétique) : on sépare les composants selon les poids moléculaires

Deuxième : Transfert sur un filtre par capillarité (blotting) => transfert électrique

Troisième : Hybridation avec une sonde spécifique (anticorps pour le Western blot)

Quatrième : Révélation

Question 26

L’oeil nu voit au plus :

Answer 26

0,2 mm = 200 μm

Question 27

L’atome mesure

Answer 27

0,2 nm

Question 28

le virus mesure

Answer 28

100 nm (pas visible au MO)

Question 29

la bactérie mesure

Answer 29

1 μm (visible au MO)

Question 30

la mitochondrie mesure

Answer 30

1 μm (visible en MO)

Question 31

Résolution de MO

Answer 31

0,2 μm = 200 nm

Question 32

Résolution MET

Answer 32

2 nm

Question 33

Résolution MEB

Answer 33

10 nm