Methodes D'etudes En Histologie

Question 1

Comment obtient-on des cellules vivantes ?

Answer 1

• réalisation des cultures : tube ou flacon de verre, flacons de culture en T, lames avec spots
• conditions de culture : milieu de culture adapté (sérum physiologique, milieu de synthèse élaboré), incubateur à 37C (enrichie à 5% en CO2 pour les cultures longues)
• coloration : Rouge neutre pour cellules vivantes, Bleu Trypan pour cellules mortes
• observation : cytomètre de flux, microscope inversé à contraste de phase

Question 2

comment obtient-on des cellules fixées à forte cellularité ?

Answer 2

Par brossage :

• grattage
• étalement (frottis buccal, vaginal)
• fixation, coloration
• observation en MO à fond clair

Question 3

Comment obtient-on des cellules fixées à faible cellularité ?

Answer 3

Par prélévement liquidien :

• ponction à l’aiguille, lavage ou voies naturelles
• centrifugation
• étalement (frottis moelle osseuse)
• fixation, coloration
• observation en MO à fond clair

Question 4

Comment obtient-on des cellules fixées par empreinte d’organes ?

Answer 4

• Apposition de fragment d’organe sur lame (ganglion lymphatique)
• fixation coloration
• observation en MO à fond clair

Question 5

Citer les 2 façons d’obtenir des échantillons tissulaires

Answer 5

• chirurgie : organes entiers prélevés (tumeur du sein, ganglion lymphatique)
• par biopsie : prélévement de tissus (bistouri à lame ou circulaire = punch)

Question 6

Citer les 4 méthodes d’études histologiques

Answer 6

• morphologique : description des structures
• biochimique : études des constituants biochimiques un situ
• moléculaire : analyses moléculaires un situ
• quantitative : estimation du nombre de cellules

Question 7

Citer le pouvoir séparateur de l’œil, du microscope optique et du microscope électronique

Answer 7

• 0,2mm
• 0,2 micron (de 0,2mm à 200nm)
• o,2 nm (de 200nm à 0,2nm)

Question 8

Que permet le microscope optique à fond clair ?

Answer 8

Étude de la structure interne des tissus

Question 9

Que permet le microscope optique à fond noir ?

Answer 9

Observation des détails peu contrastés (fibrocytes) et des limites cellulaires non visibles de certaines cellules

Question 10

Que permet le microscope polarisant ?

Answer 10

→ Le microscope polarisant permet de mettre en évidence les différents composants d’une structure

Question 11

Que permet le microscope optique à fluorescence ?

Answer 11

→ Le microscope optique à fluorescence permet d’observer et de localiser le nombre d’éléments marqués sur une structure

Question 12

Que permet le microscope à contraste de phase ?

Answer 12

→ Le microscope à contraste de phase permet l’observation de cellules vivantes, de préparations non colorées

Question 13

Que permet le microscope confocal ?

Answer 13

→ Le microscope confocal permet d’obtenir une représentation tridimensionnelle très fine de l’objet observé

Question 14

Que permet le microscope optique inversé à fond clair ?

Answer 14

Observation de cellules entières ou de tissus épais → Observation de cellules en culture in vitro

Question 15

Citer les étapes de préparation des échantillons tissulaires pour la microscopie optique standard

Answer 15

• fixation
• inclusion
• coupes
• étalement sur lames de verre
• coloration
• montage entre verre et lamelle

Question 16

Préparation des échantillons tissulaires pour la cryo-histologie
(évite l’inclusion)

Answer 16

La congélation
- à température très basse (-20° à -30°C) - très rapidement
- avec un cryoprotecteur si besoin

La coupe
- au cryostat pour la Microscopie Optique
- à l’ultracryomicrotome pour la Microscopie Electronique

Les applications :
histochimie, histoenzymologie, immunohistologie

Question 17

Préparation des échantillons tissulaires pour la Microscopie Confocale

Answer 17

Marquage des échantillons à étudier avec des fluorochromes.
Les fluorochromes sont alors excités par le L.A.S.E.R. qui convient

Question 18

Donner les caractéristiques et les exemples de coloration panoptiques

Answer 18

• Colorants basiques (auxochrome positif donc colorants cationiques)
  Ont une forte affinité pour les structures acides (chromatine) qui sont basophiles Exemples de colorants basiques : Bleu de méthylène, Hématéine (Hématoxyline oxydée)
• Colorants acides (auxochrome négatif donc colorants anioniques)
  Ont une forte affinité pour les structures basiques (protéines) qui sont acidophiles Exemples de colorants acides : Eosine, Fuschine acide

Question 19

Comment marche la coloration Hématéine-Eosine ?

Answer 19

L’hématéine colore les Noyaux (chromatine) en violet
L’éosine colore le Cytoplasme (acides aminés et protéines) en rouge

Question 20

À quoi est dû la limitation de l’observation en microscopie électronique ?

Answer 20

La limite d’observation est due aux aberrations des lentilles électromagnétiques.
-aberrations géométriques : les trajectoires des électrons ne sont pas paraxiales (sphéricité, coma, astigmatisme, distorsion)
-aberrations chromatiques : les faisceaux ne sont pas constitués par des électrons monocinétiques
-aberration de charge d’espace (répulsion que des électrons d’un même faisceau exercent les uns sur les autres).

Question 21

Citer le principe du microscope électronique à transmission

Answer 21

Les électrons se propagent à travers le spécimen observé

Question 22

Citer le principe du microscope électronique à balayage

Answer 22

Les électrons rétrodiffusés sont émis par l’échantillon

Question 23

Que peut-on observer avec la microscopie électronique ,

Answer 23

Observation de la forme et de l’aspect des cellules et des espaces qui les séparent Ultrastructure des organites

Question 24

Donner les étapes de préparation des échantillons tissulaires en MET

Answer 24

1) Fixation (Glutaraldéhyde) puis Post-Fixation (Acide Osmique qui fixe les graisses)
2) Inclusion en résines (Epon ou Araldite)
3) Coupes à l’ultramicrotome
Coupes ultra-fines (0.1μ) déposées sur une grille Les électrons sont moins pénétrants que les photons
4) Contrastants pour augmenter les contrastes entre le noir et le blanc -Acétate d’uranyle (noyau, nucléoles et ribosomes)
-Citrate de plomb (membrane)
5) Observation au Microscope Électronique à Transmission
Images observées en Noir et Blanc

Question 25

Citer les étapes de préparation des échantillons tissulaires en MEB

Answer 25

1) Fixation (Glutaraldéhyde) 2) Déshydratation
Très poussée, aboutissant à une dessication par lyophilisation
3) Métallisation (recouvrement de l’échantillon avec de l’or – palladium) permettant aux électrons d’être réfléchis à la surface de l’objet
4) Observation au Microscope Electronique à Balayage
Applications : étude des surfaces (spermatozoïdes, cils, cheveux…)

Question 26

Donner le but, le principe et les exemples de coloration histochimiques (MO)

Answer 26

But : Détecter et localiser différents constituants biochimiques (lipides, glucides et protéines)

Principe : grâce à des réactions chimiques in situ

Exemples:
-Soudan (Rouge ou Noir) lipides (rouge ou noir)
-P.A.S. (Périodic Acid Schiff) résidus glucidiques (rouge) -Réaction de Feulgen-Rossenbeck ADN (rose-rouge)

Question 27

Donner les caractéristiques des réactions aux colorants SOUDAN ? (9)

Answer 27

• coloration histochimiques
• groupement azotés
• colorants synthétiques insolubles dans l’eau
• sous forme d’une solution alcoolique
• agissent par transfert
• lipophiles (donnent leur couleur aux hydrocarbures)
• rouges soudan (I,II,III,IV)
• noirs Soudan (B,III)
• colore les lipides

Question 28

Donner les 3 étapes de la réaction par le Periodic Acid Schiff

Answer 28

1; Action de l’acide périodique HIO4

2. Action du réactif de Schiff
3. Formation d’un composé pourpre

–> coloré les glucides

Question 29

Donner les résultats de la réaction métachromatique

Answer 29

1. Densité faible dès GAG –> bleu
2. Densité élevé des GAG –> rouge
3. Densité très élevé dès GAG –> violet

Colore les glucides

Question 30

Donner les 2 étapes de la réaction de Feulgen-Rossenbeck

Answer 30

1) Une hydrolyse acide modérée par HCl à 60°C
L’HCl sépare les 2 bases puriques de l’ADN : Adénine et Guanine, libèrant les fonctions hémi-acétaliques des désoxyriboses.
Le squelette de l’ADN n’est pas modifié et reste en place.

2) Une coloration de l‘ADN restant par le réactif de Schiff
Le réactif de Schiff réagit alors avec les fonctions réductrices formant un précipité rouge. Donc l’ADN est coloré en rose-rouge

Question 31

Donner le but et le principe des colorations histo-enzymologiques

Answer 31

But: Détection et localisation in situ des activités enzymatiques en mettant en évidence le produit de leur action sur un substrat fourni

Principe : Cette technique s’effectue en 2 temps:
-1er temps: incubation de l’échantillon avec le substrat de l’enzyme pour donner un produit de réaction primaire
-2nd temps: révélation du produit de la réaction primaire sur le substrat

Question 32

Citer les 3 exemples de mise en évidence de composés par colorations histo-enzymologiques

Answer 32

• Frottis sanguin M.O. D.A.B. (Di Amino Benzidine) et H2O2
  → détection de l’activité peroxydase des granulocytes
• Épiderme M.O.
  DOPA (3,4 DihydrOxyPhénylAlanine) et O2
  → détection de l’activité tyrosinase des mélanocytes de l’épiderme
• TISSU MUSCULAIRE STRIÉ SQUELETTIQUE M.O. ATP à Ph 9,4 (rhabdomyocytes rapides)
  Différenciation des rhabdomyocytes lents avec l’ATP à ph 4,3 Différenciation des rhabdomyocytes rapides avec l’ATP à ph 9,4
  → détection de l’activité ATPasique des rhabdomyocytes

Question 33

Donner le but et le principe de l’approche moléculaire par immuno-histologie (protéines)

Answer 33

But: localiser un antigène (protéine en général)

Principe : on utilise des anticorps (monoclonaux ou polyclonaux) dirigés contre l’antigène recherché, qui sont marqués :

-Soit par un fluorochrome (fluorescéine) -> lecture au M.O. à fluorescence +++

-Soit par une enzyme (peroxydase, phosphatase alcaline) -> lecture au M.O. standard +/- ME suivant les cas

-Soit par l’or colloïdal (double ou triple marquage possible+++) -> lecture en M.E. en général

Question 34

Quelle est la différence entre les anticorps polyclonaux et les anticorps monoclonaux ?

Answer 34

ANTICORPS POLYCLONAUX
Les anticorps polyclonaux reconnaissent différents épitopes sur un antigène donné

ANTICORPS MONOCLONAUX
Les anticorps monoclonaux reconnaissent le même épitope d’un antigène donné

La spécificité des anticorps monoclonaux est supérieure aux anticorps polyclonaux mais leur sensibilité est inférieure.

Question 35

Citer la méthode pour produire des anticorps polyclonaux

Answer 35

On injecte plusieurs fois la Protéine antigénique à un animal (rat, souris, lapin)
Puis on recueille le sérum riche en antisérum contenant les anticorps polyclonaux
Au cours de la réponse immunitaire, comme l’organisme synthétise des anticorps dirigés contre plusieurs épitopes d’un antigène : la réponse est dite polyclonale

Question 36

Donner les étapes pour produire des anticorps monoclonaux

Answer 36

On immunise un animal (rat, souris, lapin) avec la Protéine antigénique.
Ses lymphocytes B isolés sont fusionnées (PEG) avec des myélomes (lymphocytes B immortels ne produisant pas d’anticorps). On obtient des hybridomes immortels, qui synthétisent des anticorps indéfiniment.
Sélection des hybridomes sur milieu Hypoxanthine Aminoptérine Thymidine. Les cellules B non-fusionnées incapables de se reproduire s’éliminent d’elles-mêmes. On clone les lymphocytes sécrétant l’anticorps dirigé contre l’épitope de l’antigène donné au cytomètre en flux. Chaque clone est ensuite testé (Western Blot, ELISA).

Question 37

Sur quelles coupes peut se faire une technique en immuno-histologie (protéines) ?

Answer 37

Technique de routine qui peut se faire :
-sur coupes au cryostat (M.O.)
-sur coupes en paraffine (M.O.)
-sur coupes ultrafines à l’ultra cryomicrotome (M.E.T.) -en bloc avant inclusion standard (M.E. T.)
Le choix de la technique dépend de l’antigène et de sa localisation On a 2 types de marquages de l’Anticorps utilisé : direct ou indirect

Question 38

Quelles substances peut-on utiliser pour sur les anticorps pour les rendre visible en microscopie en marquage direct ?

Answer 38

• fluorochrome
• enzyme
• or colloïdal

Question 39

Citer les trois exemples de marquage indirect de l’anticorps

Answer 39

• peroxydase anti peroxydase
• avidine/ Biotine
• Digoxigénine

Question 40

Comment met-on en évidence l’insuline pancréatique en immuno-histologie ?

Answer 40

Immuno-histologie par amplification avidine/Biotine de l’insuline
Révélation des anticorps primaires anti-insuline marqués à la peroxydée par DAB permettant la localisation des cellules bêta des îlots de Langerhans du pancréas endocrine en MO

Question 41

Donner le but et le principe de l’approche moléculaire par autoradiographie (macro-molécules)

Answer 41

But :
Étudier la biodistribution d’une substance radioactive dans la cellule (M.E.) ou un tissu (M.O.) par l’empreinte laissée sur un film radiographique (image d’émission)

Principe :
On prélève des tranches de tissus que l’on met en culture en présence d’une substance radioactive. Ce séjour en milieu radioactif est appelé « pulse ».
Les tranches sont ensuite placées, pendant des temps variables dans un milieu renfermant de la substance non radioactive, ce séjour est appelé « chase ».
Les tranches de tissus sont ensuite fixées et débitées en coupes sur lesquelles la radioactivité est localisée par impression sur plaque photographique

Question 42

Donner le but et le principe de l’approche moléculaire par hybridation un situ (acides nucléiques)

Answer 42

• But : Détecter ou localiser une séquence spécifique d’ADN ou d’ARN
• Principe: Sonde nucléique marquée ayant une séquence complémentaire de l’ADN ou de l’ARN cible
  *Le marquage de la sonde se fait ; aux isotopes (sondes chaudes) : H3, P32 ou, S35 aux fluorochromes (sondes froides) : FISH
  *La révélation : des sondes chaudes se fait par Autoradiographie
  des sondes froides se fait par Microscopie à Fluorescence
  *Lecture en M.O.

Question 43

Donner un exemple d’hybridation un situ

Answer 43

FISH sur des chromosomes humains avec hybridation d’une sonde dirigée contre un gène (KGF)
Révélation à l’aide d’un anticorps anti-digoxine
Lecture en MO à fluorescence

Question 44

Donner le but, le principe et les moyens de lectures de la technique de cytométrie

Answer 44

But :
Analyses qualitatives et quantitatives à l’échelle tissulaire ou à l’échelle cellulaire

Principe :
-Fluorescence de l’échantillon et focalisation hydrodynamique (système fluidique)
-Mesure de la fluorescence émise à l’aide de capteurs (système optique)
-Émission de fluorescence converties en valeurs digitales sur PC (système électronique)

Lectures :
Cytométrie de flux (cellules en suspension) : quantification rapide et précise Microscopie confocale : observation en 3D à l’échelon tissulaire ou cellulaire

Question 45

Donner les 3 constituants d’un cytomètre de flux

Answer 45

1) Un réseau fluidique (focalisation hydrodynamique)
2) Un banc optique (source lumineuse et capteurs)
3) Un microprocesseur (quantification des signaux électriques en numérique)

Question 46

Citer les 2 aberrations pouvant entraîner des imperfections créant des images artificielles

Answer 46

• aberration de sphéricité (forme) :
  Les rayons lumineux passant par les bords de la lentille ne convergent pas sur le même plan que les rayons lumineux passant par le centre
• aberration chromatique (couleur) : la diffraction ne se fait pas pour toutes les couleurs avec le même angle

Question 47

Quels sont les 2 facteurs essentiels permettant l’interprétation des images ?

Answer 47

• les moyens d’observations de l’échantillon

- la préparation de l’échantillon

Question 48

À quoi sert un polariseur ?

Answer 48

un polariseur transforme une onde non polarisée en une onde polarisée linéaire

Un analyseur est identique à un polariseur mais agit sur une onde déjà polarisée