Methodes D'etudes En Histologie Flashcards
Comment obtient-on des cellules vivantes ?
- réalisation des cultures : tube ou flacon de verre, flacons de culture en T, lames avec spots
- conditions de culture : milieu de culture adapté (sérum physiologique, milieu de synthèse élaboré), incubateur à 37C (enrichie à 5% en CO2 pour les cultures longues)
- coloration : Rouge neutre pour cellules vivantes, Bleu Trypan pour cellules mortes
- observation : cytomètre de flux, microscope inversé à contraste de phase
comment obtient-on des cellules fixées à forte cellularité ?
Par brossage :
- grattage
- étalement (frottis buccal, vaginal)
- fixation, coloration
- observation en MO à fond clair
Comment obtient-on des cellules fixées à faible cellularité ?
Par prélévement liquidien :
- ponction à l’aiguille, lavage ou voies naturelles
- centrifugation
- étalement (frottis moelle osseuse)
- fixation, coloration
- observation en MO à fond clair
Comment obtient-on des cellules fixées par empreinte d’organes ?
- Apposition de fragment d’organe sur lame (ganglion lymphatique)
- fixation coloration
- observation en MO à fond clair
Citer les 2 façons d’obtenir des échantillons tissulaires
- chirurgie : organes entiers prélevés (tumeur du sein, ganglion lymphatique)
- par biopsie : prélévement de tissus (bistouri à lame ou circulaire = punch)
Citer les 4 méthodes d’études histologiques
- morphologique : description des structures
- biochimique : études des constituants biochimiques un situ
- moléculaire : analyses moléculaires un situ
- quantitative : estimation du nombre de cellules
Citer le pouvoir séparateur de l’œil, du microscope optique et du microscope électronique
- 0,2mm
- 0,2 micron (de 0,2mm à 200nm)
- o,2 nm (de 200nm à 0,2nm)
Que permet le microscope optique à fond clair ?
Étude de la structure interne des tissus
Que permet le microscope optique à fond noir ?
Observation des détails peu contrastés (fibrocytes) et des limites cellulaires non visibles de certaines cellules
Que permet le microscope polarisant ?
→ Le microscope polarisant permet de mettre en évidence les différents composants d’une structure
Que permet le microscope optique à fluorescence ?
→ Le microscope optique à fluorescence permet d’observer et de localiser le nombre d’éléments marqués sur une structure
Que permet le microscope à contraste de phase ?
→ Le microscope à contraste de phase permet l’observation de cellules vivantes, de préparations non colorées
Que permet le microscope confocal ?
→ Le microscope confocal permet d’obtenir une représentation tridimensionnelle très fine de l’objet observé
Que permet le microscope optique inversé à fond clair ?
Observation de cellules entières ou de tissus épais → Observation de cellules en culture in vitro
Citer les étapes de préparation des échantillons tissulaires pour la microscopie optique standard
- fixation
- inclusion
- coupes
- étalement sur lames de verre
- coloration
- montage entre verre et lamelle
Préparation des échantillons tissulaires pour la cryo-histologie
(évite l’inclusion)
La congélation
- à température très basse (-20° à -30°C) - très rapidement
- avec un cryoprotecteur si besoin
La coupe
- au cryostat pour la Microscopie Optique
- à l’ultracryomicrotome pour la Microscopie Electronique
Les applications :
histochimie, histoenzymologie, immunohistologie
Préparation des échantillons tissulaires pour la Microscopie Confocale
Marquage des échantillons à étudier avec des fluorochromes.
Les fluorochromes sont alors excités par le L.A.S.E.R. qui convient
Donner les caractéristiques et les exemples de coloration panoptiques
- Colorants basiques (auxochrome positif donc colorants cationiques)
Ont une forte affinité pour les structures acides (chromatine) qui sont basophiles Exemples de colorants basiques : Bleu de méthylène, Hématéine (Hématoxyline oxydée) - Colorants acides (auxochrome négatif donc colorants anioniques)
Ont une forte affinité pour les structures basiques (protéines) qui sont acidophiles Exemples de colorants acides : Eosine, Fuschine acide
Comment marche la coloration Hématéine-Eosine ?
L’hématéine colore les Noyaux (chromatine) en violet
L’éosine colore le Cytoplasme (acides aminés et protéines) en rouge
À quoi est dû la limitation de l’observation en microscopie électronique ?
La limite d’observation est due aux aberrations des lentilles électromagnétiques.
-aberrations géométriques : les trajectoires des électrons ne sont pas paraxiales (sphéricité, coma, astigmatisme, distorsion)
-aberrations chromatiques : les faisceaux ne sont pas constitués par des électrons monocinétiques
-aberration de charge d’espace (répulsion que des électrons d’un même faisceau exercent les uns sur les autres).
Citer le principe du microscope électronique à transmission
Les électrons se propagent à travers le spécimen observé
Citer le principe du microscope électronique à balayage
Les électrons rétrodiffusés sont émis par l’échantillon
Que peut-on observer avec la microscopie électronique ,
Observation de la forme et de l’aspect des cellules et des espaces qui les séparent Ultrastructure des organites
Donner les étapes de préparation des échantillons tissulaires en MET
1) Fixation (Glutaraldéhyde) puis Post-Fixation (Acide Osmique qui fixe les graisses)
2) Inclusion en résines (Epon ou Araldite)
3) Coupes à l’ultramicrotome
Coupes ultra-fines (0.1μ) déposées sur une grille Les électrons sont moins pénétrants que les photons
4) Contrastants pour augmenter les contrastes entre le noir et le blanc -Acétate d’uranyle (noyau, nucléoles et ribosomes)
-Citrate de plomb (membrane)
5) Observation au Microscope Électronique à Transmission
Images observées en Noir et Blanc
Citer les étapes de préparation des échantillons tissulaires en MEB
1) Fixation (Glutaraldéhyde) 2) Déshydratation
Très poussée, aboutissant à une dessication par lyophilisation
3) Métallisation (recouvrement de l’échantillon avec de l’or – palladium) permettant aux électrons d’être réfléchis à la surface de l’objet
4) Observation au Microscope Electronique à Balayage
Applications : étude des surfaces (spermatozoïdes, cils, cheveux…)
Donner le but, le principe et les exemples de coloration histochimiques (MO)
But : Détecter et localiser différents constituants biochimiques (lipides, glucides et protéines)
Principe : grâce à des réactions chimiques in situ
Exemples:
-Soudan (Rouge ou Noir) lipides (rouge ou noir)
-P.A.S. (Périodic Acid Schiff) résidus glucidiques (rouge) -Réaction de Feulgen-Rossenbeck ADN (rose-rouge)
Donner les caractéristiques des réactions aux colorants SOUDAN ? (9)
- coloration histochimiques
- groupement azotés
- colorants synthétiques insolubles dans l’eau
- sous forme d’une solution alcoolique
- agissent par transfert
- lipophiles (donnent leur couleur aux hydrocarbures)
- rouges soudan (I,II,III,IV)
- noirs Soudan (B,III)
- colore les lipides
Donner les 3 étapes de la réaction par le Periodic Acid Schiff
1; Action de l’acide périodique HIO4
- Action du réactif de Schiff
- Formation d’un composé pourpre
–> coloré les glucides
Donner les résultats de la réaction métachromatique
- Densité faible dès GAG –> bleu
- Densité élevé des GAG –> rouge
- Densité très élevé dès GAG –> violet
Colore les glucides
Donner les 2 étapes de la réaction de Feulgen-Rossenbeck
1) Une hydrolyse acide modérée par HCl à 60°C
L’HCl sépare les 2 bases puriques de l’ADN : Adénine et Guanine, libèrant les fonctions hémi-acétaliques des désoxyriboses.
Le squelette de l’ADN n’est pas modifié et reste en place.
2) Une coloration de l‘ADN restant par le réactif de Schiff
Le réactif de Schiff réagit alors avec les fonctions réductrices formant un précipité rouge. Donc l’ADN est coloré en rose-rouge
Donner le but et le principe des colorations histo-enzymologiques
But: Détection et localisation in situ des activités enzymatiques en mettant en évidence le produit de leur action sur un substrat fourni
Principe : Cette technique s’effectue en 2 temps:
-1er temps: incubation de l’échantillon avec le substrat de l’enzyme pour donner un produit de réaction primaire
-2nd temps: révélation du produit de la réaction primaire sur le substrat
Citer les 3 exemples de mise en évidence de composés par colorations histo-enzymologiques
- Frottis sanguin M.O. D.A.B. (Di Amino Benzidine) et H2O2
→ détection de l’activité peroxydase des granulocytes - Épiderme M.O.
DOPA (3,4 DihydrOxyPhénylAlanine) et O2
→ détection de l’activité tyrosinase des mélanocytes de l’épiderme - TISSU MUSCULAIRE STRIÉ SQUELETTIQUE M.O. ATP à Ph 9,4 (rhabdomyocytes rapides)
Différenciation des rhabdomyocytes lents avec l’ATP à ph 4,3 Différenciation des rhabdomyocytes rapides avec l’ATP à ph 9,4
→ détection de l’activité ATPasique des rhabdomyocytes
Donner le but et le principe de l’approche moléculaire par immuno-histologie (protéines)
But: localiser un antigène (protéine en général)
Principe : on utilise des anticorps (monoclonaux ou polyclonaux) dirigés contre l’antigène recherché, qui sont marqués :
-Soit par un fluorochrome (fluorescéine) -> lecture au M.O. à fluorescence +++
-Soit par une enzyme (peroxydase, phosphatase alcaline) -> lecture au M.O. standard +/- ME suivant les cas
-Soit par l’or colloïdal (double ou triple marquage possible+++) -> lecture en M.E. en général
Quelle est la différence entre les anticorps polyclonaux et les anticorps monoclonaux ?
ANTICORPS POLYCLONAUX
Les anticorps polyclonaux reconnaissent différents épitopes sur un antigène donné
ANTICORPS MONOCLONAUX
Les anticorps monoclonaux reconnaissent le même épitope d’un antigène donné
La spécificité des anticorps monoclonaux est supérieure aux anticorps polyclonaux mais leur sensibilité est inférieure.
Citer la méthode pour produire des anticorps polyclonaux
On injecte plusieurs fois la Protéine antigénique à un animal (rat, souris, lapin)
Puis on recueille le sérum riche en antisérum contenant les anticorps polyclonaux
Au cours de la réponse immunitaire, comme l’organisme synthétise des anticorps dirigés contre plusieurs épitopes d’un antigène : la réponse est dite polyclonale
Donner les étapes pour produire des anticorps monoclonaux
On immunise un animal (rat, souris, lapin) avec la Protéine antigénique.
Ses lymphocytes B isolés sont fusionnées (PEG) avec des myélomes (lymphocytes B immortels ne produisant pas d’anticorps). On obtient des hybridomes immortels, qui synthétisent des anticorps indéfiniment.
Sélection des hybridomes sur milieu Hypoxanthine Aminoptérine Thymidine. Les cellules B non-fusionnées incapables de se reproduire s’éliminent d’elles-mêmes. On clone les lymphocytes sécrétant l’anticorps dirigé contre l’épitope de l’antigène donné au cytomètre en flux. Chaque clone est ensuite testé (Western Blot, ELISA).
Sur quelles coupes peut se faire une technique en immuno-histologie (protéines) ?
Technique de routine qui peut se faire :
-sur coupes au cryostat (M.O.)
-sur coupes en paraffine (M.O.)
-sur coupes ultrafines à l’ultra cryomicrotome (M.E.T.) -en bloc avant inclusion standard (M.E. T.)
Le choix de la technique dépend de l’antigène et de sa localisation On a 2 types de marquages de l’Anticorps utilisé : direct ou indirect
Quelles substances peut-on utiliser pour sur les anticorps pour les rendre visible en microscopie en marquage direct ?
- fluorochrome
- enzyme
- or colloïdal
Citer les trois exemples de marquage indirect de l’anticorps
- peroxydase anti peroxydase
- avidine/ Biotine
- Digoxigénine
Comment met-on en évidence l’insuline pancréatique en immuno-histologie ?
Immuno-histologie par amplification avidine/Biotine de l’insuline
Révélation des anticorps primaires anti-insuline marqués à la peroxydée par DAB permettant la localisation des cellules bêta des îlots de Langerhans du pancréas endocrine en MO
Donner le but et le principe de l’approche moléculaire par autoradiographie (macro-molécules)
But :
Étudier la biodistribution d’une substance radioactive dans la cellule (M.E.) ou un tissu (M.O.) par l’empreinte laissée sur un film radiographique (image d’émission)
Principe :
On prélève des tranches de tissus que l’on met en culture en présence d’une substance radioactive. Ce séjour en milieu radioactif est appelé « pulse ».
Les tranches sont ensuite placées, pendant des temps variables dans un milieu renfermant de la substance non radioactive, ce séjour est appelé « chase ».
Les tranches de tissus sont ensuite fixées et débitées en coupes sur lesquelles la radioactivité est localisée par impression sur plaque photographique
Donner le but et le principe de l’approche moléculaire par hybridation un situ (acides nucléiques)
- But : Détecter ou localiser une séquence spécifique d’ADN ou d’ARN
- Principe: Sonde nucléique marquée ayant une séquence complémentaire de l’ADN ou de l’ARN cible
*Le marquage de la sonde se fait ; aux isotopes (sondes chaudes) : H3, P32 ou, S35 aux fluorochromes (sondes froides) : FISH
*La révélation : des sondes chaudes se fait par Autoradiographie
des sondes froides se fait par Microscopie à Fluorescence
*Lecture en M.O.
Donner un exemple d’hybridation un situ
FISH sur des chromosomes humains avec hybridation d’une sonde dirigée contre un gène (KGF)
Révélation à l’aide d’un anticorps anti-digoxine
Lecture en MO à fluorescence
Donner le but, le principe et les moyens de lectures de la technique de cytométrie
But :
Analyses qualitatives et quantitatives à l’échelle tissulaire ou à l’échelle cellulaire
Principe :
-Fluorescence de l’échantillon et focalisation hydrodynamique (système fluidique)
-Mesure de la fluorescence émise à l’aide de capteurs (système optique)
-Émission de fluorescence converties en valeurs digitales sur PC (système électronique)
Lectures :
Cytométrie de flux (cellules en suspension) : quantification rapide et précise Microscopie confocale : observation en 3D à l’échelon tissulaire ou cellulaire
Donner les 3 constituants d’un cytomètre de flux
1) Un réseau fluidique (focalisation hydrodynamique)
2) Un banc optique (source lumineuse et capteurs)
3) Un microprocesseur (quantification des signaux électriques en numérique)
Citer les 2 aberrations pouvant entraîner des imperfections créant des images artificielles
- aberration de sphéricité (forme) :
Les rayons lumineux passant par les bords de la lentille ne convergent pas sur le même plan que les rayons lumineux passant par le centre - aberration chromatique (couleur) : la diffraction ne se fait pas pour toutes les couleurs avec le même angle
Quels sont les 2 facteurs essentiels permettant l’interprétation des images ?
- les moyens d’observations de l’échantillon
- la préparation de l’échantillon
À quoi sert un polariseur ?
un polariseur transforme une onde non polarisée en une onde polarisée linéaire
Un analyseur est identique à un polariseur mais agit sur une onde déjà polarisée
