Méthodes d'études Flashcards
Qu’est ce qu’une cellule ?
C’est l’unité fondamentale du vivant, qui peut fonctionner de manière autonome
Qu’est ce qu’un tissu fondamental ?
C’est un ensemble coopératif de cellules accompagné d’une matrice extracellulaire (SF : gel amorphe de “remplissage” + fibres)
Quels sont tous les types de tissus ?
1) Epithéliums de revêtement et glandulaires
2) Tissus conjonctifs et squelettiques
3) Cellules sanguines et tissus hématopoïétiques
4) Tissus musculaires
5) Tissus nerveux
Que forment les tissus fondamentaux ?
Des tissus complexes
Que forment des tissus complexes
Des organes et des structures
Dans quoi sont regroupées ces organes et structures ?
dans des appareils et systèmes
De quelle taille est la cellule ?
Elle est de 5 à 20 µm environ (mm si il y en a vachement plus longues)
Qu’est ce que le pouvoir séparateur ?
C’est la distance la plus petite entre 2 points vus séparés
Quel est le pouvoir séparateur de l’oeil ?
0,2 mm (200 µm)
Quel est le pouvoir séparateur du MO ?
0,2 µm (200 nm)
Quel est le pouvoir séparateur du ME ?
0,2 nm (2 Angstrom)
Quels sont les différents types d’échantillons ?
des cellules vivantes, des frottis, des empreintes/appositions ou encore des coupes
Dans quelles conditions se trouvent l’échantillon de cellules vivantes ?
Elles sont en survie (ex vivo) ou en culture (in vitro) dans un milieu de survie / culture et on utilise des colorations vitales (qui préservent la vie) qu’on observe sur une lame
Qu’est ce qu’un frottis ?
échantillon pour les liquides ou encore produits de grattage ou brossage qu’on observe sur lame
Qu’est ce qu’une empreinte / appposition ?
Type d’échantillon où on a dû posé sur une lame une tranche de notre prélèvement au préalable dans le but qu’il y ait quelques cellules qui s’y accrochent
Dans quel cas utilise-t-on des coupes comme échantillons ?
On utilise les coupes dans la plupart des cas et surtout lorsque l’organe est trop épais pour être observé directement au microscope, il faut donc des coupes fines ou ultrafines sur lame MO ou grille MET
Quelles sont les étapes de la préparation standard des échantillons en microscopie optique ?
Fixation, Inclusion, Coupe, Coloration et montage
En quoi consiste la fixation en MO ?
Etape indispensable pour préserver les structures biologiques et à réaliser le plus rapidement possible
On immerge dans un grand volume de liquide fixateur : paraformaldéhyde, de petits blocs d’organes qui vont se coaguler à cause du formol et cela va figer le tissu
En quoi consiste l’inclusion en MO ?
Permet de durcir l’échantillon pour permettre la coupe.
On utilise de la paraffine fondue (chauffée à 56°C) après d’avoir déshydrater les cellules dans des bains d’alcool à degré croissant puis dans du toluène
Pourquoi déshydrater l’échantillon lors de l’inclusion en MO ?
Pour que la paraffine puisse s’y introduire, étant elle même hydrophobe
Par quelle technique peut-on réaliser une coupe en MO ?
Les coupes peuvent être réalisées par microtomie ou cryotomie
En quoi consiste la coloration en MO ?
Elle permet d’augmenter les contrastes et faire apparaître les différents composants,
Coloration avec Hématéine-Eosine-Safran (HES) : H -> noyau en violet, E-> cytoplasme en rose, S -> fibres de collagène en jaune, après déparaffinage (par la chaleur et bains de toluène) et réhydratation
En quoi consiste le montage en MO ?
Après coloration puis déshydratation, les coupes sont montées entre lame et lamelle avec un milieu de montage (résine synthétique) d’indice de réfraction voisin de celui du verre
Pourquoi avoir un milieu de montage d’indice de réfraction voisin de celui du verre ?
Pour avoir une résolution maximale
De quoi est composé le MO ?
D’oculaires, d’objectifs, d’un condensateur et d’une source lumineuse
En quoi consiste le MO à contraste de phase ?
Appareil où l’on a modifié le trajet de la lumière pour qu’une partie du faisceau est modulée par l’échantillon et pas l’autre. En les faisant interférer, on crée un contraste dans lequel on pourra visualiser même les échantillons transparents
En quoi consiste le microscope à fluorescence ?
Observation d’échantillons fluorescents ou rendus fluorescents qui seront donc excités par une lampe à des longueurs d’onde données et réémettront à leur tour une longueur d’onde différente, et on utilisera donc des filtres pour bloquer les photons d’excitation et pas ceux d’émission
Quelles sont les étapes de préparation en MET ?
Fixation, Inclusion, Coupe et Contraste
Quelle est la spécificité d’une fixation en MET ?
Une fixation puis post-fixation avec acide osmique
Quelle est la spécificité d’une inclusion en MET ?
Après déshydratation, on dépose l’échantillon dans des résines synthétiques pour faire des coupes ultrafines
Quelle est la spécificité des coupes en MET ?
Ce sont des coupes ultrafines de 50 à 80 nm qu’on exécute avec un couteau en diamant/ pointe en diamant, qu’on dépose sur des grilles de cuivre
En quoi consiste le contraste en MET ?
Coloration par des métaux lourds comme l’acétate d’uranyle (pour noyau, nucléole et ribosomes) et citrate de plomb (pour les membranes)
En quoi consiste le MET ?
C’est un microscope où l’échantillon sera traversé par des électrons qui finira par frapper un écran et enregistré par un système
Quelles sont les étapes de préparation en MEB ?
Fixation, Déshydratation et métallisation de toutes les surfaces de l’échantillon
Quelle est la spécificité de la fixation en MEB ?
Pas de post fixation, et fixation chimique
Quelle est la spécificité de la déshydratation en MEB ?
Des bains d’alcools puis de CO2 liquide avec un passage au point critique du CO2 où il passe de l’état liquide à gazeux et il se passe donc une dessication par lyophilisation
En quoi consiste la métallisation en MEB ?
Pulvérisation d’or sur l’échantillon pour obtenir un dépôt d’une fine couche d’or-palladium d’environ 10 nm
En quoi consiste le MEB ?
C’est un Microscope où l’on va faire en sorte que le faisceau frappe l’échantillon incliné et qu’il soit ainsi dévié vers des détecteurs qui retranscriront sur un écran vidéo
En quoi consiste l’histochimie ?
Déceler et localiser des substances organiques et minérales à partir de réactions chimiques en mettant en évidence des fonctions ou groupements
Donner un exemple d’histochimie
Glucides et réaction à l’acide périodique de Schiff (PAS) : oxydation groupements glycol par acide périodique -> formation d’aldéhydes, révélation des aldéhydes par le réactif de Schiff -> coloration rouge pourpre
En quoi consiste l’histoenzymologie ?
Déceler / localiser des activités enzymatiques en mettant en évidence le produit de leur action sur un substrat fourni
Quelles sont les étapes de l’histoenzymologie ?
1) incubation de l’échantillon en présence du substrat
2) révélation du produit de la réaction enzymatique
En quoi consiste l’immunohistologie ?
L’utilisation d’un anticorps monoclonal pr détecter et localiser une protéine ou un polysaccharide
Comment est révélé le complexe Ag-Ac d’une immunohistologie ?
par un fluorochrome, une enzyme ou de l’or colloïdal pour la MEB, de façon directe ou indirecte
En quoi consiste l’hybridation in situ ?
Utilisation d’une sonde nucléique marquée pour détecter et localiser dans les cellules ou les tissus, une séquence spécifique d’ADN ou d’ARN
Quelles sont les étapes de l’hybridation in situ ?
1) dénaturation de l’ADN et de la sonde (cassage des brins)
2) hybridation (recouplage des brins)
3) lecture à l’aide du marqueur
Comment la sonde en hybridation in situ est-elle marquée ?
Elle est marquée par :
- des isotopes radioactifs = sondes chaudes
- des produits non radioactifs = sondes froides, genre des fluorochromes, enzymes ou or colloïdal pour MEB
En quoi consiste l’autoradiographie ?
Utilisation de précurseurs des macromolécules marqués par des isotopes radioactifs pour repérer des sites de synthèse et étudier le cheminement des composés biologiques
Quelles sont les étapes de l’autoradiographie ?
1) incorporation du précurseur du métabolisme à étudier
2) confection des préparations
3) autoradiographie
4) développement et lecture du film au microscope
