MEDICINA PERSONALIZZATA

Question 1

Cosa permettono di fare le nuove tecniche di sequenziamento?

Answer 1

Le nuove tecniche di sequenziamento, l’insieme delle caratteristiche del paziente, ovvero un insieme di genetica, epigenetica, stile di vita, sintomi e storia familiare della popolazione. Tutto ciò permette di stratificare i vari pazienti e di impostare la terapia nel modo migliore per ognuno di essi, per esempio diversificando il farmaco somministrato a due persone con la stessa malattia, ma con caratteristiche diverse.

Question 2

Quali sono gli obbiettivi della medicina personalizzata?

Answer 2

Essere predittiva, aumentando il numero di test e screening volti a individuare i pazienti nelle prime fasi della malattia. In secondo luogo, quello di modificare man mano la terapia sulla base dell’andamento della malattia, monitorando il cambiamento dei pathways patologici specifici durante il follow up del paziente.

La medicina personalizzata cerca di personalizzare i trattamenti, di massimizzare l’efficacia di questi, di evitare gli effetti collaterali e di essere “cost-effective”.

Question 3

Cos’è l’NCI-MATCH?

Answer 3

Stati Uniti e prende il nome di NCI-MATCH (Molecular Analysis for Therapy Choice). In questo studio si cerca come trattare il cancro al polmone, analizzando le mutazioni genetiche del singolo tumore al polmone da cui è affetto un determinato paziente. Per fare ciò si prende una sezione del tessuto tumorale, si estrae il DNA, si sequenziano i geni coinvolti nello sviluppo della neoplasia (nel caso del tumore al polmone sono ad esempio EGFR e K-Ras) e, se si trovano mutazioni caratteristiche, si agisce somministrando al paziente un farmaco specifico

L’obiettivo primario dello studio NCI-MATCH è quello di determinare la “objective response rate”

Question 4

Cos’è la “objective response rate”?

Answer 4

percentuale di pazienti in cui il tumore abbia una completa o parziale risposta al trattamento. Una particolare terapia è considerata promettente se almeno il 16% dei pazienti presentano regressione del tumore.

Question 5

Cos’è la “progression-free survival”?

Answer 5

percentuale di pazienti in cui la malattia non peggiora per almeno sei mesi

Question 6

Cos’è la “time to progression”?

Answer 6

tempo di progressione del tumore

Question 7

Quale mutazione di EGFR causa resistenza a certi oncoinibitori?

Answer 7

nel cancro al polmone l’oncogene EGFR presenta delle mutazioni degli esoni 18, 19, 20 e 21. Tra le varie mutazioni in cui è implicato EGFR, vi è la cosiddetta T790M, propria del codone 790 del gene. Questa mutazione conferisce la resistenza a importanti inibitori, tra cui erlotinib e gefitinib

Question 8

Quali tipi di trial esistono?

Answer 8

Esistono due tipi di trial per ottenere farmaci mirati, ossia umbrella trial e basket trial

Question 9

Come funziona l’umbrella trial?

Answer 9

Abbiamo tre pazienti diversi con cancro al polmone, ognuno con una differente mutazione (EGFR, K-Ras ecc…). In base alla mutazione che troviamo, somministriamo un farmaco diverso, dunque in questo caso ci saranno tre farmaci differenti: stesso tumore – diverse mutazioni – diversi farmaci

Question 10

Come funziona il basket trial?

Answer 10

abbiamo diversi tipi di tumore (nell’immagine al polmone, al fegato, al cervello e al colon), ma con la stessa mutazione (per esempio una mutazione dell’oncogene B-Raf, solitamente mutato solo nell’esone 15 del codone 600): diversi tumori – una stessa mutazione – uno stesso farmaco

Question 11

Cosa sono i “companion diagnostic tests”? A cosa servono?

Answer 11

le case farmaceutiche, producendo nuovi farmaci biologici per terapie mirate, hanno bisogno di un test “companion” o ancillare, in grado di stabilire, diversificando i pazienti, se quello specifico paziente sia adatto o meno alla somministrazione del farmaco.

Le funzioni dei companion diagnostic tests sono:
* capire se il tumore di un paziente abbia le specifiche mutazioni contro cui è diretto il farmaco e, quindi, individuare i pazienti per cui la terapia può veramente essere efficace
* individuare i pazienti le cui mutazioni possono aumentare il rischio di effetti collaterali
* capire se, durante il follow up del paziente, sia stata sviluppata resistenza verso il farmaco

Question 12

Cos’è la tecnica FISH?

Answer 12

utilizzo di sonde fluorescenti che riconoscono selettivamente un target scelto nel genoma

utile sviluppare dei test prognostici, che, attraverso specifici markers molecolari, siano in grado di descriverci le possibilità di sopravvivenza del paziente nel tempo

Question 13

Dimmi un esempio di utilizzo della FISH nei test prognostici.

Quali mutazioni hanno gli oligodendrogliomi?

Answer 13

pazienti affetti da oligodendroglioma, che sono tumori cerebrali a basso grado con una prognosi abbastanza buona a cinque anni dalla diagnosi. I pazienti che hanno una delezione sia nel braccio corto del cromosoma 1 sia nel braccio lungo del cromosoma 19 (linea verde nel grafico) hanno una percentuale di sopravvivenza maggiore rispetto a coloro che non hanno tali delezioni (linea blu). Pertanto, effettuando il test FISH per la co-delezione appena citata, posso individuare pazienti con una prognosi migliore.

I glioblastomi sono invece tumori cerebrali ad alto grado, dunque molto aggressivi: hanno una sopravvivenza molto più bassa, di 12-15 mesi generalmente, in rari casi si ha una sopravvivenza fino a 24 mesi

Question 14

Come funziona la FISH? Qual è il suo limite?

Answer 14

Si fa un prelievo delle cellule tumorali su cui si vuole indagare, è necessario contare un centinaio di nuclei nella sezione del tessuto prelevata dal paziente. Poi sceglie una sonda specifica per la regione che voglio identificare e la si marca con un colorante. Partendo dal cromosoma 1, si marca in rosso la sonda 1p (che si legherà al braccio corto del cromosoma 1) e si utilizza una seconda sonda come controllo, marcata in verde (sonda 1q). Successivamente si lascia avvenire l’ibridazione delle cellule tumorali prelevate con le sonde marcate. Completata l’ibridazione, si conta il numero di segnali verdi e rossi nella cellula tumorale: in una cellula senza delezione, si avranno due segnali verdi e due rossi (bisogna considerare il corredo diploide, ci sono due cromosomi 1 su cui le sonde si legano); in una cellula con delezione, si avrà un solo pallino rosso (in un cromosoma 1 è avvenuta la delezione nel braccio corto) e due pallini verdi di controllo (corrispondenti al braccio lungo, senza delezioni). Lo stesso procedimento viene effettuato per la delezione nel cromosoma 19.

limite principale della FISH è che questa tecnica permette di valutare solo piccole regioni del cromosoma per volta

Question 15

In quale percentuale di nuclei deve esserci delezione affinché sia definitiva?

Answer 15

se la delezione è presente nel 60-70% dei nuclei si considera definitiva.

Question 16

Come funziona il DNA microarray? Cosa si cerca di valutare?

Answer 16

si può valutare, in un unico esperimento, la presenza di delezioni o amplificazioni su ogni singola regione del genoma

1. Prelevamento di una sezione del tessuto tumorale;
2. Estrazione del DNA tumorale e del DNA sano del paziente;
3. Marcatura (tramite aggiunta di fluorocromo) verde del DNA tumorale e rossa del DNA normale;
4. Aspettare una notte l’ibridazione delle sonde.
5. Il giorno seguente sono eseguiti dei lavaggi per rimuovere il DNA non ibridato e grazie a uno scanner è valutata l’intensità di fluorescenza verde e rossa emessa per ogni pozzetto.

Se, per un determinato gene, DNA normale e tumorale si sono entrambi ibridati nelle stesse quantità con la sonda, allora tra i due non ci sono differenze in quella regione (non ci sono delezioni o amplificazioni nella cellula tumorale rispetto a quella normale). Se, invece, in uno spot abbiamo una prevalenza del colore verde sul rosso, allora in corrispondenza di quel gene avremo un’amplificazione.

Question 17

Cosa sono i microarray?

Answer 17

I microarray sono vetrini caratterizzati dalla presenza di migliaia di spot, in cui vengono posizionate delle sonde per moltissimi geni. Inizialmente i microarray venivano preparati sintetizzando degli oligonucleotidi rappresentativi di una determinata regione genomica che erano poi depositati sul supporto. Più avanti sono state costruite delle “stampanti a inchiostro” che consentono in breve tempo di avere sonde rappresentative di tutto il genoma

Question 18

Qual è il limite del DNA microarray?

Answer 18

può valutare solamente la presenza di amplificazioni e delezioni, quindi degli sbilanciamenti a livello dei diversi pozzetti, mentre non è in grado di individuare eventuali riarrangiamenti a livello del genoma (es. geni di fusione o traslocazioni)

Question 19

Come funziona l’Expression arrays?

Answer 19

si confronta l’espressione genica della cellula tumorale con quella della cellula sana.

La base di partenza non è il DNA, bensì l’mRNA, il quale viene poi retrotrascritto a cDNA. Pertanto, con questa tecnica si compie un’ibridazione del cDNA tumorale (marcato di rosso) e di quello sano (marcato di verde) con le sonde presenti negli spot dei vetrini. Successivamente si scannerizza e si analizzano i segnali colorati: se un gene è over espresso nel tumore, allora nello spot corrispondente avrò una prevalenza del colore rosso, viceversa se un gene è silenziato.

Question 20

Quale mutazione permette di classificare i gliomi di alto e basso grado?

Answer 20

classificare e distinguere gliomi di alto o di basso grado creando una sorta di soglia distintiva, grazie a software bioinformatici. Sono stati identificati vari geni che differenziano le due classi di glioma, in particolare è stato identificato come marcatore d’eccellenza IGFBP-2, sovra espresso nei gliomi di alto grado rispetto ai gliomi di basso grado in cui praticamente è assente.

Questo è stato dimostrato non solo con gli array di espressione ma anche con la real-time PCR e l’immunoistochimica

Question 21

Quanti e quali iclassi di breast cancer sono stati definiti tramite expression arrays e immunoistochimica?

Answer 21

4 classi:
* Luminal A: positivi al recettore di estrogeni e progesterone, HER2 negativi, e con livelli di Ki-67 molto basso; hanno una prognosi migliore, rispetto agli altri perché Ki-67 è molto basso;
* Luminal B: identici ai luminal A ma Ki-67 è più alto; hanno una prognosi leggermente peggiore
dei luminal A. Sono una classe particolare e quelli più studiati, perché hanno la prognosi più incerta;
* Basal like/triple negative: hanno tutti i marcatori negativi con Ki-67 abbastanza alto; sono quelli con prognosi peggiore, facciamo fatica a trattarli.
* HER2-enriched: hanno amplificazione dell’oncogene HER2. Per questi casi ci sono già delle terapie basate sull’anticorpo monoclonale Trastuzumab che cerca di limitare il problema.

Question 22

Quali sono i markers/antigeni dei breast cancer?

Answer 22

basandosi solo sugli array di espressione; anche tramite immunoistochimica. Si sono riscontrati come antigeni il recettore degli estrogeni, il recettore del progesterone, Ki-67 (marcatore di proliferazione: più è positivo più il tumore prolifera) e HER2 (oncogene amplificato in alcuni casi)

Question 23

Quale tp si adotta per ciascuna classe di breast cancer?

Answer 23

per i luminal A si fa solo la terapia ormonale, per i luminal B dipende dai singoli casi e per i basal-like e HER2 positivi è necessaria la chemioterapia.

Question 24

Quali oncogeni sono mutati nei breast cancer?

Answer 24

• p53 è mutata soprattutto nei basal-like e negli HER2. Molto meno nei luminal A e B, nei B un po’ di più che negli A.
• PI3k è mutato soprattutto nei Luminal A

Question 25

Cosa volevano studiare nello studio olandese?

Answer 25

sfruttando gli array di espressione, a cercare di individuare dei marcatori che possano prevedere la probabilità di sviluppare metastasi nell’arco di 5-10 anni, con l’intento di fare un test che possa dare un’idea della prognosi

necessità di tessuto fresco

sono riusciti a identificare un pannello di 70 geni che sono in grado di stabilire se queste donne avranno metastasi nell’arco del follow-up, che dura 10 anni

sorta di genomic imprinting che predispone il tumore a essere più o meno aggressivo fin dall’inizio (poor signature e good signature)

Question 26

Cosa volevano studiare nello studio americano?

Answer 26

tessuti in paraffina, sempre con lo stesso obiettivo di trovare un marcatore che ci consenta di distinguere pazienti con cattiva prognosi da pazienti con buona prognosi

gli americani hanno scelto un approccio supervisionale (sono partiti da geni che già si sapeva fossero coinvolti)

cercato nella letteratura i geni che potevano essere importanti nella differenziazione tra prognosi peggiore e migliore, hanno scelto soprattutto quei geni correlati alla proliferazione cellulare e al potenziale invasivo. In questo modo hanno creato un pannello di 16 geni che consente di distinguere donne ad alto rischio, a medio rischio e a basso rischio di avere recidive

classe di tumore alla mammella che maggiormente beneficia di questo test è il Luminal B in quanto sono i più difficili da collocare

sfruttare la real time PCR (che gli consente di partire da meno RNA)

Question 27

Che cos’è il Cetuximab? In quali tumori viene utilizzato? In quali mutazioni risulta inefficace?

Answer 27

Il Cetuximab è un anticorpo monoclonale con applicazione soprattutto per quanto riguarda il cancro del colon metastatico e del distretto testa-collo.
È stato sviluppato contro EGFR, noto oncogene coinvolto in diverse vie di segnalazione, tra cui il pathway delle MAP chinasi: una volta attivato dimerizza e manda un segnale a valle coinvolgendo K-RAS e B-RAF, MEK e MAPK i quali inviano segnali al nucleo per attivare proliferazione cellulare, sopravvivenza e angiogenesi. Se EGFR è costitutivamente attivo nel tumore, se si lega all’anticorpo monoclonale sarà bloccato a monte e quindi la cellula potenzialmente diminuisce il tasso di proliferazione. Il problema risulta essere quando ad essere mutati, e quindi costitutivamente attivi, sono K-RAS e B-RAF ovvero molecole a valle della cascata di segnalazione per cui Cetuximab non ha possibilità di funzionare.

Question 28

Quali sono gli hotspot mutazionali di K-RAS e B-RAF?

Answer 28

l’azienda che produce questi anticorpi monoclonali valutano se sono presenti pathway ben definiti che possono definire l’efficacia del farmaco. Nel caso di Cetuximab, viene somministrata la terapia solo se K-RAS e B-RAF non sono mutati, il che di solito avviene in hotspot mutazionali.
I principali hotspot di K- RAS sono nel codone 12, 13, 61. B-RAF invece ne ha uno solo nel codone 600 (il 95% dei pazienti ha la mutazione V600E, ovvero sostituzione di una valina con acido glutammico nel codone 600).

Question 29

Come si annotano le mutazioni puntiformi?

Answer 29

per annotare mutazioni puntiformi lo si fa a “livello proteico” con la dicitura p.Lys76Asn dove p sta per protein, seguito da un punto e dall’aminoacido wild-type (in questo caso la lisina), poi la posizione del codone (nell’esempio 76) e infine l’amminoacido in sostituzione (Asn ovvero l’asparagina). L’altra possibilità, meno frequente, è a livello della porzione codificante, ovvero il DNA. Nell’esempio troviamo c.76A>T dove c sta per “coding”, dopo il punto troviamo la posizione della base (contata dal punto 0 tenuto come l’inizio della trascrizione), la base wild-type, segno >, base mutata.

Question 30

Quali sono le principali mutazioni di K-RAS?

Answer 30

K-RAS: la regione codificante inizi nell’esone 2 in corrispondenza della tripletta ATG che codifica per la metionina.
Le principali mutazioni avvengono nel codone 12 (GGT) e nel 13 (GGC).

Question 31

Come si dividono i pz a seconda della tp Cetuximab anti-EGFR contro la mutazione di K-RAS?

Answer 31

stato di mutazione di KRAS con la risposta alla terapia con anticorpi monoclonali anti-EGFR. Nel 40% dei casi questi “non responder” sono dovuti a una mutazione di K-RAS, altri invece (10%) sono dovuti a mutazioni di B-RAF o ancora geni quali PTEN o altri ancora non riconosciuti. Al contrario, circa il 20% risponde alla terapia, una percentuale di casi abbastanza bassa