MBE

Question 1

Pregled post-transkripcione regulacije ekspresije gena

Answer 1

= Opšti princip reg. ekspresije - cis elementi i trans faktori
= Nema pasivne translacije transkriptoma u proteom - strogo regulisana
= Trans faktori - RBP i mnRNK
- Određuju sudbinu RNK
- Vezuju se za iRNK kotranskripciono
= Cis elementi - sekvence u iRNK koje vezuju RBP i mnRNK
- Same iRNK posjeduju ove elemente za sopstvenu regulaciju
- USER sekvence
- Kompletan set ovih USER sekvenci na iRNK = USER kod

= Post-transkripciona regulacija u nukleusu:
1) Splajsovanje (regulatori, splajsozom)
2) Alternativna obrada
- Alternativna inicijacija tsk (alt. promotori)
- Alternativno splajsovanje
- Alternativna terminacija tsk (alt. poliadenilacija)
3) Editovanje

• Alternativna obrada - large scale obrada transkripta
  > Uključivanje različitih segmenata sa prekursora u finalni transkript
  > 10-12 izoformi iRNK od jednog prekursora
  > Proteinske izoforme obavljaju iste, slične ili različite funkcije
  > Zavisi od faze razvića i od signala koje ćel. prima - dio integralnog programa razvića i diferencijacije ćel + omogućava odg. na sredinske stimuluse
• Editovanje - small scale obrada transkripta
  > Izmjena 1 NT drugim ili delecija/duplikacija 1 NT
  » Najčešće izmjene:
  1) A -> I
  2) C -> U

= U post-tsk fazi regulacije sastav trans faktora određuje sudbinu transkripta -> dinamičan, stalno se mijenja
= Neki faktori trajno vezani, neki se smjenjuju
= cis elementi + trans faktori -> sudbina:
1) Ulazak iRNK u tsl pool
2) Lokalizacija
3) Skladištenje
4) Privremeno povlačenje iz tsl poola
5) Degradacija

= Proteini i mnRNK -> krajnji recipijenti mnogih signala iz spoljne sredine preko transdukcije signala - lokalizuje se i ubrzava odgovor na signale u odnosu na to da krajnji recipijent bude genom ili proteini u nukleusu

Question 2

Pregled regulacije translacije

Answer 2

= Transkripti sa housekeeping gena i transkripti koji odgovaraju direktno na signal koji je primila ćelija -> jedini koji idu direktno da se translatiraju

= Ostali - transportuju se do određenog mjesta u ćeliji i translacija je reprimirana, bilo već u nukleusu ili po dolasku u citoplazmu

= Prvoj (pionirskoj) rundi translacije prethodi prvo veliko remodelovanje faktora iRNP

• Pionirska runda translacije služi za kontrolu kvaliteta iRNK
• Tokom nje se dešava drugo veliko remodelovanje faktora iRNP -> provjerava se postojanje prevremenog stop kodona, njegovo odsustvo, ili prisustvo drugih promjena koje onemogućavaju normalnu translaciju

= 2 vida reprimiranja translacije:

1) Globalno reprimiranje translacije (reprogramiranje translacije)

• Dio integralnog odgovora ćelije na stres
• Modifikuje se efikasnost tsl skoro svih iRNK u ćeliji - selektivno se translatiraju transkripti za proteine sa citoprotektivnom funkcijom
• Zasnivaju se na:

> > Modulaciji fosforilacije inicijacionih faktora translacije (kinazama i fosfatazama regulisanim stresom)

> > Proteolitičkoj degradaciji inicijacionih faktora translacije

• Modeli djelovanja:

> > Preko kinaze eIF2

> > Preko inhibicije mTOR puta

> > Preko tiRNK

• Formiraju se granule stresa, u koje se iRNK privremeno povlače iz translacionog pula

2) Utišavanje translacije specifičnih iRNK

• Pomoću miRNK
• RNK interferencijom
• Pomoću specifičnih RBP
• Ovi faktori prepoznaju specifične regulatorne elemente u iRNK, najviše u 3’UTR-u
• Reprimacija je ugl reverzibilna
• 2 strategije koje koriste RBP:

1. Vezivanje za regulatorne elemente (određene 2 strukture) u 5’UTR-u -> onemogućava ribozomu da pretražuje iRNK za start kodon

> > Ova represija se otklanja vezivanjem specifične miRNK

2. Vezivanje za regulatorne elemente u 3’UTR-u -> regrutuju proteine koji interferiraju sa funkcijom eIF4E i na neki način onemogućavaju formiranje kružne, translaciono sposobne strukture

> > Česće korišćena strategija

> > RBP se mogu vezivati kooperativno -> kombinatorna kontrola nad regulacijom

Question 3

Faktori iRNP čestica - vrste i uloga

Answer 3

= Faktori iRNP čestica - RBP i male nekodirajuće RNK
= Specifične i dinamične interakcije sa kodirajućim, nekodirajućim i netranslatirajućim regionima iRNK
= Specifičnost i afinitet vezivanja RBP za iRNK - zbog modularne organizacije RBD (kombinacija, raspored i kooperativno djelovanje različitih RBD u okviru jednog RBP)
- Dalje se modifikuju pomoćnim domenima RBP
= Oni određuju sudbinu iRNK
= Neki ostaju trajno vezani, neki samo u određenom periodu životnog ciklusa

Proteini iRNP koji se vezuju za 5’ kapu i poli-A rep

= Različiti u nukleusu i u citoplazmi
= 5’ kapa - neposredno nakon formiranja se vezuje odgovarajući protein u nukleusu (CBC20/80)
- U citoplazmi biva zamijenjen eIF4E proteinom (mada u skripti piše eIF2, vidjeću kad bude degradacija)
= Poli-A rep - poli-A vezujući proteini (PABP) koji su različiti u nukleusu (PABPN) i u citoplazmi (PABPC)

Proteini koji se vezuju cijelom dužinom iRNK

= Proteini Y boksa
= Učestvuju u regulaciji više procesa u metabolizmu iRNK - transkripcije, lokalizacije, translacije
= Niska koncentracija -> aktivira translaciju
= Visoka koncentracija -> inhibira translaciju

Proteini koji se vezuju za specifične pozicije nezavisno od sekvence

= Proteini EJC kompleksa
= Vezuju se za splajsovane iRNK 20-50 nt uzvodno od granica egzon-egzon
- Neposredno nakon splajsovanja
= Uloge:
- pomaže splajsozomu da prepozna egzone
- stimuliše transport iRNP iz nukleusa u citoplazmu
= EJC u ORF - stimuliše regrutovanje male SJ ribozoma (40s), + efekat na efikasnost tsl
= EJC u 3’UTR - signal za degradaciju ćelije mehanizmom degradacije posredovane prevremenim STOP kodonom
= Dinamična asocijacija sa iRNK

Proteini koji prepoznaju specifične sekvence

= Prepoznaju USER sekvence (netranslatirajuće elemente za regulaciju)
- Najčešće u 3’UTR-u (mada ih ima i u ostatku iRNK)
- Njihova kombinacija -> USER kod koji je specifičan za tu iRNK
- USER kod određuje potencijalni sastav faktora i time sudbinu iRNK
= Primjeri:
1) Proteini hn iRNP (heterogenih nukleusnih iRNP) -> iRNP koje nisu ni snRNP, ni snoRNP
2) Proteini SR - uloga u splajsovanju i regulaciji AS, stimulaciji tsl i pokretanja degradacije
3) Proteini TIA-1 i TIAR -> učestvuju u formiranju granula stresa

= iRNK sadrži kako informacije za sintezu proteina, tako i informacije za sopstvenu regulaciju

mikroRNK

= Mali regulatorni molekuli RNK
= Nastaju od jednolančanih prekursora u formi ukosnice koje sijeku proteini Droša i Dajser
= Interakcija sa proteinima Argonaut -> miRISC utišavajući kompleks
= Nesavršeno sparivanje sa RNK na osnovu komplementarnosti sekvenci
= Najčešće negativno reguliše translaciju i/ili je destabiliše
- Postoje i neke sa pozitivnim uticajem na tsl
> Kada dođe do reprimiranja tsl spec. iRNK vezivanjem RBP za USER u 5’UTR -> miRNK dovodi do disociranja
> miRNK stimuliše tsl sa TOP operona u fiziološkim uslovima (reg. sekv. u 5’UTR)

Question 4

RNK vezivni proteini (RBP)

Answer 4

= Proteini koji imaju ključnu ulogu u post-transkripcionoj regulaciji ekspresije gena
= Domenska struktura sa modularnom organizacijom:
- RNK vezujući domeni (RBD)
- Između njih veznici (linkeri)
- Pomoćni domen(i)

RNK-vezujući domeni

= Direktna interakcija sa RNK na osnovu specifične sekvence, pozicije ili 2 strukture
= Modularna organizacija - broj, kombinacija, raspored i kooperativno djelovanje RBD obezbjeđuju specifičnost vezivanja za iRNK
- Ovako se pravi jedinstvena površina koja može da interaguje sa specifičnom sekvencom ili sekundarnom strukturom u RNK

Linkeri (veznici)

= Niz AK između dva RBD
= Dugi veznici - nemaju specifičnu strukturu prije vezivanja za supstrat
- Omogućavaju prepoznavanje različitih target sekvenci na jednom ili više RNK molekula
= Kratki veznici - omogućavaju vezivanje 2 RBD za kontinuirani niz NT u ciljnoj RNK

Pomoćni domeni RBP

= Protein-protein interakcije, primanje signala pomoću post-translacionih modifikacija (koje zatim modulišu funkcionisanje RBP) ili katalitička funkcija (helikazna, dezaminozna, endonukleazna…)
= Primjeri:
- ADARB1 protein i proteinska kinaza R - posjeduju katalitičke domene
» Vezuju se za dsRNK
» Autoregulacija katalitičke aktivnosti - kada nisu vezani za dsRNK, RNK-vezujući domen inhibira katalitičku aktivnost
» Vezivanje za supstrat -> konformaciona promjena -> enzimski domen može da obavlja katalitičku funkciju

= Različiti RBP mogu prepoznavati:
- 5’ kapu i poli A rep
- Pozicije nezavisno od sekvence (EJC kompleks)
- Mogu se vezivati cijelom dužinom (Y boks)
- Specifične strukture ili sekvence (USER sekvence) (hn iRNP, proteini SR, TIA-1, TIAR)

Question 5

RNK operoni

Answer 5

= Prokariotski genomi -> DNK operoni (funkcionalno povezani geni koji se transkribuju sa jednog promotora i zajednički su regulisani)
- Policistronske iRNK
- Omogućava brz odg ćelije na signale

= Eukarioti - monocistronske RNK (1 gen -> 1 transkript)
- Kod eukariota se koordinacija sinteze funkcionalno povezanih gena vrši na nivou transkripata
= RNK operoni - skup transkripata koji kodiraju proteine koji učestvuju u istom metaboličkom putu/formiraju neki multimerni protein, i čija je translacija zajednički regulisana skupom RBP
= Funkcionalno povezane iRNK imaju iste regulatorne elemente koje prepoznaju isti RBP - sinhronizuju sintezu proteina sa njih

= Prednosti RNK operona:
- Mnogi proteini u eukariotskim ćelijama su multifunkcionalni
- Regulacija na nivou transkripata omogućava da 1 RNK može biti član više različitih RNK operona, zavisno od sastava RBP koji je regulišu
- Veliki broj regulatornih elemenata + kombinatorna kontrola (1 molekul u kombinaciji sa drugim molekulima reguliše ekspresiju različitih gena, rezultat zavisi od kombinacije regulatornih molekula) -> 1 RNK članica više RNK operona
- Povećava se fleksibilnost i plastičnost ekspresije -> povećava se informacioni potencijal genoma

Question 6

Alternativno splajsovanje - značaj i kompleksnost procesa

Answer 6

= AS = forma alternativne obrade koja podrazumijeva različito kombinovanje egzona
= Glavni mehanizam povećavanja informacionog potencijala genoma
= Rearanžman na velikoj skali
= Otkriveno na primjeru gena za imunoglobuline
= Podliježu mu transkripti koje prepisuje RNK Pol II (prekursori):
- iRNK
- neke lncRNK

= Rezultat AS:
- Alt. iRNK od kojih nastaju različite proteinske izoforme
- Alt. iRNK od kojih nastaju iste proteinske izoforme, ali su iRNK različito regulisane

= Služi i za ON-OFF regulaciju ekspresije gena - 1 iRNK izoforma se translatira u protein, a druga se degraduje mehanizmom NMD (prevremeni STOP kodon)

= AS - razvojno i tkivno specifična -> dio integralnog programa za razviće i diferencijaciju ćelija
= Obrasci AS su podložni promjenama na osnovu signala koje ćel. prima

= Šta podrazumijeva AS:
- Produžavanje egzona uključivanjem dijela introna (na osnovu korišćenja alternativnih 5’ i 3’ mjesta splajsovanja u intronima)
- Uključivanje/isključivanje kompletnog egzona (kasetni egzoni)
- Zadržavanje kompletnog introna
- [Istovremeno korišćenje 2 alternativna egzona (kada nastaje smjesa dvije različite iRNK)]

= AS u protein-kodirajućim regionima
- 80% događaja AS
- Različite proteinske izoforme sa istim, sličnim ili antagonističkim f-jama
= AS u 3’ i 5’ UTR-u
- Iste proteinske izoforme, ali se razl. iRNK izoforme različito regulišu i vezuju različite faktore -> razl. sudbina

= 30% događaja AS -> iRNK sa prevremenim STOP kodonom, pokreće se NMD mehanizam degradacije
- ON-OFF regulacija ekspresije

= Usložnjavanje procesa AS -> jako važno sa evolucionog aspekta
- Kod sisara najviše događaja AS u CNS

= Greške u AS izazvane različitim mutacijama -> oboljenja

= Konstitutivni vs regulisani događaji AS
- Neki geni uvijek daju više od 1 izoforme iRNK/proteina (uvijek se AS na određeni način), dok kod drugih obrazac AS zavisi od faze razvića, tipa ćelije i signala koje ona prima

= AS je precizno regulisan proces
= Zadaci splajsozoma:
- Prepoznavanje 5’ i 3’ mjesta splajsovanja
- Prepoznavanje mjesta grananja praćenog polipirimidinskim nizom
» Kratke, konsenzusne sekvence
- Raspoznavanje “pravih” od pseudoegzona (sekvence slične mjestima splajsovanja unutar introna)
= Faktori koji utiču na regulaciju AS:
- Jačina mjesta splajsovanja
» 5’ mjesto splajsovanja = konsenzusna sekvenca
»» Njegova jačina zavisi od komplementarnosti sa U1 snRNK
» 3’ mjesto splajsovanja -> jačina zavisi od dužine polipirimidinskog niza koji je nizvodno od mjesta grananja (duži niz -> jače mjesto)
- Kompeticija između mjesta splajsovanja (kod kasetnih egzona - primjer gena kod Drosophila, gdje se uključuje po 1 egzon iz 4 klastera alternativnih egzona)
» Mjesto spajanja - ispred svakog klastera egzona
» Mjesto selektovanja - ispred svakog zasebnog egzona
» Komplementarna - prave dvolančani hibrid -> egzon nizvodno od mjesta selektovanja biva uključen u zrelu iRNK
- Interakcija regulatornih elemenata u pre-iRNK sa trans faktorima (zavisi, dakle, i od njihovog sastava i koncentracije)
- Brzina elongacije transkripcije
- Lokalna struktura hromatina

Question 7

Regulacija AS - cis elementi i trans faktori

Answer 7

= pre-iRNK ima cis elemente (regulatorne sekvence) koje pomažu splajsozomu da napravi konačnu odluku o tome koje egzone uključuje u konačni transkript, a koje ne
= cis elementi:
- Pojačivači (intronski i egzonski) - vezuju pozitivne regulatore splajsovanja
- Prigušivači (intronski i egzonski) - vezuju negativne regulatore splajsovanja

= trans faktori:
- Aktivatori
- Represori

= Svaki egzon ima jedinstveni kod splajsovanja - jedinstvenu kombinaciju regulatornih sekvenci, i od kombinatornog efekta trans faktora koji se vezuju za ove sekvence zavisi da li će egzon biti uključen

SR proteini

= Pozitivni regulatori splajsovanja
= RNK vezujući domen
= Pomoćni domen = RS domen, koji ima AK ostatke koji bivaju fosforilisani, i tako se reguliše njihova funkcija
= RS domen ostvaruje interakcije sa proteinima iz U1 snRNP i U2AF i tako pomaže regrutovanje komponenti splajsozoma
= Mogu i da antagonizuju efekat represora
= Pored regulacije alternativnog splajsovanja, učestvuju i u regulaciji konstitutivnog splajsovanja
= Druge funkcije:
- Obilježavaju egzone u dugačkim pre-iRNK
- Neki ostaju vezani za iRNK nakon prelaska u citoplazmu i tu:
> Stimulišu translaciju
> Učestvuju u brzoj degradaciji iRNK sa prevremenim STOP kodonom (NMD model degradacije)

hnRNP (heterogene ribonukleoproteinske partikule)

= RNP koje u svom sastavu imaju neke RNK koje ne ulaze u sastav nekih drugih definisanih RNP, poput snRNP i snoRNP
= Negativni regulatori splajsovanja
= RNK vezivni domen
= Pomoćni domen bogat glicinom - favorizuju prepoznavanje sličnih domena u faktorima splajsovanja
= Učestvuju i u regulaciji konstitutivnog splajsovanja
= hnRNPI = PTB (Polypirimidine Tract Binding protein)
= Različiti modeli represije:
1) Direktno blokiranje regrutovanja komponenti splajsozoma - njihovo mjesto vezivanja se poklapa sa mjestom vezivanja komponenti splajsozoma (npr. PTB)
2) Direktna kompeticija između pojačivača i prigušivača splajsovanja - sekvence se djelimično preklapaju ili su jako blizu, te vezivanje represora onemogućava vezivanje aktivatora splajsovanja
3) Utišavanje savijanjem egzona - identične prigušivačke sekvence sa dvije strane egzona -> dimerizacija represora -> savijanje sekvence -> egzon nevidljiv za splajsozom
4) Utišavanje kooperativnim vezivanjem - vezivanje jednog visoko-afinitetnog represora stimuliše vezivanje drugih represora -> prekrivanje čitave egzonske sekvence -> egzon nevidljiv za splajsozom

Master regulatori splajsovanja

= Tkivno-specifični regulatori splajsovanja koji djeluju na veći broj događaja splajsovanja
= Važni za identitet ćelije i obrasce splajsovanja tipične za taj tip ćelije
= Proteini familija NOVA (neuroni), FOX (fibroblasti u mišićima), CELF (mozak, skeletni i srčani mišići), MBNL (skeletne i srčane mišićne ćel), Hu (neuroni)

= Relativna koncentracija trans faktora i njihovo kombinatorno djelovanje utiču na konačnu odluku o splajsovanju (neki faktori mogu djelovati i kao aktivatori i kao represori, zavisno od toga gdje se vežu i kakav je relativni sastav različitih faktora koji se vezuju)

Question 8

Značaj kinetike elongacije tsk za regulaciju AS

Answer 8

= Transkripcija i alternativna obrada su prostorno i vremenski povezani procesi -> međusobno se regulišu
= Koordinacija ovih procesa je obezbijeđena obrascem fosforilacije CTD Pol II, koji interaguje sa komponentama kompleksa za alt. obradu pre-iRNK
- Ovi faktori stimulišu elongaciju transkripcije, a neki faktori elongacije tsk utiču na alternativnu obradu

= Obilježavanje mjesta splajsovanja i njegovi događaji se odvijaju kotranskripciono -> procesi zavise od brzine elongacije
= Uticaj brzine elongacije - prostornim savijanjem transkripta, što utiče na dostupnost vezivnih mjesta za komponente splajsozoma
= Egzoni koji na neki način ostanu privezani za elongacioni transkripcioni kompleks bivaju uključeni u zrelu iRNK
- Glavni mehanizam “privezivanja” je brzina elongacije -> u odsustvu regulatora splajsovanja:
> Brz prelazak Pol II preko egzona -> njegovo isključivanje
> Spora transkripcija -> uključivanje egzona

Jačina mjesta splajsovanja
= 2 egzona, uzvodni sa slabijim 3’ mjestom splajsovanja, nizvodni sa jačim 3’ mjestom splajsovanja
= Brza transkripcija -> preskače se prvi egzon, zato što nema vremena da se regrutuju komponente splajsovanja na to mjesto
= Spora transkripcija -> prvi egzon uključen, zato što ima dovoljno vremena za regrutaciju komponenti splajsovanja, i favorizuje se uključivanje uzvodnog egzona

Regulatori splajsovanja
= 2 egzona sa jednakom jačinom 3’ mjesta splajsovanja
= Uzvodni intron sadrži slabi prigušivač
= Brza elongacija -> nema vremena za regrutaciju represora -> uključivanje oba egzona
= Spora elongacija -> regrutacija represora -> isključivanje prvog egzona nizvodno od introna

Question 9

Značaj strukture hromatina za regulaciju AS

Answer 9

= Lokalna struktura hromatina - ključni modulator AS i faktor koji može uticati na elongaciju transkripcije
= Načini:

1) Interakcija kompleksa koji utiču na strukturu hromatina (kompleksa za remodelovanje nukleozoma + enzima za modifikaciju N-krajeva histona) sa komponentama splajsozoma ili Pol II (koja regrutuje faktore splajsovanja) -> pomaganje njihovog asembliranja

2) Markiranje egzona pozicioniranjem nukleozoma - nukleozomi češći na granicama egzon-intron
- Izolovani egzoni sa dugim intronima - veće prisustvo nukleozoma nego kod bliže pozicioniranih egzona
- Egzoni koji se alternativno uključuju - bogatiji nukleozomima nego oni koji se alt. isključuju
- Jače pozicioniranje nukleozoma tamo gdje su slabija mjesta splajsovanja

3) Modifikacije histona - neke su prisutnije u egzonima nego u intronima, i mogu uticati na to da li će neki egzon biti uključen ili ne
- Utiču na regulaciju:
> modulacijom brzine elongacije
> regrutovanjem faktora splajsovanja (modifikacije = vezivna mjesta za adaptorne proteine, koji regrutuju faktore spl.)
» Slučaj sa adaptornim proteinom za PTB - jedna modifikacija regrutuje adaptorni protein (zatim PTB -> isključivanje egzona), druga ga ne regrutuje (nema PTB -> uključivanje egzona)

4) Metilacija DNK - direktno ili indirektno (preko modifikacije histona sa kojom je povezana) utiče na odabir mjesta splajsovanja

5) Duge ncRNK - neke su uključene u formiranje strukture hromatina -> asociraju se sa regionima gena koji se alternativno splajsuju

= Ovi različiti epigenetički mehanizmi regulacije se kombinuju
- 1 gen sa 3 egzona:
> 2 se konstitutivno splajsuju
> 1 alternativni egzon
- Oni koji se splajsuju, na nukleozomima koji ih obilježavaju imaju određenu modifikaciju
- Alternativni:
> Ako ima modifikaciju, Pol II usporava preko njega -> uključen
> Ako nema modifikaciju, Pol II “preleti” -
isključen

= Ove modifikacije nisu samostalne determinante ishoda splajsovanja, nego njegovi modulatori
= Epigenetičke modifikacije rade zajedno sa cis-elementima kako bi pojačali njihov efekat (npr. češće su kod slabih mjesta splajsovanja)

= Složena mreža komunikacije između iRNK i hromatina

= Epigenetički mehanizmi -> memorija za obrazac alternativnog splajsovanja
- Obrazac alternativnog splajsovanja nije determinisan cis-elementima, jer su oni isti u svakoj ćel.
- Epigenetički mehanizmi dopuštaju ćelijskoj liniji da “pamti” obrazac splajsovanja, kao i da ga promijeni tokom razvića

Question 10

ADAR proteini

Answer 10

= ADAR proteini = adenozin dezaminaze
- Dezaminacija adenozina -> inozin
- Proces editovanja

= 3 gena za ADAR proteine -> ADAR 1, 2, 3 (ADAR, ADARB1 i ADARB2)
= Esencijalni geni

= Domeni:
- RNK-vezivni domen
> Vezivanje za dvolančanu strukturu RNK
- Pomoćni (katalitički) domen
- Pomoćni domeni vezani za specifičnu f
> Npr. zed-alfa domen kod ADAR1

= ADAR 1 i 2 - eksprimiraju se u skoro svim ćelijama, najviše u mozgu
- Aktivni u formi homodimera
= ADAR1 - 2 izoforme:
1) ADAR1L
2) ADAR1S
= ADAR3 - eksprimira se samo u mozgu
- Ne formira homodimere
- Nedovoljno poznata f - vrv represor aktivnosti ADAR1 i 2
= Svi se lokalizuju u nukleusu, osim ADAR1L (u citoplazmi, inducibilna forma - formira se samo kad je povećana produkcija interferona)

= Prepoznaju intramolekulske dvolančane strukture duže od 20bp
= Efikasnost editovanja - zavisi od stabilnosti i strukture dsRNK
- Duge perfektne dsRNK -> nespecifično editovanje na mnogo mjesta (hipereditovanje)
- Kraće ili duže neperfektne dsRNK -> specifično editovanje, na manjem broju tačno određenih mjesta

= Rezultat aktivnosti = promjena informacionog sadržaja RNK (ako je u okviru kodirajućeg regiona)
- Inozin se sparuje sa citozinom (splajsozom i translaciona mašinerija ga “čitaju” kao G guanozin)
= Moguća i promjena sekundarne strukture i stabilnosti iRNK -> promjena njene sudbine (promjena interakcije sa proteinima)
- Naročito često kod hipereditovanja

Question 11

Mjesto specifično A-I editovanje

Answer 11

= Specifična dezaminacija jednog ili nekoliko adenozina, na tačno određenim pozicijama (tačno se zna koji se adenozin edituje)
= U protein kodirajućim regionima najčešće => rekodiranje
= Kraće ili duže neperfektne dsRNK
= Zbog specifičnosti - poznati efekti ovog editovanja na f-ju proteina

= Funkcija = diverzifikacija proteoma
= Rezultat: proteinske izoforme koje vrše istu funkciju sa različitom efikasnošću

= Primjer:
- AMPA receptor za glutamat, koji je po prirodi jonski kanal za Ca2+
> Uloga: brza ekscitatorna transmisija u neuronima CNS
> Editovanje se dešava u Q/R mjestu (promjena 1 AK Gln -> Arg)
> Rezultat:
» R (arginin) čini kanal nepropustljivim za Ca2+
» Promjena unutarćelijskog transporta subjedinica kanala i njihovog asembliranja

Question 12

Hipereditovanje

Answer 12

= Visokoefikasno i neselektivno editovanje velikog broja adenozina
= Duge perfektne dsRNK
- Ugl. invertovani Alu ponovci u intronima i netranslatirajućim dijelovima gena

= Uloge:
- Raspoznavanje sopstvene od strane dsRNK (retrovirusi i RNK transpozoni)
- Diverzifikacija proteoma
- Regulacija ekspresije konkretnih gena
- Suprimiranje stvaranje circRNK (hipereditovani transkripti remete sparivanje introna koji okružuju egzone -> onemogućeno splajsovanje unazad)

= Detekcija dsRNK u ćel pomoću ćelijskih senzora -> aktivacija proteina MAVS -> aktivacija puta za produkciju interferona -> suprimirana virusna infekcija
= Hipereditovanje sopstvene dsRNK -> onemogućena polimerizacija MDA5 (što aktivira MAVS) -> ne aktivira se MAVS -> nema prenosa signala za produkciju interferona

= Evolutivna uloga hipereditovanja -> egzonizacija Alu elemenata -> nastanak novih egzona
- Nastanak novih mjesta splajsovanja pomoću editovanja u invertovanim Alu ponovcima

= Tudor-SN -> degradacija hipereditovanih transkripata
- Prepoznaje RNK koje sadrže inozin -> preferencijalno sječenje oba lanca dsRNK sa većim brojem I-U BP
- Kontrola ekspresije gena koji nose ponovljene Alu ili LINE sekvence

= Regulacija ekspresije konkretnog gena - hipereditovana RNK se može zadržati u iRNP i otići u citoplazmu tek kada ćel. dobije signal da joj je potrebna njena ekspresija
- Npr. Gen za katjonski transporter
> 2 izoforme iRNK:
1) Kratak 3’UTR - direktno se transportuje u citoplazmu
2) Dug 3’UTR sa invertovanim Alu ponovcima - hipereditovanje i zadržavanje u RNP (nukleusnom tijelu = parapjega*)

• Parapjega - nukleusno tijelo (RNP) koja vrši nukleusnu retenciju hipereditovanih transkripata
  = Potka = 1 lncRNK
  = Za potku se vezuju različiti proteini, koji zatim mogu da vežu hipereditovane transkripte i zadrže ih tu
  = Markeri za započet proces diferencijacije - nukleusna retencija ugl. u diferenciranim ćelijama

> Signal za povećanu potrebu za transporterom dolazi do parapjege -> odsijecanje dugog 3’UTR-a + dodavanje novog poli-A repa -> nastaje kratka izoforma iRNK
Katjonski transporteri - ćeliju snabdijevaju prekursorima za NO -> odgovor na stres

Question 13

Translaciona regulacija specifičnih iRNK

Answer 13

= Reprimacija translacije - reverzibilna
- Zaustavlja se do trenutka kada je ćel. potreban taj specifičan protein

= Načini regulacije tsl spec. iRNK:
- Pomoću specifičnih RBP
- RNK interferencijom
- Pomoću miRNK

RBP

= 2 strategije:

1. Vezivanje za USER sekvence u 5’ UTR-u

• Ugl. prepoznavanje 2 struktura
• Blokira ribozom od pretraživanja iRNK za START kodonom
• Uklanja se pomoću miRNK

2. Vezivanje za USER sekvence u 3’ UTR-u

• Češća strategija
• Regrutuju proteine koji interferiraju sa f-jom eIF4E
• Molekulski mehanizmi:
  1) Kompetitivna inhibicija vezivanja eIF4E za eIF4G
  > Proteini 4EBP - jak afinitet za vezivanje eIF4E
  > Postoji kružna struktura, ali nema tsl - onemogućeno vezivanje eIF3 za eIF4G -> nema regrutacije male SJ ribozoma
  > Aktivacija tsl - fosforilacija 4EBP -> gubljenje afiniteta za eIF4E -> veže se eIF4G

2) Kompetitivna inhibicija vezivanja eIF4E za 5’ kapu
> Regrutacija alt. proteina koji se vezuje za 5’ kapu umjesto eIF4E - nema sposobnost vezivanja eIF4G
> Reprimacija tsl maternalnih iRNK u ranom embrionu (oocite)

3) Citoplazmatično skraćivanje poli-A repa
> CPE elemente u 3’ UTR-u prepoznaje CPEB protein -> regrutacija PARN deadenilaze -> tsl. neaktivnost (nedovoljno PABP -> nemogućnost interakcije sa eIF4G)
> Suština - previše skraćen poli-A rep -> nema dovoljno PABP da bi se ostvarila stabilna kružna struktura

Question 14

Unutarćelijski transport iRNK i lokalizovana translacija

Answer 14

= Prostorna regulacija translacije - postiže se unutarćel. transportom iRNK do tačno određenih mjesta u ćel. i njihovom lokalizovanom translacijom
= Fleksibilnost u određivanju tačnog mjesta i vremena sinteze proteina
= Fenomeni konzervisani kod vrsta
- Integralni za:
> Određivanje sudbine ćel
> Kretanje ćel.
> Morfologiju i funkcionalnu polarizaciju ćel. (naročito visoko polarizovanih)

= Transport - aktivan, usmjeren
- Motorni proteini i polarizovan citoskelet
- iRNK se usidrava i štiti se od degradacije

= Procesi povezani za reprimiranjem translacije -> tsl se vrši samo na krajnjem odredištu, u skladu sa signalima koje ćel. prima (prostorna i vrem. kontrola)

= Kod za lokalizaciju - USER (regulatorne) sekvence na iRNK
- Prepoznaju ih faktori -> formiranje L-RNP sa iRNK
- Faktori L-RNP + drugi proteini -> instrukcije za citoskelet, motorne proteine i translacioni aparat - o tome gdje ćel. treba da se transportuje i kada treba da se aktivira tsl
- Različiti signali mogu modifikovati transport L-RNP -> prostorno i vremenski regulisana sinteza u skladu sa potrebama ćel

= Translaciona represija - pomoću represora
= Aktivnost faktora za lokalizaciju+transport iRNK i represiju tsl - koordinisano regulisana
1) Jednim faktorom
2) Pomoću više faktora

= Funkcionalno povezane RNK - kolokalizovane -> RNK operoni
- Identični faktori regulacije
- Prednosti:
1) Zajednička regulacija
2) Lakše formiranje makromolekulskog kompleksa koji kodiraju zbog fizičke blizine
3) Viša koncentracija rastućih polipeptida -> promovisanje kotranslacione interakcije i brže formiranje kompleksa
- Sprječava pojavu alternativnih puteva savijanja proteina
- Sprječava neželjene interakcije polipeptida sa kompetirajućim komponentama
- Ubrzava odg. na signale

Primjer - iRNK za betaaktin
= Sinteza monomera aktina
= Lokalizuje u mjestima polimerizacije aktina -> tamo gdje su monomeri potrebni
= Mioblasti: iRNK za betaaktin se lokalizuje u vodećem kraju ćel -> polimerizacija betaaktina u aktinsku citoskeletnu mrežu -> gura ćel. memb. -> kretanje ćel.
= Koordinacija lokalizacije i represije tsl - 1 faktor
- Vezuje se za regulatorni element u 3’UTR - zipkod
- Vezuje se tokom tsk -> formirani L-RNP se transportuje iz nukleusa u citoplazmu -> asembliranje sa motornim proteinima i transport niz citoskelet -> vodeći kraj ćel -> aktivacija tsl
- Aktivacija tsl - pomoću kinaze
> Fosforilacija faktora -> on napušta iRNK -> omogućeno asembliranje tsl mašinerije -> sinteza aktina

Question 15

Globalna regulacija translacije - Proteinske kinaze eIF2

Answer 15

= Proteinske kinaze eIF2 = senzori stresa
- Fosforilacija kinaza eIF2 - marker stresa
- Defosforilacija kinaza eIF2 - marker reparacije stresa

= eIF2 + GTP + inic. tRNK = ternarni kompleks
- Vezuje se za dio budućeg P mjesta na maloj SJ ribozoma -> pretraživanje RNK za START kodon -> inic. tRNK nalazi kodon za svoj antikodon -> pridruživanje velike SJ ribozoma -> prvi checkpoint
- Prvi checkpoint: ako je ispravno sparivanje kodon-antikodon, GTP postavljen tako da interaguje sa faktor vezujućim centrom VSJ ribozoma -> hidroliza GTP -> eIF2-GDP (inaktivan eIF2)

= Recikliranje eIF2 -> mora se zamijeniti GDP GTP-om da bi mogao opet da se koristi
- Pomoću faktora eIF2B (faktor za zamjenu G nukleotida)
- Fosforilacija eIF2 od strane kinaza -> povećanje afiniteta eIF2 za eIF2B -> ostaje vezan
- Manja koncentracija eIF2B u ćel. nego eIF2 -> ubrzo fosforilisani eIF2 zarobljavaju sve eIF2B u ćel -> onemogućena reciklaža eIF2 faktora -> reprimiranje translacije svih iRNK čija tsl zavisi od 5’ kape

= Globalna represija translacije proteina (reprogramiranje translacije)
= iRNK na koje ne utiče ovo - iRNK sa IRES sekvencama - sekvence koje direktno regrutuju ribozome (bez potrebe za skeniranjem) i omogućavaju tsl pri odgovoru na stres
- iRNK sa citoprotektivnih proteina

= Fosforilisani eIF2, osim što zarobljava eIF2B, takođe indukuje formiranje granula stresa

= Proteinske kinaze:
1) HRI - zaustavlja sintezu globina ukoliko nije usklađena sa sintezom hema -> odgovor na osmotski i toplotni šok
2) PEKR - senzor za virusne infekcije

Question 16

Globalna regulacija translacije - mTOR

Answer 16

= mTOR = proteinska kinaza koja stimuliše rast ćelije stimulacijom translacije
= Globalno reprogramiranje kao odg na stres -> inaktivacija mTOR kinaze
= Odgovara na veliki broj signala koji ćel prima
- Uloga: usklađivanje rasta ćelije i aktivnosti proteina sa signalima koje ćel. prima

= Aktivan mTOR - stimuliše translaciju djelovanjem na dvije grupe supstrata:

1) Supstrate koji direktno regulišu translaciju:
- 4EBP - fosforilacijom gubi afinitet za eIF4E, čime se omogućava vezivanje eIF4G i translacija
- S6K (kinazu S6) - fosforilacijom se olakšava regrutacija ribozoma na TOP operon - operon sa koga se sintetišu proteini translacione mašinerije

2) Supstrate koji indirektno regulišu translaciju: TF, tRNK, faktori translacije…

= Regulacija aktivnosti mTOR-a:

1) Rheb protein:
- Rheb-GTP -> aktivacija mTOR
- Rheb-GDP -> ne aktivira se mTOR

2) Heterodimerni kompleks tuberozne skleroze (TSC1/TSC2 kompleks):
- Aktivan -> hidroliza GTP na Rheb -> Rheb-GDP -> neaktivan mTOR
- Neaktivan -> nema hidrolize -> Rheb-GTP -> aktivan mTOR

= Fiziološki uslovi:
- Faktori rasta -> receptor -> inhibirana aktivnost TSC1/TSC2 -> nema hidrolize GTP -> Rheb-GTP -> aktivan mTOR

= Stres/loši energetski uslovi:
- Aktivacija aktivnosti TSC1/TSC2 -> hidroliza GTP -> Rheb-GDP -> inaktivacija mTOR

Question 17

Globalna regulacija translacije - tiRNK

Answer 17

= tiRNK - RNK molekuli formirani sječenjem tRNK na dvije polovine od strane angiogenina
= Angiogenin - protein koji utiče na diferencijaciju ćelija endotela krvnih sudova
- Važan i za odg. ćel. na stres
- Ćelija može da ga sekretuje -> signal za okolne ćel. da pokrenu stresni odgovor

= tRNK -> 2 tiRNK: 5’ i 3’ tiRNK
- 5’ tiRNK - uloga u reprimiranju translacije

= 5’ tiRNK ima na 5’ kraju TOG sekvencu (5 G NT) -> G kvadripleks struktura
- Tetramolekularni 5’ tiRNK kompleks -> interakcija sa proteinom Y-boksa YB1 (sa domenom za int. sa eIF4G) -> eIF4G napušta iRNK -> YB1 protein se vezuje za iRNK -> pokretanje agregacije i formiranja granule stresa

= Granula stresa koja se formira efikasnije zarobljava iRNK sa IRES sekvencama nego iRNK čija tsl zavisi od 5’ kape

Question 18

Granule stresa

Answer 18

= Granule stresa = RNP koje se sastoje od RNK molekula, inicijacionih faktora tsl i drugih proteina koji stupaju u međusobne interakcije i prave agregate
- Važni TIA1 i TIAR proteini - imaju neuređene domene nalik prionima -> međusobna interakcija -> agregacija -> nukleacija granula stresa
= Fazno separatisani agregati -> organele bez membrane
= Sastav granula stresa dinamičan - proteini ulaze i izlaze
= Proteini markeri granula stresa:
- eIF4E
- eIF4G
- eIF3
- Mala SJ ribozoma

= Fiziološki okidači za formiranje granula stresa:
- Fosforilacija eIF2
- Inaktivacija mTOR
- Stvaranje tiRNK

= Fosforilacija eIF2
- Zaustavljanje procesa tsl -> vezivanje RBP za različite iRNK i njihova međusobna interakcija (naročito važni TIA1 i TIAR) -> agregacija, nukleacija granula stresa

= Stvaranje tiRNK
- 5’ tiRNK vezuju YB1 -> disocijacija eIF4G i vezivanje YB1 za iRNK -> pokretanje agregacije i formiranja granule stresa

= Povlačenje RNK u granule stresa - reverzibilan proces
- Ako ćel. adekvatno odg. na stres i oporavi se -> deasembliranje granula stresa -> RNK se vraćaju u translacioni pool
- Ako se ćel. ne oporavi -> proteini iz granula stresa signaliziraju pokretanje programirane ćelijske smrti

= Globalnost regulacije translacije - reprogramiranje tsl:
- iRNK iz TOP operona (važan za sintezu proteina tsl mašinerije) - imaju u 5’UTR-u sekvencu za koju kompetiraju jedna miRNK i TIA protein
- Fiziološki uslovi:
> miRNK se veže za sekvencu u 5’UTR -> stimulacija tsl
- Stres:
> Zaustavljena aktivnost mTOR + zarobljavanje eIF2B -> smanjena produkcija ribozomskih proteina i stopa tsl generalno -> vezivanje TIA proteina za sekvencu u 5’UTR -> formiranje granula stresa

= Poremećaji u asembliranju i deasembliranju granula stresa (npr. nemogućnost deasembliranja) -> poremećaji poput SMA i ALS-a
- ALS - svi proteini sa mutacijama učestvuju u metabolizmu RNK i reverzibilnoj regulaciji tsl

Question 19

Pregled puteva degradacije i kontrole kvaliteta iRNK

Answer 19

= Neke RNK - dugoživeće - iRNK sa housekeeping gena
- Potrebne za održavanje životnih funkcija i identitet ćelije
= Druge RNK - kratkoživeće - iRNK potrebne za neku specifičnu funkciju, kao odgovor na trenutne potrebe ćel.
- Nagla tsk, nagla degradacija

= Kod kratkoživećih RNK - degradacija kao vid regulacije ekspresije

= Funkcije degradacije:
- Kontrola ekspresije specifičnih iRNK
- Kontrola bazalne ekspresije gena
- Kontrola kvaliteta iRNK
- Odbrana od virusa

= Način na koji će se neka iRNK degradovati zavisi od:
- Koja se mašinerija za degradaciju najefikasnije regrutuje
- Koji je set enzima aktivan u tom tipu ćel.

= Mehanizmi za degradaciju:

1. Putevi degradacije zavisni od deadenilacije
   - Najveći br. iRNK
   - Deadenilaze u kompeticiji sa PABP - u svakoj rundi translacije se malo skraćuje poli-A rep
   - Skraćivanje poli-A repa dovodi do nestabilnije interakcije PABP sa faktorima inicijacije i 5’ kapom -> linearizacija iRNK - destabilizacija

1.1 Smjera 3’-5’:
- Deadenilaze degraduju poli-A niz dok ne dođe do 10ak A -> degradacija egzozomom (ne može da degraduje 5’ kapu) -> regrutacija enzima za otklanjanje 5’ kape -> degradacija ostatka iRNK u 5’-3’ smjeru

1.2 Smjera 5’-3’
- Deadenilacija poli-A repa -> prvo se vezuje kompleks za otklanjanje 5’ kape -> egzonukleazna degradacija 5’-3’ smjera

2. Put degradacije nezavisan od deadenilacije smjera 5’-3’
   - iRNK koje se regulišu na nivou degradacije
   - 5’UTR sekvence u iRNK vezuju RBP -> regrutacija kompleksa za otklanjanje 5’ kape -> egzonukleazna degradacija u 5’-3’ smjeru
   - Ne zavisi od dužine poli-A repa
3. Putevi endonukleolitičke degradacije
   - iRNK koje se degraduju nezavisno od dužine poli-A repa i posjedovanja 5’ kape
   - Endonukleolitičko sječenje -> slobodni 5’ i 3’ krajevi -> egzonukleazna degradacija
   - Poseban oblik - putem malih nekodirajućih RNK u kompleksu sa AGO proteinom

Kontrola kvaliteta

= Omogućava ćeliji da izbjegne translaciju nefunkcionalnih iRNK (nastale mutacijama, greškama u transkripciji, obradi, oštećenjem…)
- Omogućava se provjeravanjem ispravnosti iRNK u različitim fazama ćel. ciklusa
= Zavisna od pionirske runde translacije
- Ukoliko ribozom ne može da obavi pravilnu terminaciju tsl ili ostane zarobljen -> regrutacija mašinerije za degradaciju posredstvom faktora za oslobađanje ribozoma i interakcija sa upražnjenim A mjestom u ribozomu

= 3 tipa degradacije:

1) Degradacija iRNK posredovana prevremenim STOP kodonom - NMD
2) Degradacija iRNK posredovana odsustvom STOP kodona - NSD
3) Degradacija iRNK na kojima je ribozom zastao - NGD

Question 20

Degradacija iRNK zavisna od deadenilacije

Answer 20

= Najveći br. iRNK - normalno translatirajuće iRNK koje se troše tokom svake runde translacije
= Nukleaze koje vrše deadenilaciju = deadenilaze

= 3 vrste deadenilaza:
- Dominantna deadenilaza - uglavnom vrši deadenilaciju
- Druge dvije učestvuju u procesima regulacije ekspresije specifičnih iRNK i u specifičnim situacijama kontrole kvaliteta

= Deadenilaze kompetiraju sa PABP
- Veći intenzitet translacije -> manje šanse za djelovanje deadenilaze
- Smanjen intenzitet -> deadenilaza “napada” transkript
= Smanjenje poli-A repa -> destabilizacija interakcije PABP sa 5’ kapom i faktorima inicijacije -> linearizacija iRNK

2 moguća puta:

1. 3’-5’
   = Regrutacija egzozoma - egzonukleaza - multisubjedinična struktura u obliku bureta sa centralnom šupljinom
   = Regrutuje ga SKI2 protein - RNK helikaza koja otklanja 2 strukture i proteine vezane za RNK
   = Specifični načini regrutacije - u regulisanim vidovima degradacije egzozomom:
   1) RBP proteinima koji se vezuju za ARE i GRE sekvence
   - ARE i GRE - sekvence u 3’ UTR kratkoživećih iRNK koje vežu proteine koji regrutuju specifične deadenilaze i egzozom
   2) Preko Ski7 proteina koji stupa u interakciju sa upražnjenim A mjestom ribozoma -> u NSD degradacionom putu u kontroli kvaliteta
   = Egzozom degraduje dok ne ostane iRNK-oligonukleotid
   = Regrutacija proteina za otklanjanje 5’ kape
   - DcpS - pirofosfataza čiji je supstrat oligonukleotid - uklanja 5’ kapu
   = Završavanje degradacije egzonukleazom
2. 5’->3’
   = Veže se za P tijela
   = Nakon smanjenja poli-A repa se prvo uklanja 5’ kapa
   - Holoenzim Dcp1-Dcp2 -> Dcp2 je pirofosfataza, Dcp1 stimuliše njen rad
   - Supstrat za Dcp1-Dcp2 - dug polinukleotidni niz
   = Dcp1-Dcp2 je uvijek u kompeticiji sa eIF4E -> kada je dovoljno destabilizovana struktura, dobija priliku da se veže i obavi svoju katalitičku aktivnost
   - Mora prvo da disocira eIF4E -> povezano sa ulaskom u P tijelo, gdje su zapravo i skoncentrisani kompleks za uklanjanje 5’ kape i 5’-3’ egzonukleaza Xrn1
   = Otklanjanje 5’ kape -> degradacija u 5’-3’ smjeru pomoću Xrn1 egzonukleaze
   = Služi za degradaciju nekih specifičnih iRNK

Question 21

Degradacija iRNK nezavisna od deadenilacije

Answer 21

= Degradacija u smjeru 5’-3’
= Sekvence u 5’UTR - direktna regrutacija enzima za otklanjanje 5’ kape
= Dcp1/Dcp2 holoenzim (svi podaci u prošlom pitanju)
- Prepoznaje supstrat po interakciji sa 5’ kapom i iRNK
= Uklanjanje 5’ kape -> degradacija egzonukleazom Xrn1
= Razlika u odnosu na prošli mehanizam - nema skraćivanja poli-A repa
(nigdje ne piše ali vrv zbog enzima) isto u P tijelima
= Ne može se degradovati iRNK na kojoj je već eIF4E

Question 22

P tijela

Answer 22

= P tijela = dinamične RNP koje lokalizuju u citoplazmi i u kojima se vrši skladištenje, utišavanje i degradacija iRNK
= Ulazak iRNK u P tijelo ne mora da znači degradaciju -> može da se skladišti
= iRNK može izaći iz P tijela kada ćelija primi signal da je potrebna njena tsl

= Jezgro P tijela - mašinerija za 5’-3’ degradaciju (Dcp1/Dcp2 kompleks, Lsm kompleks, Xrn1 egzonukleaza
= Dodatne komponente P tijela - sastav se mijenja zavisno od toga koje su iRNK u P tijelu
- Proteini uključeni u NMD
- miRNK i proteini koji se asociraju sa miRNK
- eIF4E-4EBP (utišavanje translacije)

= Odnos translacije i degradacije zavisi od dinamične ravnoteže između iRNP na polizomu i u P tijelu
- Održava se ravnoteža između translacionog kapaciteta ćel. i poola translaciono aktivnih iRNK

= Lokalizacijom mašinerije za degradaciju u P tijelima se:
1) Povećava efikasnost degradacije
2) Sprječava degradacija tsl akt. iRNK

= P tijela prvo otkrivena u oocitama (polarna tijela - maternalno skladištenje iRNK i malih nekodirajućih RNK) i u neuronima (neuronalne granule - reprimiranje translacije i transport iRNK)

Question 23

Kontrola kvaliteta iRNK - NMD

Answer 23

= Nonsense mutacije uvode prevremeni STOP kodon
= Ćelija prepoznaje ovakve iRNK tokom pionirske runde translacije
= Za iRNK vezan EJC kompleks koji markira egzon-egzon granice
- Vezuje se u nukleusu kotranskripciono, i ostaje vezan sve do prve runde translacije
= Ribozom se “kreće” po iRNK i “ljušti” EJC proteine
- Dođe do STOP kodona -> ako u 3’ UTR-u, iza njega, i dalje ima EJC - prevremeni STOP kodon
- Jedan od proteina iz EJC kompleksa regrutuje još dva proteina:
1) Stimulišu hidrolizu polipeptida
2) Disocijacija velike SJ ribozoma
3) Regrutuju kompleks za uklanjanje 5’ kape (Dcp1/Dcp2)
-> Pokreće se 5’-3’ degradacija

= NMD može biti i mehanizam za ON/OFF regulaciju ekspresije gena - preko alternativnih transkripata jednog gena nastalih AS

Question 24

Kontrola kvaliteta - NSD i NGD

Answer 24

NSD - Non-Stop Mediated Decay

= Nema STOP kodona
= Ribozom translatira sve do kraja transkripta - i poli-A rep -> polilizinski niz u proteinu
- Ne može da dođe do recikliranja ribozoma jer se ne regrutuju terminacioni faktori - zarobljavanje ribozoma
= Upražnjeno A mjesto prepoznaje protein Ski7, koji regrutuje egzozom
- 3’-5’ degradacija
- Oslobađanje ribozoma i polipeptida
= Polilizinski niz - signal za proteozom da degraduje polipeptid

NGD - No-Go Mediated Decay

= Zbog oštećenja na iRNK ribozom zastaje tokom translacije -> zarobljen ribozom
= Upražnjeno A mjesto - regrutacija specifičnih proteina koji ga prepoznaju -> regrutacija endonukleaze
- Endonukleolitička degradacija
- Fragmente iRNK “dokrajče” egzonukleaze

Question 25

Pregled epigenetičkih oznaka RNK

Answer 25

= Kod rRNK i tRNK - modifikacije nukleozida bitne za funkcionalnost
- Prisutne na tačno određenim pozicijama
- Većinom statične - uvode se tokom obrade pre-rRNK i pre-tRNK

= Modifikacije iRNK (transkriptoma) - dinamične
- Raznovrsnije od epigenetičkih oznaka
- Senzori za signale - odgovaraju na razvojne i sredinske stimuluse
- Modifikacije transkriptoma - uključene u samu obradu pre-iRNK
- Utiču na ćel. procese, razviće, patologije - funkcionalna plastičnost i fiziološka adaptacija
= Regulisano uvođenje oznaka
= Modifikacije iRNK ugl. utiču na sposobnost kreiranja nekih 2 struktura -> izmijenjene RNK-RNK i RNK-proteinske interakcije -> uticaj na ekspresiju

= Metoda identifikacije:
- Princip sličan hromatinskoj imunoprecipitaciji (antitijelo spec. za oznaku) -> NGS za utvrđivanje sekvence u kojoj se našla oznaka
- Inozin -> RNA seq.

1. N6-metiladenozin

= Najbolje proučena epitranskriptomska oznaka
= Mijenja funkciju transkripta
= Dinamična
= Postoje ćelijski proteini koji je pišu, brišu, čitaju
= Ne utiče na W-C sparivanje
- Interferira sa pravljenjem drugih 2 struktura
= Najčešća oko STOP kodona
- Slabo zastupljena duž kodirajućeg dijela
= Neki tsk - povećana količina u 5’UTR-u
= Tkivo-specifične i evoluciono očuvane modifikacije
= Može funkcionisati kao ribosvič

2. N1-metiladenozin

= Manje izučena od N6-metiladenozina
= U tRNK - poznata oznaka
= U iRNK se ugl. prepoznaje kao oštećenje
= Utiče na W-C sparivanje -> mijenja formiranje 2 i 3 strukture -> mijenja interakciju sa proteinima
= U različitim tipovima ćel.
= Nije uvijek prisutna u svim transkriptima jednog gena
= Konzervisana mjesta kod razl. organizama
= Najčešća oko START kodona - pretpostavlja se da ima veze sa tsl
= Ne zna se mnogo o proteinima koji je pišu, brišu, čitaju
= Prisustvo oznake povezano sa povećanom ekspresijom proteina i efikasnošću tsl
- Naročito u stresnim uslovima

3. Pseudouridin

= Stabilizacija transkripata u stresnim uslovima

4. Editovanje A -> I

= Raspoznavanje sopstvene dsRNK od tuđe
= Diverzifikacija proteoma

Question 26

N6-metiladenozin kao epitranskriptomska oznaka

Answer 26

= Najučestalija i najbolje proučena epitranskriptomska modifikacija
= Ne utiče na W-C sparivanje, ali utiče na formiranje 3 struktura

= Tkivo-specifična modifikacija
= Pozicije modifikacije evolutivno očuvane

= Veća zastupljenost u 3’UTR-u u okolini STOP kodona, kao i u 5’UTR-u

= Proteini koji uvode oznaku - kompleks sa 2 metil-transferaze+1 protein koji reguliše akt.
= Proteini koji brišu oznaku - katalizuju demetilaciju ili prevođenje u 6-hidroksimetiladenozin -> vraćanje u adenozin

Uloge

= Čitači - mogu da stimulišu:
- degradaciju (regrutacija deadenilaza)
- translaciju (preko eIF3)

= Signal za degradaciju maternalnih iRNK kod zebra ribice
= Učestvuje u razviću CNS-a -> tranzicija ekspresionog programa neurona pri diferencijaciji
= Važan za organizaciju grupa iRNK u razviću i stresnim uslovima -> zajednički čitač -> zajednička degradacija

= Postoje i čitači bitni za splajsovanje i alternativnu obradu malih nekodirajućih RNK - oznaka se može naći i na njima ig

Question 27

27. Nekodirajuće RNK - podjela, uloge

Answer 27

= Funkcionalni RNK molekuli koji se ne translatiraju u proteine
= Funkcije:
- Regulatorne
- Strukturne
- Katalitičke
= Vrste:
- rRNK i tRNK (nisam sigurna jel one spadaju u duge nekodirajuće)
- lncRNK
- Male nekodirajuće RNK

Duge nekodirajuće RNK (lncRNK)

= Duže od 200 nt
= Ne sadrže jasan okvir čitanja
= Regulatorna funkcija:
- epigenetička reg.
- transkripciona reg.
- post-tsk reg.
= Strukturna f-ja:
- Potka u parapjegama + generalno učestvovanje u formiranju RNPs

Male nekodirajuće RNK

= 20-30 nt
= Prepoznaju komplementarnu sekvencu u ciljnim RNK
= Interaguju sa proteinima iz familije Argonaut (AGO)
- Visoko konzervisani proteini
- Specijalizovani za interakcije sa malim nekodirajućim RNK
= Funkcije:
- Regulacija invazivnih NK (retrovirusi i RNK transpozoni)
- Epigenetička memorija
- Post-tsk regulacija ekspresije
= 3 klase koje se razlikuju po biogenezi i proteinima sa kojima se asociraju:

1) Male interferirajuće RNK (siRNK)
- 21-25 nt
- Nastaju obradom dugog dvolančanog prekursora proteinom Dajser (endoribonukleaza)
> Prekursori egzogeni (virusna ili sintetička RNK) ili endogeni
- AGO proteini
- Uloge:
> Odbrana od virusa
> Kontrola transpozona
> Regulacija ekspresije gena
- Mehanizmi djelovanja:
> Endonukleolitička degradacija ciljne RNK
> Usmjeravanje kompleksa za epigenetičko utišavanje na ciljne regione genoma

2) MikroRNK (miRNK)
- 21-23 nt
- Nastaju obradom jednolančanog prekursora u obliku ukosnice proteinima Droša i Dajser (endoribonukleaze - nukleusna i citoplazmatična)
- Proteini AGO
- Uloga:
> Post-transkripciona regulacija ekspresije
- Mehanizmi djelovanja:
> Endonukleolitička degradacija ciljne RNK
> Translaciona represija
> Destabilizacija ciljne RNK
> Translaciona aktivacija

3) RNK koje stupaju u interakciju sa PIWI proteinima (piRNK)
- 24-32 nt
- Nastaju od dugog jednolančanog prekursora bez učestvovanja proteina Dajser
- PIWI proteini
- Uloga:
> Degradacija ciljnih transpozona u razviću i diferencijaciji polnih ćelija - regulacija ekspresije gena
- Mehanizmi djelovanja:
> Endonukleolitička degradacija ciljnih RNK (transkripata sa transpozona)
> Usmjeravanje kompleksa za epigenetičko utišavanje genomskih kopija transpozona
> Translaciona represija
> Translaciona aktivacija

Kružne RNK

= Nastaju splajsovanjem unazad
= Ekspresija specifična za tip ćelije ili fazu razvića
= Ugl. sadrži sekvencu gena za proteine, egzoni i/ili introni
= Stabilne - imaju posebne mehanizme degradacije
= Uloge:
- Endogeni sunđeri za miRNK
- Stimulacija tsk sopstvenog gena
- Modulacija uloge prekursora prepisanog sa istog gena

Question 28

Obrada prekursora rRNK

Answer 28

= Ribozom - RNK-proteinska mašina u kojoj se obavlja sinteza proteina
= Odgovoran za formiranje peptidnih veza, dešifrovanje kodona i translokaciju tokom translacije
- Funkcije rRNK
- Ribozomski proteini pomažu njeno pravilno savijanje i formiranje ribozomskih subjedinica + neutrališu negativno naelektrisanje RNK

= rRNK - izražene 2 i 3 strukture, radi čvrste asocijacije sa proteinima
= Posjeduju i dosta modifikacija nukleozida -> stabilnost i efikasnost interakcija u ribozomu

= Veliki broj ribozoma u ćeliji stalno potreban - omogućen:
- Velikom količinom rRNK (~98% ukupne mase RNK)
- Velikim brojem kopija gena za rRNK (~300), u tandemski ponovljenoj organizaciji
> Na kratkim ručicama 5 akrocentričnih hromozoma
> rDNK dijelovi genoma
- Velikom brzinom sinteze ribozoma, iako je vrijeme za transkripciju duže - omogućeno prethodnim faktorom

= 1 tandemski ponovljen motiv u genomu:
1) Transkripciona jedinica - region koji se transkribuje
- Identičan kod svih organizama - veliki evolucioni pritisak
2) Intergenski graničnici
- Razlike u dužini, razlikuju se i između organizama
- Takođe ponovljene sekvence

= Transkripciona jedinica - geni za 18S, 5,8S i 28S rRNK
- Odvojeni unutrašnjim graničnicima
- 5S rRNK se nalazi potpuno odvojeno u genomu, van rDNK
= Gene za ove rRNK prepisuje RNK Pol I
- Gen za 5S rRNK prepisuje RNK Pol III
= pre-rRNK nastaje prepisivanjem transportne jedinice i uporedo sa sintezom počinje i asocijacija sa proteinima (formiranje pre-rRNP)

= Obrada pre-rRNK - niz endonukleolitičkih sječenja, egzonukleolitičkih skraćivanja (trimming) i posttranskripcionih modifikacija nukleozida

Proces obrade

1. Inicijalno 3’ endonukleolitičko sječenje + Modifikacija nukleozida -> 35S pre-rRNK
2. Inicijalno 5’ endonukleolitičko sječenje procezomom
   - Procezom - ribonukleoproteinski kompleks koji formiraju U3 snoRNK i proteini
   - Preciznost sječenja - komplementarno sparivanje U3 snoRNK i pre-rRNK
   -> 33S pre-rRNK -> 32S pre-rRNK
3. Endonukleolitičko sječenje RNazom MRP
   - RNaza MRP -> ribozim (RNP gdje RNK ima katalitičku aktivnost)
   -> Rezultuje u 20S rRNK (prekursor MSJ) i 28S+5,8S rRNK (prekursor VSJ)

4.1 20S rRNK (prekursor MSJ) se transportuje u citoplazmu -> dovršavanje obrade
- Egzonukleolitičko skraćivanje pomoću Xrn1 -> 18S rRNK
- Dimetilacija dva adeninska ostatka

4.2 Prekursor VSJ prolazi kroz niz endonukleolitičkih sječenja, 2 moguća puta -> 28S+5,8S rRNK

Post-transkripcione modifikacije

= Enzimi koji ih uvode vođeni pomoću snoRNK -> molekuli vodiči
- I procesi sječenja su vođeni njima, zato su precizni
= Modifikacije:
1) Metilacija 2’OH grupe riboze - metiltransferaze
2) Konverzija uridina u pseudouridin - pseudouridin sintaze

Obrada 5S rRNK

= Transkribuje se van nukleolusa -> otklanjanje nekoliko NT sa 3’ kraja -> transfer u nukleolus da bi mogla da učestvuje u formiranju VSJ zajedno sa 5,8S i 28S

Formiranje VSJ

= U nukleolusu
= Kompleksnije od formiranja MSJ -> potreban veći broj remodelovanja
= U sazrijevanju učestvuju:
- RNK helikaze - “ljušte” snoRNK i proteine asocirane sa rRNK
- GTPaze - potrebne kao vid kontrole koraka u sintezi, kao i u translaciji - ukoliko je sve ispravno -> hidroliza GTP
- AAA ATPaze
- Još proteina koji se prolazno asociraju

= Ekspresija rRNK - zavisna od trenutnih potreba ćel za sintezom proteina
- Ugl pola kopija tsk aktivno
- Druga polovina u formi heterohromatina
> Tsk utišavanje - lncRNK

= Ribozomopatije - oboljenja uzrokovana poremećajima u biogenezi i f-ji ribozoma
- Dominantno nasljedne
- Teške kliničke slike

Question 29

Obrada prekursora tRNK

Answer 29

= tRNK - male solubilne RNK koje dešifruju kodone u iRNK i nose odgovarajuću AK
= Gene za tRNK prepisuje RNK Pol III
= Izražene 2 i 3 strukture, neophodne za funkciju
= Najbrojniji RNK molekuli u ćel (iako rRNK nose najveću masu jer su veći)
= Puno modifikovanih nukleozida - post-transkripciono uvođenje oznaka

Obrada pre-tRNK

1. Uklanjanje vodeće sekvence na 5’ kraju
   - Vodeća sekvenca - u svim pre-tRNK
   - RNazaP - ribozim koji sadrži H1 RNK
   > Prepoznaje specifičnu strukturu u T petlji
   > Uvodi endonukleolitički prekid na razdaljini od 12 bp
2. Dodavanje CCA niza na 3’ kraj
   - Na 3’ kraju prisutna dva uracila
   - Oni se uklanjaju
   - tRNK nukleotidil transferaza dodaje CCA niz
   - Bitno za interakciju sa aminoacil-transferazom koja dodaje AK na tRNK -> korak kontrole kvaliteta
3. Modifikacija tačno određenih nukleozida
   - Dodavanje metil i izopentanil grupa na purinske baze
   - Metilacija 2’OH grupe na ribozi
   - Konverzija uridina u pseudouridin, dihidrouridin ili ribotimidin
4. Isijecanje introna
   - Neke tRNK sadrže kratke introne u blizini antikodonske petlje
   - Isijecaju ih specifične endonukleaze, koje uvode istovremeno prekide na oba kraja
   > Prepoznaju prostornu strukturu pre-tRNK
   - RNK ligaza spaja krajeve
   - Potrebna dodatna energija za ovaj proces

Question 30

30. RNK interferencija

Answer 30

= RNK interferencija = represija ili utišavanje ciljnih NK koje su komplementarne malim nekodirajućim RNK
= Učestvuju male nekodirajuće RNK koje se asociraju sa AGO proteinima
= Prvobitno otkrivena kao vještački fenomen u C. elegans - vještački unesena RNK dovodi do produkcije malih RNK koje na sekvenca-specifičan način degraduju unijetu RNK

= Uloge:
- Odbrana od invazivnih NK (retrovirusa i RNK transpozona)
- Epigenetička regulacija eksp
- Post-transkripciona regulacija eksp
= I u normalnim i u patološkim uslovima, razni aspekti funkcionisanja ćel.

= Modularan mehanizam:
- Male nekodirajuće RNK prepoznaju ciljnu NK
- AGO proteini obavljaju efektorne f-je (samostalno ili kroz interakciju sa drugim proteinima)

Post-transkripcioni nivo regulacije ekspresije gena - mehanizmi utišavanja

= Endonukleolitička degradacija
= Translaciona represija/utišavanje
= Destabilizacija ciljne RNK

Epigenetički nivo regulacije ekspresije gena

= Usmjeravanje uspostavljanja određene hromatinske strukture u regionima genoma koji sadrže komplementarne sekvence sa malom nekod. RNK
= Zahtijeva aktivnu transkripciju u dijelu genoma koji se reguliše
= Mehanizmi utišavanja:
- Ko-transkripciono epigenetičko utišavanje
- RNK-usmjerena metilacija DNK

Question 31

31. miRNK - organizacija gena i biogeneza

Answer 31

= miRNK geni:
- Nezavisni u genomu
- Dio introna ili netranslatirajućih ili kodirajućih dijelova gena za proteine i lncRNK
- Dio pseudogena
- Dio ponovjenih sekvenci u genomu (transpozona naročito)
= Transkripti sa miRNK gena formiraju strukturu ukosnice - dvolančana drška, jednolančana petlja
- Kodiraju za 1 ili 2 miRNK (sekvenca zrele miRNK se nalazi u 1 ili obje drške, na svakoj po jedna)
- Ako su 2 miRNK:
1) 5p miRNK (sa 5’ ručice)
2) 3p miRNK

Biogeneza

= Nastaju:
- Kanonskim putem: pri-miRNK -> Droša -> pre-miRNK -> Dajser -> zrela miRNK
- Alternativnim putem: mirtroni -> pre-miRNK -> Dajser -> zrela miRNK
*Mirtroni = introni koji sadrže sekvencu koja u potpunosti odgovara pre-miRNK - iskrajanjem splajsozomom nastaje pre-miRNK, bez učešća Droše

= pri-miRNK (primarne miRNK) - prekursori koji nastaju prepisivanjem uz pomoć Pol II
= Nukleus - endoribonukleaza Drosha (+pomoćni protein) -> sječenjem nastaje pre-miRNK (takođe dvolančana ukosnica)
- Uvodi dva jednolančana prekida simetričnim RNaznim domenima 11bp od mjesta prelaza iz jednolančane u dvolančanu strukturu
- Rezultat: asimetrični krajevi (na 3’ kraju 2 nt više - jednolančani kraj)
= pre-miRNK se transportuje u citoplazmu

= Citoplazma - pre-miRNK siječe endoribonukleaza Dajser (oblik sjekire) + pomoćni proteini
- PAZ domen koji formira džep za 3’ jednolančani kraj pre-miRNK
- Dva simetrična RNazna domena uvode 2 jednolančana prekida na udaljenosti 22 nt od kraja ukosnice
- Rezultat: dvolančana RNK dužine 21-25 nt sa dva 3’ kraja koja su jednolančana (rez. aktivnosti Droša + Dajser)

= Jedan lanac dvolančane miRNK -> zrela miRNK (lanac vodič)
- Onaj čiji je 5’ kraj u manje povoljnoj termodinamičkoj poziciji
= Drugi lanac dvolančane miRNK -> degradovan (lanac putnik)

= Dvolančana miRNK formira kompleks sa AGO proteinima -> miRISC kompleks
- Nakon formiranja kompleksa sa AGO, ds miRNK se denaturiše i lanac putnik se degraduje

= Ukoliko se miRNK perfektno spari sa ciljnom RNK -> efektor u miRISC je AGO protein
= Ukoliko se miRNK neperfektno spari sa ciljnom RNK -> efektor u miRISC je neki od drugih proteina sa kojima AGO stupa u interakciju

= I Drosha i Dicer:
- Prepoznaju dsRNK
- Uvode prekide nezavisno od sekvence, samo na osnovu mjerenja

Question 32

32. Utišavanje ekspresije gena sa miRNK

Answer 32

= miRNK + AGO proteini = miRISC utišavajući kompleks

= 3 načina utišavanja:
- Ako je sparivanje miRNK-ciljna RNK savršeno:
1) Endonukleolitička degradacija
> Biljke
> AGO protein efektor
- Ako sparivanje nije savršeno (ugl kod životinja):
2) Destabilizacija ciljne RNK stimulacijom deadenilacije
3) Translacionom represijom

= U druga dva procesa, efektorni proteini su dodatni proteini, ne sam AGO

= Vezivna mjesta za miRNK - ugl u 3’UTR-u ciljne RNK -> MRE sekvence (miRNA Response Element)
= Region sjemena - ključan region na 5’ kraju miRNK za prepoznavanje MRE sekvence
- 2-8 NT
- Perfektno sparivanje sa iRNK
> Kratak region -> 1 miRNK ima više ciljnih molekula
> iRNK takođe imaju MRE za više identičnih i različitih miRNK
= U 3’ kraju miRNK takođe može da postoji komplementarnost sa ciljnom sekvencom -> povećavanje specifičnosti

= Kod životinja, zbog neperfektnog sparivanja sekvenci, najčešći vid utišavanja ekspresije - represija translacije (u kombinaciji sa deadenilacijom)
(ukoliko je miRISC asociran sa GW182 proteinom)
- GW182 - glavni efektorni protein
- AGO-GW182 narušava kružnu strukturu iRNK i destabilizuje iRNK indukcijom deadenilacije
> GW182 - u kompeticiji sa eIF4G za vezivanje PABP - kad se veže, destabilizuje se interakcija eIF4G i PABP -> destabilizacija kružne strukture -> lakši pristup deadenilazi
- Utišana iRNK se usmjerava ka P tijelu -> skladištenje ili degradacija (ukoliko je dovoljno skraćen poli-A rep)
- Glavni vid kontrole ekspresije gena od strane miRNK kod sisara

= miRNK najčešće djeluju kao represori u ćel.
- Mogu da stimulišu translaciju:
> Kod TOP operona (u kompeticiji sa TIA1 koji reprimira tsl i učestvuje u nukleaciji granula stresa)
> Kada služe za oslobađanje RBP represora sa prigušivača u 5’ UTR-u
- Efekat miRISC takođe zavisi od sastava faktora koji ga čine - ista miRNK može da utišava i stimuliše translaciju, zavisno od proteina

Question 33

34. siRNK - biogeneza, podjela

Answer 33

= Prekursori siRNK:
- Egzogena dsRNK - virusna ili vještački unijeta dsRNK -> egzosiRNK
- Endogena dsRNK - endogeno sintetisane duge dsRNK -> endosiRNK
= Obrada prekursora - protein Dajser (endonukleaza)

= Nastanak endogenih prekursora:

1) Bidirekcionom transkripcijom nekih dijelova genoma
- Konvergentna -> transkripti sa preklapajućim 3’ krajevima
- Divergentna -> transkripti sa preklapajućim 5’ krajevima
- Preklapajući dijelovi - prekursori siRNK
- cis prirodni antisense transkripti

2) Transkripcijom sličnih, ali udaljenih dijelova genoma - pseudogena i njihovih roditeljskih gena
- trans prirodni antisense transkripti

3) Transkripcijom transpozona
- Kod biljaka - ovakve siRNK odbrana od mobilnih genetičkih elemenata

4) Od transkripata sa dugih invertovanih ponovaka

= siRNK + AGO protein = siRISC utišavajući kompleks
- Ima i druge proteine - kod biljaka i nižih životinja RNKzRNK Pol
- RNKzRNK Pol - zadužena za formiranje sekundarnih siRNK - amplifikacija početnog signala
> Uloga: reprimiranje ciljne RNK + stvaranje pula manjih siRNK koje će efikasno reprimirati istu ciljnu RNK
> Antivirusni imuni sistem
> Može da služi i za kontrolu transpozona i ekspresije gena
- Kod sisara nije poznata funkcija i nije identifikovana RNKzRNK Pol

RNK interferencija kod biljaka

= Jako razvijena
= Primarne siRNK + AGO = siRISC
= siRISC se upućuje ka ciljnoj RNK -> endonukleolitička degradacija
= RNKzRNK pol se regrutuje u siRISC -> koristi produkte endonukleolitičke degradacije kao matricu -> sinteza komplementarnog lanca i sa sense i sa antisense lanca
= Dajser prepoznaje “nove” dsRNK -> endonukleolitičko sječenje -> sekundarne siRNK -> amplifikacija

RNK interferencija kod C. elegans

= Slična kao kod biljaka, ali se ne zna mehanizam kojim RNKzRNK pol koristi produkte endonukleolitičke degradacije kao matricu
= Sinteza kratkih jednolančanih RNK -> siRNK potiču samo od jednog lanca
- Nema sječenja Dajserom

Question 34

35. siRNK i odbrana od virusa

Answer 34

= RNK interferencija - glavni put odbrane od virusa kod nekih organizama
- Biljke, gljive, nematoda, Drosophila
= Evoluciono konzervisan antivirusni imuni sistem
= Ne zna se značaj RNK interferencije kod kičmenjaka

= Obrada virusnih dsRNK Dajserom -> primarne siRNK -> vezuju se za RNK intermedijere koji nastaju tokom živ. ciklusa virusa i degraduju ih AGO proteinom
= Amplifikacija -> RNKzRNK pol stvara sekundarne siRNK kako bi se amplifikovao početni pul siRNK

= Sistemska RNK interferencija - dolazi do širenja efekta siRNK na ostale ćelije u okolini, da bi organizam adekvatno odgovorio na virusnu infekciju

Biljke

= siRNK se transportuju od ćelije do ćelije na manjoj udaljenosti, a na većoj preko floema (ne zna se koji je tačno signal)

C. elegans

= siRNK se kreću između “ćelija” kroz transmembranske kanale - sincicijum

Question 35

36. Ko-transkripciono utišavanje gena

Answer 35

= Mehanizam epigenetičke regulacije ekspresije gena pomoću RNK interferencije
= Najpoznatiji primjer - utišavanje centromernih regiona kod kvasaca
= siRNK se po sistemu komplementarnosti sparuju sa transkriptima sa regiona koji se utišava -> proteini iz utišavajućeg kompleksa regrutuju kompleks za uvođenje epigenetičkih oznaka -> heterohromatinizacija

= Region koji se utišava mora biti transkripciono aktivan
- Bidirekciona transkripcija -> nastaju dsRNK prekursori siRNK -> protein Dajser -> stvaranje siRNK -> interakcija sa AGO - formiranje utišavajućeg kompleksa
- Utišavajući kompleks sadrži partner proteine
> Partner protein koji uspostavlja interakciju sa hromatinom -> kompleks uspostavlja vezu i sa transkriptom sa regiona genoma, i sa hromatinom
-> Utišavajući kompleks regrutuje kompleks za metilaciju N-krajeva histona -> sadrži metil-transferazu + čitač uvedene oznake koji zatim širi uvođenje metilacije -> heterohromatinizacija

= Pored siRNK, kotranskripciono epigenetičko utišavanje koriste i piRNK u polnim ćel. pri utišavanju transpozona

Question 36

37. RNK-usmjerena metilacija DNK

Answer 36

= Vid epigenetičkog utišavanja koji je otkriven samo kod biljaka u somatskim ćelijama
= Koriste siRNK da usmjere de nuovo metilaciju

= Uloge:
- Utišavanje transpozona i drugih ponovljenih elemenata u genomu
- Modulacija ekspresije gena u razviću i stresu

= siRNK usmjeravaju metil-transferaze do tačno određenog dijela genoma koji se utišava pomoću komplementarnosti sekvenci
= Region genoma mora biti transkripciono aktivan
= Učestvuju Pol IV i Pol V
- Pol V - sintetiše nekodirajuću RNK sa lokusa koji se utišava = ciljni transkript
> Ima specifičan CTD koji ima visok afinitet za AGO protein
= siRNK se vezuje za komplementarnu sekvencu u rastućem transkriptu + AGO protein ostvaruje interakciju sa CTD Pol V
-> Regrutacija metil-transferaze -> Uvođenje inicijalne epigenetičke oznake, metilacija se širi -> heterohromatinizacija

= Postoje i alternativni mehanizmi za utišavanje transpozona kod biljaka
= Ovaj mehanizam koriste i piRNK u životinjskim polnim ćelijama za utišavanje transpozona

Question 37

38. piRNK - biogeneza kod Drosophila

Answer 37

piRNK

= piRNK - male RNK asocirane sa PIWI proteinima (piRISC)
= 24-32 NT
= Dugi jednolančani prekursori
= Nastaju bez učešća proteina Drosha i Dicer
= Osnovna funkcija - utišavanje transpozona u polnim ćel. životinja
- Da bi se očuvao integritet genoma za buduće generacije
- Naročito podložne nekontrolisanoj aktivnosti transpozona zbog epigenetičkog reprogramiranja

Biogeneza

= Klasteri gena za piRNK - u dijelovima genoma gdje su transpozoni i ponovljeni elementi
- Teški za mapiranje

= Podjela klastera:

1. Uni-strand klasteri
   - Prepisuje se samo 1 lanac -> prekursor piRNK
   - Pol II vrši tsk
   > Transkripti mogu imati 5’ kapu i poli-A kraj i mogu podlijegati splajsovanju
2. Dual-strand klasteri
   - Bidirekciona transkripcija -> prekursori piRNK nastaju sa oba lanca
   - Transkripcija sa heterohromatinskog regiona -> RDC kompleks
   1) Rhino protein - prepoznaje utišavajuće oznake
   2) Deadlock protein - regrutuje tsk mašineriju (Pol II) i time inicira tsk
   3) Cutoff - suprimira prevremenu terminaciju i ne dozvoljava splajsovanje

= Prekursori piRNK se transportuju u citoplazmu -> obrada

• 5’ kraj
  1. Prekursor piRNK prepoznaje komplementarna piRNK u kompleksu sa PIWI proteinom -> endonukleolitičko sječenje
  2. Endonukleaza Zucchini pravi endonukleolitički prekid
• 3’ kraj
  1. i 2. način isti
  3. Trimovanje u smjeru 3’-5’ pomoću Nibbler egzonukleaze
• piRNK dužine 30ak NT:
  > Metilacija 3’ kraja
  > Uridin (1U) na 5’ kraju

Somatske folikularne ćelije

= Postoji još jedan alternativni mehanizam obrade -> Inchworming mehanizam
- U somatskim folikularnim ćelijama
- Serijsko sječenje prekursora Zucchini endonukleazom
- Za nastale piRNK se vežu PIWI

= Zrele piRNK ostaju asocirane sa PIWI -> piRISC

Pomoćne polne ćel.

= Ping-pong model biogeneze piRNK

Question 38

39. piRNK - utišavanje transpozona kod Drosophila

Answer 38

1. Endonukleolitičkom degradacijom

= Efikasnost u utišavanju transpozona - vezana za amplifikaciju početnog signala -> ping-pong mehanizam
- Obezbjeđuje sigurno utišavanje
- Specifično se inaktiviraju aktivni transpozoni
= Samo neke piRNK sa klastera imaće sekvence pogodne za utišavanje transpozona

= piRNK stupa u interakciju sa PIWI proteinom -> prepoznaje transpozon putem komplementarnosti sekvence -> PIWI uvodi endonukleolitički prekid i inaktivira transpozon
-> Generisanje novih piRNK koje dalje učestvuju u inaktivaciji - ping-pong model
-> Urođena + adaptivna komponenta

= Maternalne piRNK se nasljeđuju = primarne piRNK protiv transpozona

2. Kotranskripciono epigenetičko utišavanje

= Moguće utišavati i genomske kopije transpozona -> transkripciono aktivni transpozoni
= piRISC kompleks
- piRNK se sparuje sa rastućim transkriptom
- PIWI protein regrutuje enzime za uvođenje utišavajućih oznaka
- Potpuna represija transkripcije - Mael protein - interferira sa funkcijom Pol II

Question 39

40. Pregled aktivnosti puta piRNK tokom spermatogeneze miša

Answer 39

= Utišavajući kompleks piRNK aktivan tokom spermatogeneze kod miša
= Dva talasa globalnog epigenetičkog reprogramiranja i remodelovanja hromatina -> dozvoljava aktivnost transpozona

= Uloge piRNK i PIWI:
- Endonukleolitički utišavaju transpozone (kotranskripciono ig)
- Usmjeravanje de nuovo metilacije genomskih kopija transpozona
- U završnim fazama spermatogeneze kontrolišu aktivnost transpozona, utiču na utišavanje (pomoću?) lncRNK i globalnu eliminaciju iRNK

= Dva talasa epigenetičkog reprogramiranja u spermatogenezi -> dva prozora aktivnosti piRNK:

1. Gubitak represivnih epigenetičkih oznaka na N-krajevima histona i DNK metilacije
   - Dešava se još u primordijalnim prekursorima spermatozoida
   - Omogućena aktivnost transpozona
   - Dešava se prije pahitena -> aktivne prepahitenske piRNK
   > Asocijacija sa proteinima MILI i MIWI2
2. Zamjena kanonskih histona specifičnim histonskim varijantama i protaminima - pakovanje genoma kondenzovanije od histona
   - Aktivne pahitenske piRNK
   > Asocijacija sa proteinima MILI i MIWI

Question 40

41. Prepahitenske iRNK kod miša

Answer 40

= Aktivne u prvom epigenetičkom reprogramiranju (u primordijalnim prekursorima spermatozoida)
= Po svim odlikama slične piRNK Drosophila koje se prepisuju sa klastera iz regiona genoma bogatih transpozonima -> prepisuju se sa takvih regiona
= Bidirekciono prepisivanje -> nastaju sense i antisense lanci (jednolančani prekursori) -> transport u citoplazmu

= Interakcija sa proteinima MILI i MIWI2

= Prekursori - jednolančane primarne ili sekundarne piRNK
- Nastaju Inchworming mehanizmom ili Ping-pong meh.

= Primarne piRNK + MILI - stabilizacija
= Kompleks pokreće stvaranje sekundarnih piRNK - ping-pong

= Funkcija:
- Kontrola aktiviranih transpozona
- Usmjeravanje de nuovo metilacije

= piRNK sa MIWI2 - najznačajniji za usmjeravanje de nuovo metilacije
- I u nukleusu i u citoplazmi

Question 41

42. Pahitenske piRNK kod miša

Answer 41

= Prekursori se ne prepisuju sa klastera iz regiona bogatih transpozonima, nego sa regiona siromašnih ponovljenim sekvencama
= Bidirekciona transkripcija
- Transkripti imaju 5’ kapu i poli-A rep
> Slično Uni-strand transkriptima Drosophila

= Ekspresija - od pahitena Mejoze I do stadijuma okruglih spermatida
- Nestaju tokom diferencijacije spermatozoida

= Interakcija sa MILI i MIWI proteinima

= Uloge:
- Utišavanje aktiviranih transpozona endonukleolitičkom degradacijom
- Globalna eliminacija iRNK u završnim fazama spermatogeneze

= MIWI sa piRNK prepoznaje transkripte prepisane u pogrešnom trenutku (represija popušta tokom epigenetičkog remodelovanja - zamjene histona specifičnim varijantama i protaminima) -> endonukleolitička degradacija

= MIWI sa piRNK pokreću globalnu eliminaciju iRNK kada se citoplazmatski sadržaj svodi na minimum
- Nesavršena kompatibilnost sa transkriptom -> MIWI? regrutuje deadenilaze -> destabilizacija iRNK -> degradacija

Question 42

43. Duge nekodirajuće RNK - biološka funkcija ili transkripcioni šum

Answer 42

= lncRNK - svaka RNK duža od 200 NT bez otvorenog okvira čitanja
= Prepisuje ih Pol II
- Imaju 5’ kapu, poli-A rep i splajsuju se

= U prošlosti se smatralo da su rijetki molekuli i njihova f-ja je vezivana isključivo za utišavanje prilikom dozne kompenzacije
= Otkriveno još mnogo njih, ali ih dosta nije funkcionalno okarakterisano

= Debata da li su u pitanju molekuli sa biološkom f-jom ili transkripcioni šum
- Veliki broj regiona genoma se prepisuje jer se RNK polimeraza nespecifično veže -> neefikasna transkripcija
- Mali broj lncRNK molekula ima evolutivno očuvanu sekvencu

= Argumenti za to da imaju biološku funkciju:
1) Sa povećanjem složenosti organizma povećava se br. transkribovanih lncRNK
2) Imaju prostornu i vremensku regulaciju
3) Imaju preciznu unutarćelijsku lokalizaciju
4) TF se vezuju za dijelove genoma sa kojih se transkribuju
5) One koje djeluju in cis se transkribuju u malom broju kopija - nema nasumične pretjerane produkcije

= Za neke lncRNK definisane funkcije:
- Regulatorne - na epigenetičkom, transkripcionom i post-transkripcionom nivou
- Strukturne - u formiranju RNP (npr parapjege)

= Njihova evoluciona neočuvanost -> posljedica niskog selektivnog pritiska jer nema ORF-a koji se mora očuvati
- Kraći nizovi konzervisanih sekvenci koje održavaju njihove funkcionalne domene (analognu i digitalnu informaciju)
- Plastičniji odnos strukture i funkcije od proteina - omogućeno da se isprobavaju novi mehanizmi
> Moguće objašnjenje za neke fenotipske razlike unutar i između vrsta

= Nisu evolutivno očuvane sekvence, ali procesi u kojima učestvuju jesu - u nekim dijelovima genoma, transkripcija DNK “otvara” hromatin i omogućava transkripciju nekih nizvodnih gena (interakciju transkripcione mašinerije sa DNK)

Question 43

44. Duge nekodirajuće RNK - interakcija sa partner molekulima

Answer 43

= lncRNK mogu da interaguju sa DNK, RNK i proteinima
= lncRNK se odlikuju specifičnošću i fleksibilnošću u interakcijama sa partner molekulima
- Specifičnost - vezana za interakciju sa NK
- Fleksibilnost - vezana za interakciju sa proteinima

= 2 vrste informacija za interakcije:

1. Analogna - 2 i 3 strukture koje formira lncRNK
   - Interakcija sa proteinima
   - Izvor fleksibilnosti interakcija - širok dijapazon 2 i 3 struktura koje mogu zauzeti, mogućnost lakše promjene strukture pri vezivanju liganda
   - Vezuju veći broj kombinatornih proteinskih kompleksa
2. Digitalna - 1 struktura (redoslijed NT)
   - Interakcija sa NK
   - Izvor specifičnosti interakcija - neograničenost u dužini i kompoziciji digitalne informacije -> nepogrješivo prepoznavanje jedinstvenog mjesta u genomu
   > Proteini prepoznaju kraće sekvence - mogu se naći na više mjesta u genomu -> 1 protein reguliše više različitih dešavanja
   - Idealni molekuli za lokus- i alel-specifičnu regulaciju

Question 44

45. Duge nekodirajuće RNK - in cis, in trans djelovanje, trans faktori

Answer 44

= lncRNK se na osnovu mjesta djelovanja dijele na:
- in cis
- in trans

1. In cis - lncRNK koje f-ju obavljajju na mjestu sinteze
   - Direktno djeluju na 1 ili više kontinuiranih gena
   - Mali broj kopija
   - Kratak poluživot
   - Precizno regulisana ekspresija
   - Ne difunduju (spriječeno brzim razgrađivanjem nakon obavljanja f-je)
   -> sprječava djelovanje na nekim drugim mjestima
   - Uloga: molekuli vodiči -> epigenetička regulacija
   > pRNK
   > XistRNK
   - Ovdje spadaju i Enhancer Like RNA
   > Prepisane sa intergenskih regiona
   > in cis regrutuju proteine za uspostavljanje interakcije sa udaljenim mjestom u genomu -> savijanje DNK molekula
   > Regrutuje se i kompleks za promjenu strukture hromatina
2. In trans - lncRNK koje difunduju sa svog mjesta sinteze i direktno djeluju na udaljene gene (uključujući gene na drugim hromozomima)
   - Uloge:
   > Molekuli vodiči - usmjeravaju proteinske komplekse na neko udaljeno mjesto u genomu
   » HOTAIR RNA (HOX transcript antisense RNA) - HOXC klaster RNK koja regrutuje represivni kompleks za modifikaciju histona -> utišavanje ekspresije gena sa HOXD klastera
   > Kao tipični trans faktori - direktno reguliše ekspresiju gena - slično proteinima ili miRNK
   » Npr. Alu RNK inhibiraju transkripciju specifičnih iRNK u uslovima stresa

Question 45

46. Duge nekodirajuće RNK - modeli djelovanja

Answer 45

1. Molekuli vodiči - lncRNK koje uspostavljaju direktnu vezu sa DNK i istovremeno asembliraju proteinske komplekse
   - Usmjeravaju proteine na tačno određeni region genoma
   - in cis ili in trans djelovanje
   - Epigenetička regulacija - regrutuju proteine za promjenu strukture hromatina
   - Transkripciona regulacija - regrutuju transkripcione aktivatore
2. Molekuli pojačivači - lncRNK prepisane sa intergenskih regiona
   - Djeluju in cis -> regrutuju proteine pomoću kojih se ostvaruje interakcija sa udaljenim regionom genoma -> savijanje DNK i formiranje hromatinske petlje
   - Regrutuju i komplekse za promjenu strukture hromatina -> njihovo djelovanje se širi na cijelu hromatinsku petlju
   - Djeluju kao pojačivači -> Enhancer Like RNA (RNKe)
   - Na sličan način mogu djelovati i kao prigušivači ili izolatori
3. Molekuli mamci - endogeni sunđeri
   - DNK mimikrija -> zarobljavaju DNK vezivne proteine i miRNK
4. Molekuli spone - ostvaruju interakciju sa dva ili više proteina, formirajući RNP (npr. parapjege i nukleusna tijela)
   - Strukturna uloga
5. Neki lncRNK ne djeluju na osnovu svoje sekvence - sama njihova transkripcija utiče na regulaciju transkripcije nizvodnih gena
   - Mogu da je stimulišu “otvaranjem” hromatinske strukture, povećavajući dostupnost DNK za TF i RNK pol.
   - Mogu da vrše transkripcionu interferenciju - njena transkripcija ometa transkripciju neke druge tsk jedinice

Question 46

47. Duge nekodirajuće RNK i epigenetička regulacija

Answer 46

= lncRNK mogu na tačno određenom mjestu u genomu da pokrenu tačno određeni epigenetički proces
- Omogućavaju visoku preciznost i preciznu lokalizaciju odvijanja epigenetičkih procesa
= Usmjeravanje kompleksa za promjenu strukture hromatina na tačno određeno mjesto (digitalna inf)
- Pošto samo usmjeravaju kompleks i time iniciraju epigenetički proces, ali se on dalje sam širi - epigenetičke efemere
= Prisustvo lncRNK objašnjava preciznost epigenetičkih promjena uprkos maloj raznovrsnosti epigenetičkih kompleksa i modifikacija koje uvode

Vidovi epigenetičke regulacije

1. Dozna kompenzacija - inaktivacija X hromozoma i genetičko utiskivanje

= Nasumična inaktivacija jednog od X hromozoma kod ženki - ekspresija samo sa jednog X hromozoma
- Xist lncRNK - djeluje in cis (sintetiše se sa X inaktivacionog centra hromozoma koji se utišava)
> Regrutuje kompleks za epigenetičko utišavanje
- Rano embrionalno razviće
- X hromozomi u komunikaciji - inaktivira se samo jedan
- Nije bitno koji se inaktivira, ali ćerke ćelije imaju isti inaktiviran X hromozom - nasljeđivanje epigenetičkih oznaka

= Genetičko utiskivanje - geni se eksprimiraju samo sa jednog od dva roditeljska alela, i to uvijek sa istog
- Eksprimiraju se kopije samo sa jednog roditeljskog hromozoma
- Alel specifična i lokus specifična dozna kompenzacija
- lncRNK koja učestvuje u utišavanju očeve kopije gena (za IGF2r?)
> U tom regionu aktivan samo gen za ekspresiju lncRNK koja utišava
> Transkripciona interferencija

2. Utišavanje polovine gena za rRNK
   - Oko polovine kopija uvijek utišano - reverzibilno utišavanje
   - Čuvaju se u perinukleolarnom prostoru
   - pRNK = lncRNK koja se prepisuje sa intergenskih graničnika između transkripcionih jedinica u genima za rRNK -> in cis utišavanje
   > Tripleks struktura sa DNK -> regrutacija kompleksa za remodelovanje nukleozoma
3. HOX geni
   - Geni bitni za uspostavljanje A-P ose
   - 4 klastera unutar genoma, na različitim hromozomima
   - Ne eksprimiraju se svi istovremeno
   1) HOTAIR lncRNK - in trans molekul vodič -> transkribuje se sa HOXC, a djeluje na HOXD klaster -> utišavanje regrutacijom epigenetičkih kompleksa koji uvode utišavajuće oznake
   2) HOTTIP rRNK - in cis Enhancer Like RNK -> dovodi do formiranja hromatinske petlje

Question 47

48. Duge nekodirajuće RNK i transkripciona regulacija

Answer 47

= Načini modulacije transkripcije:

1. Stupanje u interakciju sa samom Pol II i njeno ometanje
   - Alu RNK koje se transkribuju u stresnim uslovima
   - Analognom informacijom stupa u interakciju -> blokira kanal za ulaz DNK
   - Može da interferira sa transkripcijom čak i housekeeping gena
2. Stupanje u interakciju sa opštom transkripcionom mašinerijom i njeno ometanje
   - lncRNK se transkribuje sa regiona uzvodno od gena - uključujući njegov promotor
   - Pravi tripleks strukturu DNK-RNK -> ne može da se veže opšti TF -> ne može da se asemblira preinicijacioni kompleks
   - Transkripciona interferencija
3. Modulacija funkcije transkripcionih faktora
   - lncRNK rade molekularnu mimikriju DNK -> vezuju i zarobljavaju TF
   - Mogu da djeluju i kao kofaktori - vezuju se za TF i inhibiraju/stimulišu njegovu f-ju
4. Pomažu transkripciju nizvodnog gena sopstvenom transkripcijom
   - Otvaranje hromatina -> dostupnija DNK za tsk mašineriju
5. lncRNK nastale bidirekcionom transkripcijom sa pojačivača - potka za asembliranje proteina -> promocija formiranja hromatinske petlje

Question 48

49. Duge nekodirajuće RNK i posttranskripciona regulacija

Answer 48

= Digitalna informacija u lncRNK omogućava visoko specifične interakcije u drugom transkriptu -> regulacija na posttranskripcionom nivou
= Najveći br lncRNK lokalizuje u nukleusu, ali se dio transportuje i u citoplazmu

1. Sa mnogih mjesta u genomu se dešava transkripcija i u suprotnom smjeru -> antisense lncRNK
   - Sparuju se sa sense lancima -> Maskiranje mjesta splajsovanja -> promjena obrasca
2. Sparivanje sa 5’UTR-ovima -> stimulisanje ili onemogućavanje translacije
3. Regrutacija proteina koji stimuliše degradaciju iRNK
4. Maskiranje mjesta za vezivanje miRNK -> utiče na njenu funkciju
5. Endogeni sunđeri miRNK -> spušta se efektivni nivo miRNK u ćel -> utiče na ekspresiju mnogih gena
6. Mogu da vežu različite RBP
   - Regulatore splajsovanja -> promjena obrasca splajsovanja
   - Dajser protein -> smanjena obrada prekursora za male nekodirajuće RNK

Question 49

50. Kružne RNK - biogeneza

Answer 49

= Kružne RNK - regulatorne RNK čiji su 5’ i 3’ krajevi kovalentno spojeni
- Vrlo stabilne strukture
= Prisutne u svim eukariotskim organizmima i arheama
= Informacija za circRNK - u genima za proteine i lncRNK
- Nastaju splajsovanjem unazad ili prilikom isijecanja introna
- Splajsovanje unazad - 10% događaja splajsovanja
> Međutim, ima ih mnogo više u ćeliji (10x više zastupljeni) jer imaju dug poluživot u odnosu na linearne iRNK

= Tipovi kružnih RNK:

1. Egzon-egzon - nastaju splajsovanjem unazad
   - Transportuju se u citoplazmu
   - Učestvuju u raznim procesima
2. Egzon-intron - nastaju splajsovanjem unazad
   - Sa U1 snRNP stimulišu tsk sopstvenog gena
3. Intronske - nastaju isijecanjem introna tokom splajsovanja
   - Intron nosi signal koji onemogućava linearizaciju i degradaciju
   - Stimulišu elongaciju roditeljskog gena pomoću interakcije sa RNK Pol

= Splajsovanje unazad - jedan vid AS gdje se 5’ mjesto splajsovanja poveže sa nekim od 3’ mjesta splajsovanja koji se nalaze uzvodno od njega
= Splajsovanje unazad se favorizuje ako:
- Invertovane Alu sekvence okružuju egzon - komplementarno se spare
> Ne dešava se nužno jer se Alu sekvence mogu editovati pomoću ADAR proteina + učestvovanjem RNK helikaza
- Neki regulatorni proteini utiču na favorizovanje ovog vida splajsovanja
- Egzoni su dugi -> vjerovatnoća za interakciju trimernog kompleksa sa U1 i U2 se povećava

= Kružne RNK u nukleusu - funkcija u stimulisanju transkripcije roditeljskog gena
- Mogu biti molekuli vodiči

= Kružne RNK u citoplazmi - različite funkcije:
1) Molekuli mamci = endogeni sunđeri za miRNK i RBP
2) Molekulski rezervoari proteina - vežu neke RBP koji se tako skladište -> obezbjeđuju brz odgovor ćeliji na signale koje prima
3) Proteinske potke -> kolokalizacija enzima i njihovih supstrata -> kinetika enzimske reakcije
4) Modulacija funkcije proteina sa kojim se asociraju
5) Molekuli vodiči - mogu voditi proteine do specifičnih regiona u genomu (nukleusni) ili do nekih kompartmenata u ćel.

= Degraduju se endonukleolitički
- Posredovano malim nekodirajućim RNK ili RNazomL

Question 50

51. Kružne RNK - modeli djelovanja

Answer 50

1. Vezuju RBP i miRNK
   - Molekuli mamci (endogeni sunđeri) - zarobljavanje miRNK i RBP i regulisanje raznih procesa u ćel. i ekspresije gena
   - Proteinske potke (kolokalizacija enzima i njihovih supstrata) - utiče na kinetiku enz. reakcija
   - Molekuli vodiči
2. Egzon-intron circRNK - stimulacija inicijacije tsk roditeljskog gena
   Intronske circRNK - stimulacija elongacije tsk roditeljskog gena
3. Neke imaju ORF - sinteza proteina se vrši sa njih
   - Mehanizmi:
   > IRES sekvence (unutrašnja mjesta za vezivanje ribozoma) - direktna regrutacija ribozoma
   > Neki RBP prepoznaju epigenetičku oznaku m6a (razlikuje ih od stranih circRNK) -> RBP regrutuju ribozom
   - Nepoznata funkcija ovih polipeptida - mžd negativan efekat jer utiče na sintezu proteina sa lineranih iRNK
4. Samo splajsovanje unazad može biti regulatorni mehanizam - modulisanje splajsovanja linearne prekursorske iRNK
5. Mogu biti rezervoari proteina
   - Brz odgovor na stimuluse
   - Odbrana od virusa - asocijacija sa proteinskom kinazom R

Question 51

52. Kompetirajuće endogene RNK

Answer 51

= Hipoteza o kompetirajućim endogenim RNK - tvrdi da se RNK molekuli ne regulišu pasivno uz pomoć miRNK i RBP, nego da su i oni sami regulatorni molekuli u RNK regulatornoj mreži
= Kompeticija između različitih vrsta RNK (lncRNK, iRNK, transkripata pseudogena i circRNK) za trans faktore koji ih regulišu i za koje imaju vezivna mjesta - miRNK i RBP - dovodi do smanjenja efektivne koncentracije ovih molekula u ćeliji koji su dostupni za regulaciju ostalih koji ih nisu vezali
- Samim tim RNK molekuli međusobno “komunciraju” vezivnim mjestima za trans faktore i indirektno jedni drugima regulišu ekspresiju

= Omogućeno time što:
- 1 miRNK/1 RBP reguliše više RNK molekula
- 1 RNK molekul ima vezivna mjesta za više različitih miRNK i RBP
= Dolazi do kompleksne kombinatorne kontrole ekspresije

= Stvara se složena mreža regulacije ekspresije

= Ako posmatramo da miRNK najčešće ima represorni efekat -> ako neki transkripti vežu više miRNK i smanje njenu efektivnu konc. u ćeliji -> povećanje ekspresije ostalih transkripata koji je ne vezuju