MANIPULACIÓN DE GENES. ANÁLISIS DE ÁC. NUCLEÍCOS: PCR, BLOT Y ELISA Flashcards
Pasos de extracción de DNA por técnica de fenol-cloroformo
Lisis de células y liberación de DNA
Extracción de proteínas y lípidos con solventes orgánicos
Precipitación de DNA
Lavado de DNA
Lisis de eritrocitos se realiza con
Cloruro de amonio
Lisis de membranas celulares y nucleares se realiza con
SDS (dodecilsufato sódico)
La extracción de proteínas y lipidos se realiza con
Febol:cloroformo:alcohol isoamilico 25:24:1
Fases de la extracción de proteínas y lipidos con solventes orgánicos
Fase orgánica: Fenol: lipidos, proteínas y de risa celulares.
Fase acuosa: ácidos nucléicos
Precipitación de DNA se realiza con
Sol salina saturada
Etanol 100%
Lavado de DNA se realiza con
Etanol 70%
Agua
Cuantificación de DNA se hace con
Espectrofotometría o fluorometria.
Espectrofotometría
Cualquier solución con moléculas suspendidas permite el paso de un haz de luz a través de ella en proporción inversa a la cantidad de moléculas que contiene.
Mientras más luz absorba mayor concentración.
Absorción de RNA y DNA
260 nm
Absorción de proteínas
280 nm
Absorción de fenol
270 nm
Fluorometría
Unión especifica de colorantes fluorescentes al ácido nucleico.
Absorbe la luz a una determinada longitud de onda y emite una longitud de onda superior.
La concentración es proporcional a la intensidad de emisión fluorescente.
Para una PCR se requiere:
Secuencia de DNA
Enzima DNA polimerasa
Desoxiribonucleotidos (dNTP)
Primers
Buffer/cofactores (amortiguadores)
Enzima que polimeriza una cadena de DNA tomando como molde una preexistente.
DNA polimerasa
Thermus aquaticus (Taq)
Soporte 95°C
Desoxiribonucleótidos
dATP, dCTP, cGTP, dTTP
Amortiguador de DNA polimerasa debe tener
pH adecuado (8.4)
Cofactor de la Taq polimerasa
Magnesio
Iniciadores de PCR (primers)
Lo que determina el inicio y el término de la región que se va amplificar.
Se diseñan y utilizan para reconocer secuencias blanco en el DNA molde.
Son cortos de 18 a 24 nt.
No debe de ser autocomplementario.
No debe de formar estructuras secundarias.
Los iniciadores de PCR proporcionan
Un extremo 3’
Forward 5’ a 3’
Los iniciadores de PCR tienen alto contenido en
GC
Fases de la reacción en cadena de la polimerasa
Desnaturalización
Hibridación
Extensión
En una PCR. ¿Qué sucede en la desnaturalización?
Se separan las cadenas de DNA
Temperatura necesaria para la desnaturalización en PCR
95°C (20 a 30 seg)
En una PCR. ¿Qué sucede en la hibridación?
Los primers se alinean al extremo 3’ e hibridan con su secuencia complementaria.
Temperatura necesaria para la hibridación en PCR.
50 a 60°C
Tm = ((4G + C) + ( 2A +T))
En una PCR. ¿Qué sucede en la extensión?
La Taq polimerasa actúa sobre el complejo templado de primers. Agrega dNTP’s complementarios para crear cadenas completas de ADN.
Temperatura necesaria para la extensión en una PCr
72°C
Al final de la PCR se realiza un
gel de electroforesis.
Es una técnica utilizada para separar el ADN, el ARN, o moléculas o proteínas en base a su tamaño y carga eléctrica.
Electroforesis
Genera campo eléctrico alrededor de un gel, cuenta con dos polos que se conectan a una fuente de energía.
Cámara de electroforesis
¿Qué es el gel de agarosa y qué hace?
Polisacárido extraído de algas marinas.
Separa fragmentos de ácido desoxirribonucleico que van de 100 pb a 25 kb.
La concentración de agarosa se escoge según
El tamaño del ácido nucleico que se vaya a analizar.
El tamaño de los poros de la matriz del gel de agarosa depende de
la concentración de agarosa utilizada
La concentración de agarosa es inversamente proporcional al
Tamaño del poro obtenido
Son una mezcla de moléculas de DNA o de proteínas que permite determinar por comparación del tamaño de las moléculas contenidos en las muestras sometidas a electroforesis.
Marcador de peso molecular
¿Los pasos de la PCR se repiten?
Si, la amplificación de una secuencia de DNA se realiza de manera exponencial.
Se repiten las fases de 20- 30 veces (ciclos)
Donde se realiza la reacción en cadena de la polimerasa.
Termociclador
(Establece un sistema homogéneo, donde la temperatura y tiempo no se modifique en cada ciclo)
¿Cómo funciona la electroforesis?
Se utiliza una corriente eléctrica para mover las moléculas y que se separen a través de un gel.
Los poros en el gel actúan como un colador, permitiendo que las moléculas más pequeñas se muevan más rápido que las grandes.
Técnica de laboratorio utilizada para detectar una secuencia específica de ADN en una muestra de sangre o tejido.
Southern Blot
Técnica de laboratorio que se utiliza para detectar una secuencia de ARN específica en una muestra de sangre o de tejido.
Northern Blot
Técnica de laboratorio utilizado para detectar una proteína específica en una muestra de sangre o tejido.
Western Blot
¿Para qué sirve una PCR?
Para amplificar/identificar secuencias de DNA
Sirve para estudiar la expresión de muchos genes al mismo tiempo. Se colocan secuencias génicas en un portaobjetos de vidrio, llamado chip.
Microarreglos
