Manipulación De Genes Flashcards
Rotura específica del DNA mediante nuclesas de restricción, que facilitan enormentente el aislamiento y manipulación de los genes, individualmente.
Técnicas más importantes de la tecnología del DNA recombinante
Contituye un conjunto variado de técnicas, algunas de las cuales son nuevas y otras han sido adoptadas de otros campos de la ciencia.
Tecnología del DNA Recombinante
Las enzimas de restricción también se les conoce como:
Endonucleasas
Cortan los enlaces fosfodiéster a partir de una secuencia específica que reconocen en la cadena de DNA.
Enzimas de restricción
Cuál es la secuencia que reconocen las enzimas de restricción?
Una secuencia palindrómica
Qué es una secuencia palindrómica?
Una secuencia que se lee igual en ambas direcciones
De dónde son extraídas las enzimas de restricción?
Son extraídas de bacterias
Cuál es la acción de las enzimas de restricción?
Actuar como mecanismo de defensa para degradar material genético extraño que entre en la célula.
Cortan a manera escalonada en dos puntos diferentes
Cohesivos o pegajosos
Las moléculas de DNA producidas mediante la unión de dos o mas fragmentos de DNA se denominan:
Moléculas de DNA recombinante.
Los fragmentos de DNA que tengan los mismos fragmentos cohesivos se pueden unir mediante…
Mediante el apareamiento de bases complementarias entre sus extremos cohesivos.
Mediante qué técnica pueden separarse las moléculas de DNA de diferentes tamaños?
Electroforesis de DNA
Gel de polisacárido extraido de algas.
No tóxico.
Poco poder de resolución pero alto grado de separación.
Separa fragmentos de DNA de 200 a 50,000 pb
Agarosa
Gel de polímero de acrilamida. Tóxico. Menor grado de separación pero alto poder de resolución. Usado para fragmentos de DNA de 500 pb. Usado para separar mezclas de proteínas
Poliacrilamida
Técnica usada para separar y purificar macromoléculas (i.e. proteinas, ácidos nucleicos) que varían en tamaño, carga o conformación.
Electroforesis
Cuando moléculas cargadas son colocadas en un campo eléctrico, estas migran hacia el polo positivo (ánodo) o polo negativo (cátodo) de acuerdo a su carga.
Electroforesis
En qué geles las bandas de DNA serán invisibles a menos que el DNA esté marcado o teñido de alguna manera (bromuro de etidio).
En los geles de agarosa o de poliacrilamida
Factores que afectan a la velocidad de migración de los fragmentos de DNA en geles de agarosa:
- Tamaño del fragmento de DNA
- Concentración de agarosa
- Voltaje
- Composición del buffer
La clonación de DNA, con el uso de vectores de clonación o de la reacción en cadena de la polimerasa, de tal forma que una molécula sencilla de DNA puede ser reproducida generando muchos miles de millones de copias idénticas.
Tecnología del DNA recombinante
Acción de realizar copias idénticas de una molécula de DNA (elemento genético autoreplicativo y PCR)
Clonación del DNA
Aislamiento de un fragmento de DNA del resto de la célula (Vectores de clonación)
Clonación de DNA
Secuencias de DNA de diferente naturaleza, que pueden reproducirse autónomamente y en los cuales es posible introducir otras secuencias nucletídicas.
Vectores moleculares
Tipos de vectores moleculares
- Plásmidos
- Bacteriófagos
- Cósmidos
(Quimeras que convinan las caracerísticas de ambos vectores)
Colección de clones formados a partir de todos los fragmentos de DNA obtenidos previamente por escisión (enzimas de restricción) del genoma de una especie o un tejido
Bibliotecas de DNA genómico
Se ha cortado al azar en pequeños fragmentos, solo algunos contendrán genes enteros y otros tendrán DNA no codificante.
Biblioteca de DNA genómico
Qué es la retrotranscripción? Y por medio de qué enzima se lleva acabo este proceso?
Paso de RNA a DNA, por medio de una enzima retrotranscriptasa
Se emplean para amplificar el DNA de interés
Vectores de clonación
Se emplean para expresar el DNA de interés.
Vectores de expresión
Se utiliza para obtener un clon genómico o de cDNA
PCR
Qué contienen las secuencias de DNA responsables de la variabilidad?
Contienen una serie de secuencias cortas repetidas (STR) y se encuentran en varias posociones del genoma humano.
Hibridación de los ácidos nucleicos, que hace posible localizar secuencias determinadas de DNA o de RNA con una gran exactitud y sensibilidad, utilizando la capacidad que tienen estas moléculas de unirse a secuencias complementarias de otros ácidos nucleicos.
Tecnología del DNA recombinante
Se basan en la gran especificidad de la interacción entre bases complementarias
Ensayo de hibridación
Para que la hibridación permita identificar en un genoma una secuencia particular se requieren dos elementos básicos:
- Secuencia blanco
- Sonda
Fragmento corto de ácido nucleico, de secuencia conocida y complementaria a la secuencia blanco, marcado de forma que permita su detección.
Sonda
Localización y cuantificación de cualquier secuencia blanco a la cual se pueda hibridar.
Papel de la sonda al estar marcada
Marcadores radiactivos: P32, H3 ó S35
Marcaje directo
Detección y registro de la hibridación se hace por autoradiografía: el soporte con el material hibridado se pone en contacto con una película fotográfica (del tipo empleado para las radiografías)
Marcaje directo
Marcadores no radiactivos, grupos indicadores: biotina, digoxigenina y fluoróforos
Marcaje indirecto
El marcador unido a la sonda no es detectable directamente; se le llama indicador. Para la detección, el indicador se une a una proteina detectora (anticuerpo), que lleva el marcaje.
Marcaje indirecto
Se basan en la mezcla de hebras sencillas de ácido nucleico muestra o blanco, no marcado, con la sonda de secuencia conocida, marcada, bajo condiciones experimentales que permitan el apareamiento entre las bases complementarias.
Ensayos de hibridación
Los ensayos de hibridación se pueden clasificar en dos grupos:
- Hibridación en un soporte sólido.
- Hibridación in situ.
Estos métodos han adquirido hoy en día un interés particular como herramientas muy válidas para el ánalisis de ácidos nucleicos y el diagnóstico de enfermedades moleculares con base genética.
Hibridación en un soporte sólido
La base de estos métodos es la inmovilización del DNA o RNA en nitrocelulosa y su detección por hibridación con la sonda marcada.
Hibridación en un soporte sólido
Esta técnica ha contribuido de forma notable a aumentar la potencialidad de la hibridación como herramienta analítica, constituyendo hoy día en bioquímica clínica el método habitual de análisis del DNA extraído de muestras de sangre, esputos, tejido y células
Southern blot (DNA)
Esta técnica se emplea principalmente para obtener información sobre el tamaño del RNAs y sobre el modelo de expresión de genes específicos, de una variedad de tejidos diferentes y tipos celulares.
Northern blot (RNA)
Metodológicamente, implica cinto etapas bien diferenciadas: fragmentación, separación electroforética, desnaturalización, transferencia, hibridación y detección.
(FEDTHD)
Southern blot
Es un tipo especializado de hibridación en soporte sólido, en la que la sonda se aplica sobre muestras en su ubicación natural.
Hibridación in situ tisular
Se realiza sobre organismos completos, cortes de tejido, células intactas, núcleos aislados.
Hibridación in situ
Es una modalidad de hibridación importante para detectar virus patógenos, diagnóstico de células cancerosas, estudiar cambios en la expresión génica, detectando secuencias en el RNA celular.
Hibridación in situ
Se realiza sobre preparaciones de cromosomas metafásicos o prometafásicos, tratadas con fijadores para preservar las características morfológicas del cromosoma
Hibridación in situ cromosómica
Para hacer accesible la secuencia de DNA, se trata la muestra con enzimas proteolíticas y se desnaturaliza el DNA por calor, álcali o formamida para permitir su hibridación con la sonda
Hibridación in situ cromosómica
Cuando se utilizan sondas marcadas en la hibridación in situ cromosómica con fluorescencia la técnica es llamada
FISH (fluorescence in situ hybridization)
En cuanto a sus aplicaciones, se ha convertido en una técnica con elevado potencial diagnóstico en cromosomopatias, genes tumorales, virología, etc.
Hibridación in situ cromosómica
Secuenciación rápida de todos los nucleótidos de un fragmento purificado de DNA, que hace posible identificar genes y deducir la secuencia de aminoácidos de las proteinas que los codifican.
Tecnología del DNA recombinante
Si la concentración de DNA no es suficiente, se amplifica la muestra por
PCR
La muestra de DNA de partida procede generalmente de la clonación celular, de amplificación por PCR o de la digestión con una enzima de restricción de un genoma, un cromosoma u otro fagmento de DNA
Secuenciación de ácidos nucleicos
Base de las variantes más utilizadas actualmente para la secuenciación a gran escala del DNA
El método de secuenciación de Sanger
Se basa en la interrupción controlada de la síntesis de una hebra complementaria durante la duplicación in vitro por la presencia de didesoxirribonucleósidos trifosfatados (ddNTPs).
Método de secuenciación de Sanger
Síntesis de un DNA complementario de longitud variable
Método enzimático o de Sanger
Provocan la detención de la reacción de síntesis de DNA.
Los didesoxinucleótidos, análogos estructurales a los desoxinuclótidos
La posibilidad de usar un fluorocromo distinto para cada una de las 4 reacciones de síntesis permite automatizar el método, de forma que se “lean” simultáneamente las hebras marcadas componentes de las 4 mezclas
Método de Sanger automatizado
Seguimiento simultaneo de la expresión de cada uno de los genes de una célula, utilizando microchips (microarreglos) de ácidos nucleicos que permiten efecutar simultaneamente decenas de miles de reacciones de hibridación
Tecnología del DNA recombinante
Las técnicas de hibridación, como el análisis tipo Northern, y la hibridación in situ para la detección del RNA, pueden revelar en que momento y en qué tejido se produce la transcripción de un gen, así como cuanto mRNA está siendo producido
Microarreglos
Permiten estudiar simultáneamente la expresión de miles de genes
Los microchips de DNA
Con esta técnica podemos ver los genes que se encuentran activados o inhibidos durante el crecimiento celular, una patologia determinada (cáncer, enfermedades neurodegenerativas, hepatitis, etc), o cuales genes responden a homonas, toxinas o a medicamentos
Microarreglos
Son mas que placas de silicio, vidrio u otro material, a cuya superficie se han adherido diversas moléculas de cDNA o bien oligonucleótidos de secuencias ligeramente diferentes, específicas para un determinado gen o región de DNA de interés
Microarreglos
Debido a que se conocen la secuencia y la posición exacta de cada sonda en el microchip, cualquier fragmento que hibride puede ser identificado?
Si
