Lectures Flashcards
Protein functions
- Ενζυματικές πρωτεΐνες
- Αποθηκευτικές (Ovalbumin -> a.a. for embryo)
- Ορμονικές (Thyroid hormone)
- Κινητικές (actin and myosin assembly)
- Αμυντικές (antibodies)
- Μεταφορικές (Ion channels)
- Υποδοχείς (b2 adrenergic receptors)
- Δομικές (collagen)
a-helix structures
- a-helix 3.6 residues per turn
- 310-helix 3 residues per turn
- peptoid
- polyproline 1 3.3 residues per turn
- polyproline 2 3 residues per turn
Forces holding proteins together
- Δισουλφιδικοί δεσμοί
- Δεσμοί υδρογόνου
- Ηλεκτροστατικές αλληλεπιδράσεις
- Υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις (Van der Waals)
Structure motifs with examples
- four-helix bundle (Growth hormones, cytokines, ferritins)
- helix-turn-helix (lactose operon operator)
- EF-hand (Calmoduline)
- Coiled-coil (collagen, keratine)
- Four Greek keys (γ-crystalline)
- b-a-b motif
- b-hairpin
- b-barrel (retinol binding protein)
- b-sheet and a-helix
- Globin fold (hemoglobin, myoglobin)
- Ridges and grooves model
- Amphipathic (PGLa, Mag2)
Γιατί να πρέπει οι πρωτεΐνες να λάβουν την τρισδιάστατη δομή;
Μέχρι η πρωτεΐνη να λάβει την τελική σταθερή τρισδιάστατη δομή της, οι ενδιάμεσες καταστάσεις είναι υψηλά ενεργειακά και μη ευνοϊκές. Ωστόσο οι ενδιάμεσες δομές είναι αρκούντως σταθερές έτσι ώστε να μην γυρνάνε στις προηγούμενες διαμορφώσεις αλλά να κατευθύνονται προς την σωστή διάταξη
Chaperones, Hsp70, chaperonins
Τα τσαπερόνια βοηθούν στην σωστή αναδίπλωση, η Hsp70 προσδένεται στις υδρόφοβες περιοχές, τα chaperonins αναδιπλώνουν πρωτεΐνες που δεν μπορούν να αναδιπλωθούν αυθόρμητα
Destabilized protein, protein aggregate, amyloid fibril
Destabilized protein: διαμόρφωση χαμηλής σταθερότητας, μπορεί να έχει διαφοροποιημένη δευτεροταγής δομή ή φτωχές αλληλεπιδράσεις στην τριτοταγή, συνήθως έχει μερική βιολογική δραστικότητα, πιο ευαίσθητη στην πρωτεόλυση από την εγγενή
Protein aggregate: άμορφα, αδιάλυτα συσσωματώματα πρωτεΐνης, είναι αποτέλεσμα ενδομοριακών υδροφοβικών αλληλεπιδράσεων μεταξύ μη σωστά αναδιπλωμένων πρωτεϊνών, διαλύεται εύκολα σε ρυθμιστικό διάλυμα που προσομοιάζει το βέλτιστο περιβάλλον
Amyloid fibril: αδιάλυτα ινίδια πρωτεϊνικών συσσωματωμάτων που σχηματίζονται από β πτυχές στοιβαγμένες σε μοτίβο β-σταυρού, πολύ ανθεκτικά στην πρωτεόλυση, χρειάζεται πολύ υψηλή συγκέντρωση αποδιατακτικών παραγόντων ή απορρυπαντικών για τα επαναδιαλυτοποιήσουν
Protein folding defect results
- Αλλαγή στην βιολογική δραστικότητα
- Συσσωματώματα και σχηματισμός ινιδίων
- Αποσταθεροποίηση
- Λάθος αναδίπλωση και αποικοδόμιση
- Λάθος ή καθόλου μεταφορά της (mistraficking)
Θερμοσταθερές πρωτεΐνες, προσαρμογές στην δομή/αλληλουχία
Δομή:
- Αύξηση της δομικής ακαμψίας
- Λιγότερες κοιλότητες και θαμμένων πολικών καταλοίπων στην πρωτεΐνη
- Πιο συμπαγείς μετουσιωμένες καταστάσεις
Αλληλουχία:
- Αύξηση μη πολικών αμινοξέων
- Αύξηση φορτισμένων αμινοξέων (ιδιαίτερα αργινίνη και γλουταμικό οξύ)
- Αύξηση των αρωματικών αμινοξέων
- Μείωση της μεθιονίνης και των μη φορτισμένων πολικών καταλοίπων
Rossmann Fold
β-α-β-α-β-α-β. Στην ενδιάμεση περιοχή βρίσκεται το ενεργό κέντρο, όπου συνδέονται NAD, FMN. Είναι noucleotide binding domain και δεν συνδέεται με DNA. Το ενεργό κέντρο δεν βρίσκεται πάνω στο εσωτερικό των α- ή β- δομών, αλλά στην εσοχή των δύο βασικών μοτίβων (β-α-β Χ2) στο loop.
Παράδειγμα: αφυδρογονάση του μηλικού
Δομή αντισωμάτων
Χαρακτηριστική δομή Υ, β-πτυχωτές δομές που ενώνονται με loops και σχηματίζουν την βαριά και την ελαφριά αλυσίδα. Έχουν μεταβλητές και αμετάβλητες περιοχές. Τα γονίδια των αντισωμάτων βρίσκονται σε διαφορετικά χρωμοσώματα
Anti-freeze proteins
AFGP - μια περιοχή του τρυψινογόνου (πρωτεΐνη trypsinogen) επαναλαμβάνεται. Δεν επιτρέπουν τη δημιουργία πάγου στο εσωτερικό του κυττάρου (κρυστάλλους)
Convergent evolution (συγκλίνουσα)
Ίδια λειτουργία χρησιμοποιώντας είτε τον ίδιο είτε διαφορετικό μηχανισμό. πχ Trypsin, subtilisin, alpha/beta hydrolase/ CheB methylesterase (έλικα-στροφή-έλικα)
Divergent evolution (αποκλίνουσα)
Πρωτεΐνες που βρίσκονται στην ίδια οικογένεια ή έχουν όμοια δομή, επιτελούν διαφορετικές λειτουργίες πχ AAAD enzymes (PsTyDC/CrTDC/AtPAAS/Rr4HPAAS)
Promiscuous enzymes
Επιτελούν δύο λειτουργίες και χρησιμοποιούν το ίδιο ενεργό κέντρο και για τις δύο. πχ
α χιμοθρυψίνη, αλκαλική φωσφατάση, αρυλοσουλφατάση Α, εξωνουκλεάση 3, φωσφοτριεστεράση, ουρεάση
moonlighting proteins
Έχουν δύο ή περισσότερες διαφορετικές λειτουργίες, στις περισσότερες περιπτώσεις η δεύτερη λειτουργία δεν είναι ενζυμική. πχ κυτόχρωμα c, ακονιτάση, κυκλοφιλίνη, ενολάση
homeodomain proteins
Αυτές οι πρωτεΐνες έχουν σημαντικό ρόλο στην διαφοροποίηση των ευκαρυωτικών οργανισμών. Οι μεταγραφικοί παράγοντες ανήκουν σε αυτήν την κατηγορία. Έχουν περιοχές 60 αμινοξέων και αποτελούνται από 3 έλικες. Στην πρώτη έλικα υπάρχουν υδρόφοβα αμινοξέα που αλληλεπιδρούν με τα αντίστοιχα της τρίτης. Αυτά τα αμινοξέα είναι συντηρητικά. Η τρίτη έλικα προσδένεται στο DNA. Έχουν δομικό μοτίβο
helix-turn-helix-turn-helix
symmetric leucine zipper
Αυτοί οι μεταγραφικοί παράγοντες έχουν μια α-έλικα η οποία ανά 7 αμινοξέα έχουν λευκίνη. Έτσι δημιουργείται μια υδρόφοβη περιοχή στην πρωτεΐνη η οποία μοιάζει με φερμουάρ και δίνει την δυνατότητα διμερισμού. Ωστόσο και τα υδρόφιλα αμινοξέα συμμετέχουν στην σταθεροποίηση της δομής. Υπάρχει επίσης μια περιοχή πλούσια σε βασικά αμινοξέα που αναγνωρίζουν το DNA.
Παράδειγμα: Fos-Jun (ετεροδιμερές)
Helix-loop-helix motif MyoD
Δύο έλικες ενώνονται με loop (το loop αυξάνει την σταθερότητα μέσω αλληλεπιδράσεων με το DNA), αλληλουχία που χρησιμοποιείται για αλληλεπίδραση με το DNA. Το δομικό μοτίβο είναι ίδιο αλλά αλλάζοντας την ακολουθία των αμινοξέων καθορίζεται με ποια ακολουθία θα αντιδρά.
Χαρακτηριστικό παράδειγμα αυτού του μοτίβου είναι ο μεταγραφικός παράγοντας MyoD, είναι ετεροδιμερές που αποτελείται από τα μονομερή Mad και Max. Όταν υπάρχουν και τα δύο μονομερή δεν υπάρχει μεταγραφή του γονιδίου, με την αύξηση της παρουσίας του Myc, επάγεται η μεταγραφή γιατί παίρνει την θέση του Mad
Συνήθως σε μεταγραφικούς παράγοντες/οπερόνια
Isozymes
Τα ισοένζυμα είναι πρωτεΐνες με διαφορετική δομή οι οποίες καταλύουν την ίδια αντίδραση. Συχνά πρόκειται για ολιγομερή που κατασκευάζονται με διαφορετικές πολυπεπτιδικές αλυσίδες, οπότε
διαφέρουν συνήθως ως προς τους ρυθμιστικούς μηχανισμούς και τα κινητικά χαρακτηριστικά
Παράδειγμα: γαλακτική αφυδρογονάση, διαφορετικά τετραμερή σε καρδιά και μύες
TIM barrel
Εναλλασσόμενες β- με α- και οι β- είναι παράλληλες. Δημιουργείται ένα βαρέλι με τις β- να σταθεροποιούνται με δεσμούς υδρογόνου μεταξύ τους. Το ενεργό κέντρο βρίσκεται στα loops στην επιφάνεια της πρωτεΐνης ωστόσο εαν η πρωτεΐνη εμπλέκεται σε μεταφορά, το υπόστρωμα τοποθετείται στο εσωτερικό όπως στη βιταμίνη Α
EF hand
Δύο έλικες που μεταξύ τους αλληλεπιδρούν λιγότερο από την δομή έλικα-στροφή-έλικα. Στο loop υπάρχουν 12 αμινοξέα και εκεί δεσμεύεται ασβέστιο.
Παράδειγμα: καλμοδουλίνη (calmodulin), διμερές, όταν η συγκέντρωση του ασβεστίου ελαττώνεται μόνο η μια θέση δεσμεύει ασβέστιο, όταν αυξάνεται δεσμεύουν και οι δύο και η δομή της πρωτεΐνης αλλάζει
Παραδείγματα modules
EGF: Περιοχές ομόλογες με τους επιδερμικούς αυξητικούς παράγοντες, οι οποίοι είναι μια μικρή πολυπεπτιδική αλυσίδα 53 αμινοξέων
Chymotrypsin: περιοχές πρωτεϊνάσης της σερίνης που είναι ομόλογες με την χυμοθρυψίνη η οποία έχει περίπου 245 αμινοξέα κατανεμημένα σε δύο περιοχές
Κ: περιοχή Κρινγκλ, έχει χαρακτηριστικό μοτίβο τριών δισουλφιδικών γεφυρών σε μια περιοχή περίπου 85 αμινοξέων
Calcium binding domain
Μηχανισμός σηματοδότησης κινάσης της τυροσίνης
Υπάρχουν ως μονομερή στην μεμβράνη, όταν το υπόστρωμα συνδεθεί στο μονομερές, η πρόσδεση του δεύτερου μορίου του υποστρώματος ευνοείται και οι υποδοχείς διμερίζονται επάγοντας και την φωσφορυλίωση της περιοχής της κινάσης της τυροσίνης. Δεύτερη τρανσφωσφορυλίωση συμβαίνει και δεσμεύονται ενδοκυτταρικά υποστρώματα, πρωτεΐνες ενεργοποιούνται και το σήμα μεταφέρεται
Autoinhibition
Μια ευέλικτη περιοχή του υποδοχέα έχει υψηλή συγγένεια με τον υποδοχέα. Η αλλαγή στην κατάσταση της ευέλικτης περιοχής γίνεται με φωσφορυλίωση ώστε η πρωτεΐνη να ενεργοποιηθεί και να μπορεί το υπόστρωμα να προσδεθεί.
Παράδειγμα: protein Kinase A PKA
Bacterial two-component signaling system
- TCS domain
- Kinase core
- Extracytoplasmic sensor domain
- HAMP domain
- Cytoplasmic domain
Σύμπλεγμα συνάντησης: DNA Polimerase + clamp
Το ένζυμο ξεκινά μια διεργασία και δε σταματά μετά από κάθε βήμα. Πρέπει να έχει την καταλυτική ικανότητα και να διατηρεί το υπόστρωμα που επεξεργάζεται προσδεδεμένο. Η ‘‘δαγκάνα’’ δεσμεύει το DNA ώστε να δράσει σε αυτό το ένζυμο
Kcat/Km
Kcat είναι η καταλυτική σταθερά για τη μετατροπή του υποστρώματος σε προϊόν
Km είναι η σταθερά Michaelis
Σχηματισμός και λειτουργία γλυκογόνου
Είναι αποθηκευτικό μόριο. Αποτελείται από πολυμερισμένη γλυκόζη. Η γλυκογενίνη μέσω αυτογλυκοσυλίωσης ξεκινάει να δημιουργεί την αλυσίδα και με την βοήθεια της συνθάσης του γλυκογόνου την επιμηκύνει. Η γλυκογενίνη προσδένεται σε ακτίνη και ξεκινάει να δημιουργείται το σφαιρίδιο το οποίο έχει ουρές ακτίνης και έτσι τα σφαιρίδια μπορούν και να ενώνονται
PHAs (Polyhidroxyalkanoates)
Αποθήκη άνθρακα, και αυτά τα σφαιρίδια έχουν πάνω τους τα ένζυμα που χρειάζονται για τον σχηματισμό και την αποικοδόμισή τους. Οι φασίνες περικλύουν τα σφαιρίδια. Η αποπολυμεράση αποικοδομεί. Το πείραμα αυτό έδειξε ότι χωρίς την πολυμεράση ή τις φασίνες, τα σφαιρίδια δεν σημιουργούνται
Sticky arms
Βραχίονας της πρωτεΐνης που την βοηθά να μεταφέρει το υπόστρωμα στο ενεργό κέντρο. Θέλουμε μικρή ευελιξία ώστε με μικρή αλλαγή να αναγνωρίζεται το υπόστρωμα από την πρωτεΐνη.
SH2 domains
Αναγνωρίζει φωσφορυλιωμένες τυροσίνες. Στην περιοχή που γίνεται η αναγνώριση υπάρχουν αμινοξέα που αναγνωρίζουν την ακολουθία P-Tyr-Glu-Glu-ile, όπου Ρ η φωσφορυλίωση
SH3 domains
Αναγνωρίζει πολυπρολίνες, λόγω της προλίνης οι δομές είναι πιο άκαμπτες με μικρή ευελιξία
Πέρα από την καταλυτική όψη, τα ένζυμα έχουν δύο επιπλέον όψεις:
Η ρυθμιστική περιοχή δεσμεύει ένα ligand που τροποποιεί τον ρυθμό και την εξειδίκευση των ενζύμων.
Η κοινωνική όψη συνδέει το ένζυμο με άλλα συστατικά, όπως μια μεμβράνη ή ένα scaffold, ή συγκροτεί σύμπλοκα με άλλα ένζυμα.
Πως απομονώνουμε τα σύμπλοκα των πρωτεϊνών;
- Εκφράζουμε την πρωτεΐνη με ουρά πολυιστιδινών ώστε να την απομονώσουμε μαζί με τα μόρια με τα οποία αλληλεπιδρά
- cross-linking, όπου δημιουργούνται ομοιοπολικοί δεσμοί πάνω στην πρωτεΐνη. Ανάλογα το μήκος του linker, μπορεί να ταυτοποιηθεί και η απόσταση των αμινοξέων.
- Χρωματογραφία μοριακού αποκλεισμού και μετά φασματομετρία μάζας για αναγνώριση πρωτεϊνών και συμπλόκων.
- two hybrid system σε ζυμομύκητες, εκφράζουμε τη μία πρωτεΐνη με κομμάτι από έναν μεταγραφικό παράγοντα ο οποίος αναγνωρίζει το DNA. Η άλλη πρωτεΐνη εκφράζεται με το υπόλοιπο κομμάτι του μεταγραφικού παράγοντα που είναι απαραίτητο για την ενεργοποίηση της διαδικασίας της μεταγραφής. Αυτό βρίσκεται σε γονίδιο δίνει σήμα. Αν υπάρχει σήμα οι πρωτεΐνες αλληλεπιδρούν
- Μπορούμε επίσης να εισάγουμε στην πρωτεΐνη μια λιγάση της βιοτίνης που μπορεί να προσδένει τη βιοτίνη πάνω στα διάφορα μόρια. Έτσι, η λιγάση εισάγει βιοτίνες πάνω στα μόρια γύρω απ’ αυτήν. Άρα, αν αλληλεπιδρούν, αυτές θα βιοτινυλιωθούν.
Παραδείγματα Multienzyme Complexes με βραχίονα
- Αφυδρογονάση του πυροσταφυλικού
- Αφυδρογονάση του α-κετογλουταρικού
- Αποκαρβοξυλάση της γλυκίνης
- Καρβοξυλάση του πυροσταφυλικού
Απο ποιές υπομονάδες αποτελούνται οι πολυενζυμικές αφυδρογονάσες;
- Ε1 - αποκαρβοξυλάση: Κάνει την αποκαρβοξυλίωση του υποστρώματος (π.χ. πυροσταφυλικό ή α-κετογλουταρικό). Συμπαράγοντας είναι η πυροφωσφορική θειαμίνη
- Ε2 - Τρανσακετυλάση: Μεταφέρει την ακετυλομάδα (ή άλλη ομάδα) στο συνένζυμο Α (CoA) με συμπαράγοντα το λιποϊκό οξύ.
- Ε3 - Αφυδρογονάση: Αναγεννά τη λιποϊκή ομάδα της E2, ώστε να μπορεί να ξαναχρησιμοποιηθεί. Ως συμπαράγοντας είναι το FAD και NAD⁺
Ποιά χαρακτηριστικά έχουν οι περιοχές των διαμεμβρανικών πρωτεϊνών ένδο- και έξωκυτταρικά;
Ενδοκυτταρικά:
1. inside positive rule: Τα θετικά αμινοξέα στο εσωτερικό υπερτερούν
2. Nucleotide binding domains
3. proteolytic sites
4. lipid anchors
5. phosphorylation
Εξωκυτταρικά:
1. Proteolytic site
2. glycosylation N-,O-linked
3. single sequence
