Klausur Flashcards
Epigenetik
Beschreibt molekulare Mechanismen, die zu einem stärkeren oder schwächeren Ablesen von Genen (mitotische/meiotische Veränderung) führen, ohne dass die dort gespeicherte Information verändert (mutation) wird.
=unterschiedliche Genexpression im selben Genom
Euchromatin
lose Chromatinstruktur
- > hohe Transkriptionsaktivität
- Hyperacetyliert
- Zellkerninneres
Heterochromatin
kondensiert -> genetisch inaktiv
- hypoacetyliert
- Zellkernrand
- konstitutiv:
- > repetetiv(Telomer, Zentromer)
- > in allen Zellen
- fakultativ: kann reversibel die Eigenschaften von Euchromatin annehmen (zB in Barr-Körperchen)
- > nicht in allen Zellen
Nucleosom
- besteht aus je einem Paar der Histone H2A, H2B, H3 und H4
- bildet einen Proteinkern
- um ein Nukleosom sind ca. 150 Basenpaare gewickelt
H1 an Ein-/Austrittsstelle
Histonmodifikationen
- Methylierung (Lysin + Arginin)
- Acetylierung (Lysin)
- Phosphorylierung (alle AS mit OH-Gruppe)
- Ubiquitilierung (Lysin-Ubiquitin)
- Sumoylierung (Lysin-Sumo)
-> meistens in endterminalen Aminotermini
(oder an globulärer Domäne)
- > mehrere Modifikationen an einer Position (jedoch nur eine “aktiv”)
- > Interaktionen zw. Modifikationen und N-Termini
Barr-Körperchen
- heterochromatisches (kondensiertes) X-Chromosom in den Zellkernen weiblicher Säuger
- im Laufe der Embryonalentwicklung inaktiviert
- in jeder Zelle väterl. oder mütterl. inaktiviert (->Mosaik)
- vor Oogenese wieder aktiv
Writer
Enzyme, die eine Modifikation setzt
Ac: HATs
- bromodomain + catalytic HAT domain
- Co factor: Acetyl Co-A
- zB HAT1
Me:
Histon:
HMT
Specific: Lysin K oder Arginin R
- Typ I: PRMT (R)
- Typ II: SET + SAM (K)
- Typ III: Membrane associated HMT
- zB SETD
DNA:
DNMT
Reader
Enzym, das Modifikation umsetzt und “liest”
Ac: Bromo domain (TAF1 Transkribtionsaktivator)
Me:
Histon: Chromodomain – K9 ->HP1 ->Tudor -> Polycomb PHD
DNA: MBD (Me-CpG binding domain) Zinc finger (methyl-CpG binding)
Eraser
entfernt PTMs
Ac: HDAC (zB 11)
Me:
Histon: Demethylation - Cofaktor needed, Formaldehyd entsteht - LSD1 + FAD cofactor oxidation of Kme2 - Jumonji Domain + a-ketoglutarat hydroxiliert Kme3
DNA: - Passiv: bei Replikation und Zellteilung geht hemimethylierung verloren wenn Dnmt1 inaktiv - Activ: TET enzyme: 5mC -> 5hmC -> 5fC -> 5 caC
HATs
Histonacetyltransferasen
- homolog zueinander
- Cofaktor Acetyl-CoA
5 Familien:
- HAT1 (cytoplasmatisch)
- GCN5 (General Control of Nutrition) -> für Wachstum, Teil des SAGA-Komplexes, PCAF (humanes ortholog und Transkriptionsregulator)
- MYST
zB: MOF (spez. H4K16Ac, Dosiskompensationskomplex in D.m.)
zB: Sas3/Ybf2 (aktivierend)
zB: ESa1 (aktivierend & Zellzyklus-regulierend) - P300/CBP (metazoen-spezfisich)
- Rtt 109 (H3 K56Ac, Zellzyklus-regulierend)
GNAT: Sequenzkonservierung mit Gcn5 in katalytischer Domäne
HDACs
Histondeacetylasen (entfernen Ac.gruppe aus Histon)
Klassen:
I : HDACs 1, 2, 3 und 8
-> Rpd3-like (yeast)
-> Rpd3L: Rekrutierung an Promotoren, Deacetylierung, Repression
II: HDACs 4, 5, 6, 7, 9 und 10
-> Hda1-like (yeast)
III: Sirtuine (SirT 1-7)
-> Sir2-like
-> NAD+ als Co-Faktor
Sir2: Repression des Paarungstyp-Gen in Hefe
IV: HDAC 11
SAS-I-Komplexes
(something about silencin) / MYST Familie
- Histon-Acetyltransferase Sas2 (sas4, sas5)
- blockiert durch die Acetylierung von H4 K16 die Vermehrung von Heterochromatin an den Telomeren von S. cerevisiae
YEATs
Molekül, das an den Proteinbereich bindet, der modifizierte Lysin in den Histonen erkennt
Lysin-Demethylierung
durch Oxidation / Hydroxylierung
Genomic Imprinting
-> 2 Hypothesen zur Funktion
Paternale & maternale Allele eines Gens werden unterschiedlich exprimiert
->Expression hängt nicht von Gensequenz ab, sondern ob es von Mutter (Eizelle) oder Vater (Spermium) kommt
1) Parental conflict
- > Parental Wachstumsfördernd -> Fitness
- > Maternal wachstumshemmend -> gleiche Größe, egal welcher Vater, kleine Babys= weniger Arbeit
2) Trophoblast defense
- > Gene zur Plazentabildung bei Oocyte durch imprinting gesilenced
- > Embryonalentwicklung nur mit aktiven Genen von Männchen möglich
- > keine Partheogenese
Imprinting Diseases beim Menschen
Beckwith-Wiedemann-Syndrom
- > Kleines Hirn, Große Zunge, Bauchnabelbruch
- > Missexpression Igf2/H19
- > zB uniparental 2 Chromonomen von Vater oder hypermethylierung maternal= zu viel IGF2
Silver-Russell-Syndrom
- > Gegenteil BWS
- > zB paternales Gen defekt = zu wenig IGF2
Prader-Willi-Syndrom (PWS):
- > zu groß, mentale Verzögerung, Muskelhypotonie
- > Defektes Gen auf Chr15
- > Väterl. Chromosomenabschnitt nicht funktionstüchtig, bei maternal stillgelegt
Angelman-Syndrom
- > mental retardiert, neigen zu unkontrollierten Lachanfällen (happy puppet)
- > Mütterl. Chromosomenabschnitt nicht funktionstüchtig, bei paternal stillgelegt
- > fehlende Expression des UBE3A-Gens im Gehirn
PWS & AS sind reziprok miteinander verwandt
DNMT
DNA methyltransferase (u.a. Mensch)
- > hauptsächlich an Cs in CpG islands
- > homolog zueinander
DNMT1
- > Erhaltungs-Methylierung (Maintenance-Methylierung) bei der Zellteilung
- > erkennt hemi-methylierte DNA & methyliert vollständig
DNMT3a und DNMT3b
-> methylieren die CG-Dimere, die aufgrund von Zelldifferenzierungen neu methyliert werden (de-novo-Methylierung)
(DNMT2 methyliert t-RNA)
Desaminiertes, nicht methyliertes Cytosin
Uracil
Mit methylierung: thymin (5-methyl-uracil)
Bisulfit-Sequenzierung
Bestimmung vonDNA-Methylierungen durch
- > Reaktion mitBisulfit
- > unmethyliedte C zu U
- > PCR / microarray
- > Gegenstrang mit bisulfit: U + A (wird zu T)
- > Gegenstrang ohne bisulfit: C + G (wird zu C)
DNA-Sequenzierung:
- > zeigt unmeth. Cytosine als Thymine
- > zeigt meth. Cytosine als Cytosine
- > unbehandelte Cytosine als Cytosine
je geringer die Methylierungsrate, desto mehr muss sequenziert werden, um Aussage machen zu können
- chemische Behandlung schädigt die DNA
- > unerwünschte Fragmentierung der DNA
- > Verlust von wertvollem Probenmaterial
- > unvollständige Konversion von C (Nicht-Konversionsrate wird als methyliert fehlinterpretiert)
- > 5hmC wird auch nicht konvertiert, keine Unterscheidung von 5hmC und 5mC
ChIP-Experiment
Chromatin-Immunpräzipitation
Methode zur Analyse von Proteininteraktionen mit DNA
-> identifiziert Bindungsstellen von DNA-assoziierten Proteinen
- Formaldehyde um (alle) Proteine an DNA zu binden
- DNA schneiden (200-300 bp)
- >Sequenz-unspezifisches Scheren: Sonifikation
- >Sequenz-spezifisches Schreren: enzymatisch mit micrococco nuklease
IP
- gesuchtes Protein mit Antibody isolieren
- > beads die an AK binden oder magnetisch - Reverse cross-link
- > niedriger PH oder Hitze - DNA isolieren (Proteine (+ Histone) abwaschen)
- Seq-Adapter hinzufügen
- Analysieren der DNA-Fragmente
- > Real-Time PCR, microarray, high troughput Sequenzierung
Kontrolle zB ohne AK
-> wichtig, da AKs oft unspezifisch
RNA-Seq
Hochdurchsatzdaten zeigen, welche Gene aktiv sind und wie hoch sie transkribiert werden
1. RNA isolieren -> in Fragmente (200-300bp) -> in doppelsträngige DNA konvertieren -> Sequencing adapters hinzufügen -> PCR amplifikation der Fragmente mit Adapter -> Quality control (Konzentration und Fragmentlänge)
-> just high quality reads
- > align reads to genome (both in fragments -> bestimmen der Lokalisation
- > count reads per gene
- > Normalisieren
- > plot the data (PCA)
- > zeigt Ähnlichkeiten zwischen Genen
Anzahl Gene menschl. Genom
20 000
Acetylierung
neutralisiert die positive Ladung der Lysine/Histone
-> Zugang für DNA-bindende Proteinen
-> Aktivierung der Gen-Expression
-> bekannte Positionen: Lys 5, 8, 12, 16 (H4)
Lys 9, 14, 18, 23, 36 (H3)
-> bildet Bindedomänen für Reader-Proteine, die Bromodomänen und YEATS-Domänen tragen
Methylierung
wirkt sich nicht auf die Ladung der Histone aus
- > reguliert die Erkennung durch und die Wechselwirkung mit chromatinbindenden Proteinen, die für die Transkription wichtig sind
- > mono-, di-, und trimethyliert je unterschiedl. Funktion
- > SAM als Co-Faktor
PHD-Finger
Methylierung von Lysin- und Arginin-Resten bildet Bindestellen für Reader-Proteine mit PHD-Finger
zB in NURF: -> Crosstalk zwischen Methylierung und Acetylierung
Transgenerationelle Vererbung in der Epigenetik
- 3 Wissenschaftler die falsch lagen
Lamarck: “Organismen erwerben Eigenschaften und können diese vererben” (Gazelle streckt Hals -> Giraffe - jedoch Zufallsmutation)
Lyssenko. “”” Weizen auf Salzboden
Kammerer: Körperzeichnung des Salamanders wird unabhängig von Untergrund vererbt
Transgenerationelle Vererbung in der Epigenetik
RNA Interferenz in C. elegans
- > über mehrere Generationen deletiertes Gen
- > geringer durch Amplifikationsmechanismus
Linaria vulgaris und Mutante Peloria
- > keine DNA-Unterschiede aber in Methylierung
- > Epiallel über Generationen vererbt
Mais
-> Paramutation
-> Kreuzung zweier Merkmale und trotzdem alle phänotypisch gleich in F1 Generation
-> Imprint von Paramatagen auf Paramutiergen
(gibt es auch bei Mäusen)
Pflanzen mehr epigenetik:
- standortgebunden->Pflanze hat größere Bedürftigkeit sich an Umwelt anzupassen
- polyploid-> wird in Säugern meist nicht toleriert
- unterschiedliche Keimzellproduktion-> Pflanzen haben viele Blüten in denen sich Keimzellen befinden
- > somatisches Klonen bei Pflanzen sehr einfach
“you are what your dad ate”
experimentellen Modelle der Stoffwechselerkrankung
-> Umweltbelastung für Phänotyp der Nachkommen nicht nur mütterlicherseits liegt: Ernährungs- und Stoffwechselstatus des Vaters auch Effekt
Väter mit high fat/low protein diet (auch bei normaler Ernährung der Nachkommen)
-> durch Spermien vermittelt, möglicherweise durch epigenetische Markierungen in Keimzellen
-> eventuell posttranskriptioneller Einfluss durch Wirkung kleiner RNAs wie microRNAs (keine MicroRNA im Sperma, jedoch Unterschiede in Histonmarkierungen und RNA-Expression beobachtet -> Chromatinmodulation verändert)
Dosiskompensation
Die ungleiche Anzahl von Geschlechtschromosomen in den beiden Geschlechtern verlangt einen regulativen Ausgleich der auf ihnen gelegenen Gene
Säuger: Inaktivierung des X-Chromosoms bei Weibchen
Insekten (D. melanogaster):
- Männchen mit verdoppelter Transkription der X-chromosomalen Gene (Lyon-Effekt)
- MSL-Komplex: Proteine und nicht-kodierende DNA
- > auf gesamten X - Chromosom: erst an Loci (“high-affinity sites” HAS) -> effiziente Verteilung auf gesamten X-Chromosom
C.elegans
- Hermaphrodit
- > beide X-Chr. werden zur Hälfte runterreguliert
- > DCC Komplec:
- zwei Kondensinähnliche Komplexe bilden Ring -> DNA-Schleife durch Ring -> leichte Kondensation beider X-Chromosome und herunterregulation
Unterschiede zu anderen Organismen:
- Keine ncRNA
- Keine enzymatische Aktivität involviert
alle: bevorzugte Bindestellen
John Gurdon
1962:
- entfernte Kern einer befruchteten Eizelle aus einem Frosch und ersetzte ihn durch den Kern einer (somatischen) Zelle aus dem Darm einer Kaulquappe
- > modifizierte Eizelle wuchs zu einem neuen Frosch heran
- > beweist das reife Zelle noch die genetische Information enthielt, die zur Bildung aller Zelltypen notwendig ist
- > Verfahren: SCNT = somatic cell nuclear transfer
