Izpit

Question 1

E. coli v molekulski biologiji

Answer 1

E. coli je znana po tem, da hitro raste na gojiščih in da imamo za delo z njo veliko molekularnih orodij.

Je modelni organizem v molekularni biologiji.

Question 2

Kaj pridobivajo z E. coli v biotehnoloških potopkih?

Answer 2

Z e. coli pridobivajo:

• Inzulin
• Interlevkin-2
• Človeški rastni hormon, človeške faktorje strjevanja krvi
• Človeški interferon-beta
• Biogoriva in industrijske kemikalije (fenol, etanol, manitol…)

Question 3

Princip replikacije DNA.

Answer 3

Princip je enak pri vseh treh domenah (bakterije, arheje, evkarioti).

Ima tri stopnje:
- iniciacija (začne na mestu ori)
- sinteza DNA (dodajanje novih nukleotidov na mesto 3’ OH, dokler molekula DNA ni podvojena)
- terminacija (dogajanje se zaključi).

Razlike med prokarionti in evkarionti so v encimih in v hitrosti dogajanja, vedno pa more biti natančno.

Question 4

Replikacija DNA pri prokariotih.

Answer 4

Pri prokariontih poteka sinteza neprestano, ker celica vedno raste. Ko se podvajanje zaključi se začne nov cikel, mogoče že pred koncem prvega podvajanja. Imajo samo en ori.

Question 5

Replikacija DNA pri evkariotih.

Answer 5

Evkarionti imajo celični cikel s 4 fazami, v S fazi pride do podvajanja. Podvoji se celoten DNA, ker je velik genom je več mest ori. Je hitrejše.

Question 6

Semikonzervativno podvajanje DNA.

Answer 6

Materinska veriga se razpre, na vsaki verigi nastaja nova veriga (značilno za evkariote in prokariote).

Question 7

Opiši Meselson-Stahlov poskus.

Answer 7

Uporaba ultracentrifuge.
Običajno se doda cezijev klorid(CsCl) in DNA v centrifugirko, vrtenje pri velikih obratih, vzpostavi se gostotni gradient. Težja DNA bo bolj na dnu.

Vse bakterije sta gojila na gojišču N15, potem preneseta bakt. na gojišče z normalnim dušikom N14, počakamo 20 min, da se DNA podvoji in centrifugiramo.

Videla sta, da je DNA na vmesni višini. Sklepali so da je ena stara veriga imela ob sebi novo verigo z N. Ponovno čez 20 min pa so verige imele v večini samo N14 in bile še višje.

Question 8

Kateri encimi so pomembni pri replikaciji DNA?

Answer 8

DNA-polimeraze sintetizirajo DNA v smeri 5’->3’, ta rabi vedno ta 3’ konec. Ne zna začeti s polimerizacijo.

Primaze znajo naredit začetni del komplementarne verige, da nastanejo prosti 3’OH konci. Sinteza RNA - začetnega oligonukleotida.

Nukleaze, endonukleaze in 5’-eksonukleaze ter 3’-eksonukleaze.

DNAl-ligaze (lepi dva nukleotida skupaj).

Pomožni proteini (zavijanje DNA…).

Question 9

Kaj je replikacijski mehurček?

Answer 9

Replikacijski mehurček na mestu ori in se širi v obe smeri, imamo dvojne replikacijske vilice (prve slike s elektronskim mikroskopom).

Question 10

Polimerizacija nukleotidov.

Answer 10

Novonastajajoča DNA veriga raste v smeri 5’ proti 3’ z dodajanjem novih dNTP, ustreznih glede na matrico DNA, na 3’ mestu.

DNA polimeraza dodaja nove nukleotide - rabi prosto 3’-OH skupino.

Pri vezavi nukleotidov se sprosti dNTP.

Question 11

Opiši replikacijske vilice.

Answer 11

Topoizomeraza (omogoča sprostitev zavitja DNA) odstrani supernavitje.

Helikaza (razpre dvojno vijačnico).

SSB (Single-strand DNA-binding protein; proteini, ki ščitijo DNA in jo stabilizirajo).

Primaza - RNA polimerza (naredi začetne oligonukleotide iz RNA nukleotidov)

DNA polimeraza (dodaja nukleotide), sintetizira novonastajajočo verigo 5’ proti 3’.

Ligaza (poveže sosednja nukleotida s fosfodiestersko vezjo).

Vodilna veriga (hitrejša, ni večjih težav)

Zastajajoča veriga (DNA nastaja v fregmentih (okazakijevi fragmenti), polimeraza I zazna vrzel med fragmenti in svojo 5’-3’ eksonukleazno funkcijo odstranjuje RNA začetne oligonukleotide, da pride do DNA, ligaza zalepi).

Question 12

Opiši podvojevanje DNA.

Answer 12

DNA se vedno podaljšuje iz 5’-OH proti 3’-OH koncu. Sintezo novonastale verige omogoča encim DNA polimeraza.

Poznamo več vrst DNA polimeraz. Dodajajo deoksiribonukleotide na verigo glede na sekvence matrične DNA vedno od 5’ proti 3’ koncu. Te nukleotide dodajajo na že obstoječe začetne oligonukleotide, zato se proces podvojevanja začne z encimom primaza, ki sentitizira te primere.

Polimeraza DNA ima eksonukleazno aktivnost.

3’ - 5’ Encim ima zmožnost, da popravi napako, če je vgradil napačen nukleotid. Odstrani napačnega in vgradi pravega.

5’ - 3’ Encim odstrani RNA začetne oligonukleotide.

Question 13

Kaj je helikaza?

Answer 13

Je encim, ki je iz več podenot in je veliko večja od DNA. Omogoča razprtje dvojne vijačnice DNA.

Question 14

Kaj je primaza?

Answer 14

10-12 bp; pri RNA je na 2’ OH skupina pri sladkorju, pri DNA je na 2’ samo H. Naredi začetni oligonukleotid.

Question 15

N-baze v RNA.

Answer 15

Purina:
- Adenin in gvanin (komplementarne baze: T oz. U, C)

Pirimidina:
- Uracil in citozin (komplementarne baze: A in G)

Question 16

Polimeraze DNA.

Answer 16

Polimeraza DNA I: odstranitev in zamenjava začetih oligonukleotidov.

Polimeraza DNA II: popravljanje DNA; ponovno začne s podvojevanjem, ki se je ustavilo zaradi poškodb DNA.

Polimeraza DNA III: podaljševanje verige DNA.

Polimeraza DNA IV: popravljanje DNA.

Polimeraza DNA V: popravljanje DNA.

Question 17

Razlike med podvajanjem DNA pri prokariotih in evkariotih.

Answer 17

• Hitrost podvajanja:
  1000/s
  500-5000/minuto
• Število ori:
  1 mesto ori,
  več tisoč mest ori
• Dolžina replikon (del DNA, ki se podvoji iz enega mesta ori):
  celoten kromosom
  20.000 do 300.000 bp
• Dolžina okazakijevih fragmentov:
  1000 do 2000 nukleotidov
  100 do 200 nukleotidov

Question 18

Proof reading - editiranje DNA.

Answer 18

Odpravljanje napak nastalih v sintezi DNA.

Vgradnja napačnega nukleotida:

• tavtomerija: vez z O se spremeni iz dvojne v enojno, ali pa se dušik namesto z enojno veže z dvojno vezjo.
• nepravilna parjenja

Sprememba komformacije v DNAP.

3’ - 5’ eksonukleazna aktivnost.

Primaza nima 3’ - 5’ eksonukleazne aktivnosti - dela več napak.

Question 19

Od metila odvisno popravljanje neujemanja.

Answer 19

Dam-metilaza se nahaja na stari verigi DNA, tako, da se ve kaj je nova veriga in jo je traba popraviti ter kaj je stara originalna veriga. Poseben sistem to zazna, in “pogricka” okolico neujemanja ter nastane verzel. Polimeraza I doda nove nukleotide.

Question 20

Frekvence napak zaradi replikacije.

Answer 20

Polimeraza III naredi napako na 105 nukleotidov.

99 % popravi “proof reading”, še preden DNA-polimeraza nadaljuje s sintezo DNA.

Popravljanje neujemanja odstrani se 99,9 % napak.

Od 1 celice, se napaka pojavi pri 2000 potomk. (Če ni popravljanja: 1 od 20 ima napako, če ni sistema popravljanja neujemanja ima vsaka potomka 50 napak).

Question 21

Cikel celične delitve prokariontov.

Answer 21

Materinska celica -> replikacija DNA -> nastanek prstana iz FtsZ (energija iz GTP, nastane med obema nukleotidoma, usmerjena Min) -> nastanek divisoma (Fts-proteini, nastanek nove celične membrane in stene) -> podaljševanje celice (kromosoma potujeta vsak na svojo stran) -> depolimerizacija FtsZ (energija iz GTP, nastanek septuma) -> hčerinski celici

Question 22

Replikacija bakterijskega kromosoma.

Answer 22

Začetek: oriC (84,3 min), konec: ter.
E coli 4,6 Mbp, na enem delu ima začetek podvajanja oriC, točno nasproti je mesto zaključka, ki mu rečemo terminus (ter).

Dvojne replikacijske vilice.

Question 23

Iniciacija kromosomske replikacije, cis-delujoči elementi.

Answer 23

Cis-delujoči elementi oriC:

• OriC ima več odsekov
• 2 tipa elementov cis (delujejo tocno tam kjer so) in trans (sintetizirajo nekje drugje, potujejo po celici in delujejo nekje drugje),
• oriC je cis, 260 bp,
• en predel ima a t bogat odsek, ne potrebujemo veliko energije da se ločijo a in t,
• pred tem predelom je še tudi at bogat predel,
• za tem predelom je predel z vezalnimi mesti za encim dnaA (5 takih mest).

Zaporedje E. coli.

AT-bogat predel -> =DNA-unwinding element (DUE).

Tukaj se začne replikacija.

Question 24

Iniciacija kromosomske replikacije, trans-delujoči elementi.

Answer 24

• trans-delujoči elementi DnaA, DnaB, DnaC (omogoča vezavo dnaB), DnaG, RNAP, IHF, Fis (pomagata pri odvijanju).
• DnaA se rabi le za iniciacijo replikacije, omogoči DnaC, da namesti helikazo DnaB, da se lahko vzpostavijo replikacijske vilice

Question 25

Opiši iniciacijo kromosomske replikacije.

Answer 25

Da se lahko prične replikacija, se morajo ob tistih proteinih DnaA, ki so stalno vezani, na oriC še vezati molekule DnaA-ATP (okoli 12).

Sedaj lahko nastane velik multimeren kompleks iz mnogih molekul DnaA.

Zaradi tega zvitja DNA, se obe verigi sedaj lahko razpreta v območju DUE. Pri tem pomagata tudi Fis in IHF. V
pomoč je tudi superzavitje.

V procesu, kjer sodeluje tudi DnaC, se na razprto mesto v oriC veže helikaza DnaB. Delovanje DnaB dodatno razpre obe verigi, DnaC zapusti kompleks. Vezava SSB prepreči ponovno združevanje obeh verig.

Sedaj lahko primaza DnaG naredi RNA-začetni oligonukleotid in replikacija se lahko prične. Kompleks, sestavljata ga DnaB in DnaG, ki potuje po DNA in sintetizira RNA-začetne oligonukleotide, se imenuje primosom.

Question 26

Replikacija kromosoma.

Answer 26

Replikacija kromosoma E. coli poteka s hitrostjo 1000 nt/sec in traja 40 min.

Nastanejo strukture THETA (Podobna oblika grski crki teta).

Question 27

Terminacija kromosomaske replikacije.

Answer 27

Obstaja poseben sistem, ki nadzira regijo DNA, kjer se dogodi terminacija
replikacije – to je tam, kjer se replikacijski vilici srečata. Sistem najbolje poznamo pri E. coli.

Terminacija v E. coli se dogodi na 22 bp dolgih zaporedjih, imenovanih ter.
Preko teh mest lahko gredo replikacijske vilice samo v eni smeri.

Mesti terA in terB zakrožata terminacijsko območje. Mesto terA je prehodno samo v “smeri ure” in tako lahko gredo preko njega samo replikacijske vilice fR. Mesto terB je prehodno samo v “smeri proti uri” in tako lahko gredo preko samo replikacijske vilice fL.

Ko se obojne replikacijske vilice srečajo (terC) obojne prenehajo z replikacijo. (Če so katere vilice hitrejse
gredo čez terC in pridejo do drugega ter ampak ne gredo čez njega). Za terminacijo je potreben tudi protein. Pri E. coli je to protein Tus (terminus utilization substance), pri B. subtilis je
RTP (replication terminator protein). Terminacijski protein se veže na mesto ter in zaustavi helikazo (pri E. coli je to DnaB). Ko se replikacija zaključi, se sprostita dve hčerinski molekuli DNA.

Question 28

Težave replikacijskih vilic.

Answer 28

• na svoji poti lahko naletijo na poškodbe v verigi DNA (lezije in vrzeli)
• v takih primerih se vilice lahko zaustavijo in pogosto se razpustijo (“fall off”) (vilice pridejo do vrzeli in se ne morejo širiti naprej in se zaustavijo)
• če celica ne more zaključiti procesa replikacije, propade
• obstajajo posebni sistemi, ki zagotavljajo ponovno vzpostavitev replikacijskih vilic
• ker ta ponovna vzpostavitev replikacijskih vilic ni na oriC, sedaj sodelujejo drugi proteini, t. i. primosomski proteini PriA, PriB, PriC in tudi DnaT, ki uporabijo 3’-OH konec enoverižne DNA, ki tvori D-zanko, kot začetni oligonukleotid za ponovni pričetek sinteze DNA

Question 29

Segregacija kromosomov.

Answer 29

• Proces ločevanja obeh hčerinskih molekul kromosoma na obe hčerinski celici
• Pred tem morata biti obe hčerinski molekuli kromosoma ločeni
• Za to obstajajo različni sistemi:
  – resolucija dimerov (težave replikacijskih vilic se pogosto končajo z dimerizacijo – in sistem za resolucijo dimerov je verjetno nastal prav zato)
  (Dimer je ko sta oba se povezana, poseben sistem ve kje je treba prerezat da dobimo 2 ločena kromosoma.)
  – dekatenacija
  – kondenzacija

Question 30

Rekombinacijski sistem Xer E. coli.

Answer 30

• mestno-specifična rekombinaza
• delovanje usklajeno z delitvijo celice
• dva proteina: XerC in XerD; specifično mesto dif
• če se dogodi, da se na isti kromosomski molekuli nahajata dve mesti dif, proteina Xer izvedeta rekombinacijo med tema dvema mestoma dif
• mesto dif se nahaja centralno v regiji ter
• interakcija s proteinom FtsK zagotavlja časovno in prostorsko usklajeno povezavo z delitvijo celice (lokacija FstK v celici je, kjer delitveni septum preščipne celico)
• FtsK je DNA-translokaza, ki premika/črpa skozi sebe DNA v smeri pomikanja mest dif proti septumu

V kromosomu imamo posebna mesta, ki mu dajajo orientacijo, da se ve v kateri del celice gre kateri del. Povejo v katero celico bodo po delitvi sli. FtaK potiska kromosom v tisto smer kamor so orientirana zaporedja. Dif mesta. XerCD prostein zazna podvojeno mesto in na sredini prereže. Mesto dif ne sme bit podvojeno, potem to zazna siste XerCD.

Question 31

Binarna delitev.

Answer 31

Prokarionti vseskozi rastejo, ko je celica presegla kritično maso se avtomatsko začne tvorba septuma, ki omogoča ločeitev celic, ko iz 1 nastaneta 2 to je 1 generacija.

Celica se podaljša -> izoblikuje se septum -> celici se ločita.

Question 32

Citokineza.

Answer 32

• protein FtsZ (tvori osrednji obroč, ki omogoča nastanek delitvene ravnine, podoben je tubulinu evkariotov)
• podoben tubulinu evkariontov
• izoblikuje filamente, ki se lahko podaljšujejo/skrajšujejo zaradi dodatka/odvzema krajših filamentov, t. i. protofilamentov (je GTP)
• protein MreB (podoben aktinu, tvori filamente, ki potrebujejo ATP)
• podoben aktinu evkariontov
• tudi iz protofilamentov, a za izgradnjo se rabi ATP
• Fts izhaja iz “filamentous temperature sensitive” - najdemo v kloroplastih, mitohondrijih… Čaka, da tvori obroč, ko se kromosoma ločita se tvori obroč na sredini celice in tvorijo prstan FtsZ, ZipA in FtsA omogočata, da je obroč na sredini celice
• genetske analize v obdobju 1970-1979 so odkrile številne gene, ki so bili potrebni za delitev celice
• imeli so veliko število mutant, ki so bile temperaturno občutljive
• pri višjih, t. i. nepermisivnih temperaturah, niso mogle tvoriti kolonij, med tem ko so kolonije lahko tvorile pri nižjih, t. i. permisivnih temperaturah
• pri višjih temperaturah so iskali celice, ki so tvorile filamente iz nedeljenih celic, odkrite gene so poimenovali ftsA, ftsB… FtsZ je osrednji protein citokineze
• najdemo ga pri večini bakterij, pri nekaterih arhejah in celo v kloroplastih in mitohondrijih
• pred celično delitvijo je v obliki monomerov in krajših protofilamentov porazdeljen po celi celici
• ko celica doraste do ustrezne dolžine, se monomeri in protofilamenti zberejo na sredi celice, kjer tvorijo prstan (protoprstan) protoprstan ob FtsZ tvorita še dva pomožna proteina FtsA in ZipA, ki pomagata FtsZ-prstanu, da je stabilen in vezan na membrano.

Obroč v kontaktu z notranjo membrano, zipa v membrano, ftsa, ftsI, FtaK, vse skupaj je divisom.

Question 33

Sistem Fts.

Answer 33

• protoprstan obstaja 1/5 časa celičnega cikla, vanj se vežejo še drugi proteini (24 različnih)
• nekaterih od teh proteinov segajo preko membrane, drugi se sestavijo v periplazemskem prostoru in sodelujejo pri sintezi celične stene septuma.

Question 34

Delitev celice in citoskelet iz MreB.

Answer 34

MreB usmerja sintezo peptidoglikana, naredi svoje elemente v ovojčke po celici in omogoča da je celica potem palične oblike, če tega ni je kroglasta. Če se inhibira polimerazijo MreB filamentov, postanejo celice kroglaste.

Question 35

Zakaj nastane septum samo sredi celice?

Answer 35

Sistem Min in sistem nukleotidne okuluzije.

Question 36

Sistem Min E.coli.

Answer 36

• E. coli ima tri proteine: MinC, MinD, MinE, ki so vpleteni v izbiro mesta tvorbe septuma. Naredili so
  mutante, pri enih celicah so vedno nastale mini celice, ker je septum nastal bolj proti polu. Od teh celic so dobili to ime Min.
• gene min so našli, ker mutacije v teh genih vodijo do nastanka septuma na napačnih mestih in do posledične tvorbe minicelic (od tod tudi ime).

MinC in MinD tvorita kompleks, ki preprečuje vezavo FtsA in ZipA ter interakcije med filamenti FtsZ.

Proteini Min oscilirajo od enega pola celice do drugega. MinC in MinD in nekaj MinE se nahajajo proti polu in na polu ene celice, preostali MinE tvori obroč, ki omejuje gibanje MinC in MinD. Gibanje obroča iz MinE povzroči sproščanje kompleksa MinC-MinD iz membrane ene bodoče celice. Temu sledi izoblikovanje sistema na drugem polu druge bodoče celice.

MinC in D tvorita kompleks tam se ne more vezat ftsA in s tem tudi ftsZ ne.
C in D prehajajo čez pol in nekaj časa onemogočajo na enem polu potem gredo na drug pol.

FtsZ obroč nastane, kjer je koncentracija Min najmanjša.

Tik pred ločitvijo celic se MinC in MinD za kratek čas akumulirata tudi pri septumu.

Question 37

Časovna koordinacija replikacija in citokeneze.

Answer 37

E. coli ima samo ione in vir ogljika v minimalnem gojišču, tako da si more vse sama sintetizirat. Porabi veliko več časa, raste počasneje kot pa sinteza DNA.

Generacijski čas označimo z velikim I, ena generacija 70 min, tako da ima dovolj časa da se kromosom počasi podvaja, C za čas replikacije, D da se celica razdeli v 2 celici. (GRAF 2/22)

Bogato gojišče raste 17 min, mleko 12,5 min (nova replikacija se začne preden se prva konča, vsi ti proteini so v bližini oriC).

Question 38

Uskladitev začetka iniciacije replikacije s hitrostjo rasti celice.

Answer 38

• Iniciacija replikacije vezana na določeno celično maso – iniciacijska celična masa.
• Začetek iniciacije uravnavajo celična koncentracija DnaA (razmerje DnaA-ATP: DnaA-ADP), dostopnost oriC za DnaA.
• Več oriC v celici – več molekul DnaA se potrebuje.
• Na DNA so vezavana mesta za DnaA tudi izven oriC (jih je več kot 300) – redčenje DnaA – npr. regija datA, v bližini oriC veže kar več kot 50 molekul DnaA
• Poleg tega pa je pomembna tudi metilacija GATC zaporedij s strani deoksiadenozin metilaze (Dam)

Question 39

Kaj je gen?

Answer 39

Gen - odsek DNA, ki ima informacijo za neko biološko aktivno molekulo RNA (mRNA, tRNA, rRNA).

Gen se mora v pravem času izraziti.

Trnaskripcija (prepis te matrične DNA v Rna), translacija (prepis RNA v aminokislinsko zaporedje.

Pri evkariotih in prokariotih sta mehanizma zelo podobna. Pri evkariotih sta mehanizma ločena, pri prokariotih pa oba potekata v citoplazmi.

Pri prokariotih so geni organizirani v operone.
Zgradba: promotor, operator, strukturni gen.

Question 40

Promotor, operator in strukturni gen.

Answer 40

Promotor prepozna RNA polimerazo.

Operator: vežejo se elementi, ki določajo ali se bo polimeraza vezala ali ne.

Strukturni gen: policistronska DNA (več strukturnih genov), monocistronska DNA (en strukurni gen).

Question 41

Kaj potrebujemo za transkripcijo?

Answer 41

• encim: RNA-polimeraza (RNAP)
• DNA (kodirajoča veriga in matrična veriga - se bo prepisala, RNAP na matrično verigo dodaja nove nukleotide)
• promotor
• ribonukleotidi

Question 42

Opiši strukturo bakterijske RNAP.

Answer 42

1. Holoencimi:
   - beta, beta’, alfa, sigma
   - sigma je pomembna, da se usede promotor -> sigma se loči in se začne elongacija
   - ima funkcijo pri iniciaciji
2. Coreencimi
   - beta, beta’, alfa
   - sigma je v kontaktu s promotorskim zaporedjem
   - ima funkcijo pri elongaciji

Question 43

Sestavljanje RNAP.

Answer 43

Sigma prepozna promotor.

Prvi nukleotid, ki bo šel v RNA - mRNA start (+1).
Zaporedje -10: TATAAT (sigma prepozna zaporedje -> RNAP se more usest na pravo zaporedje)
Zaporedje -35: TTGACA

Question 44

Vezava RNA na promotor.

Answer 44

Različne sigme prepoznajo različne promotorje.

Alfa se veže na UP element, sigma 4 se veže na -35 zaporedje, sigma 3 na EXT, sigma 2 na -10 zaporedje, sigma 1 na DISC. Pri +1 je začetek.

Question 45

Različni sigma faktorji za različne promotorje pri npr. E. coli.

Answer 45

*-sigma 70 - primarna ; vzdrževalni (hišni) geni
*-sigma 32 - odgovor “heat-shock”
*-sigma 54 - asimilacija dušika
*-sigma F - izražanje flagela (“late flagellum expression“)
*-sigma S - izražanje v stacionarni fazi
*-sigma E/24 - odgovor na membranski stres

Question 46

Transkripcija.

Answer 46

RNAP je encim, ki je odgovoren za prepisovanje genov iz DNA v mRNA. Katalizira tvorbo fosfodiestrskih vezi med ribonukleotidi. Dodaja nukleotide na prosto 3’-OH skupino in podaljšuje verigo od 5’ -> 3’ koncu. RNAP ne potrebuje začetnega oligonukleotida in lahko začne iz nič. Sestavljena je iz večih enot (5). Ko se vse enote združijo dobimo aktivno RNAP.

Podrobna razlaga zapiski!!

Question 47

Rho neodvisna terminacija.

Answer 47

1. Ti terminatorji vsebujejo obrnjene ponovitve (sekvence nukleotidov na eni verigi so komplementarne in obrnjene). Ko se te ponovitve prepišejo v RNA nastane zanka.
2. 7-9 adeninov, ki sledijo drugi obrnjeni ponovitvi na template DNA. Njihova transkripcija povzroči serijo uracilov za zanko prepisani RNA. Serija uracilov v RNA povzroči, da se RNAP ustavi in s tem nastane čas za ustvarjanje zanke, ki destibilizira DNA - RNA parjenje, kar ima za posledico ločitev RNA od DNA. To ločitev pospešijo A - U bazni pari, ki so relativno šibki v primerjavi z drugimi baznimi pari.

Question 48

Rho odvisna terminacija.

Answer 48

1. DNA sekvence, ki ustavijo transkripcijo.
2. DNA sekvence, ki povzročijo napetost, ki prepreči nastanek sekvencirane strukture, na to nestrukturirano RNA se veže RHO protein in se pomika proti 3’ koncu. RHO ima helikazno aktivnost, zato prekine DNA - RNA vezi v transkripcijskem mehurčku, kar konča transkripcijo.

Question 49

Kaj potrebujemo za translacijo?

Answer 49

• mRNA, ki je nastala s transkripcijo
• tRNA
• ribosome (rRNA in ribosomske proteine):
  -Največje in najkompleksnejše
  strukture v bakterijski celici
  -So med glavnimi sestavinami celice
  -Velik del bakterijske biosinteze je za ribosome
  -Evolucijsko močno ohranjena struktura

Celica ima na tisoče ribosomov (število je odvisno od rastnih pogojev).

Question 50

Ribosom.

Answer 50

V bistvu je velikanski encim. Izvaja polimerizacijo AK v polipeptid.

A-mesto - mesto, kamor se
veže naslednja tRNA
(aminoacilno mesto)
P-mesto – mesto, kjer se
dogodi peptidna vez med
obema aminokislinama
E-mesto – mesto, od koder se
sprosti nenabita tRNA

Ribosomi evkariotov so večji.

Question 51

Vloga ribosomskih podenot.

Answer 51

VELIKA PODENOTA (bolj rigidna)
- z njeno vezavo nastane funkcionalen ribosom
- tvori peptidno vez
- prestavlja tRNA iz enega mesta na drugo

MALA PODENOTA (ima tri domene in je bolj gibljiva)
- iniciacija translacije
- pomaga pri izbiri pravilne ak-tRNA

Question 52

Nastanek rRNA.

Answer 52

Prekurzorska RNA (vsebuje vse 3 rRNA in eno ali več tRNA).

RNaze (ribonukleaze).

rRNA so med evolucijsko najbolj ohranjenimi celičnimi sestavinami.

Question 53

Vloga rRNA.

Answer 53

• vse rRNA imajo strukturno vlogo
  +
  -23S rRNA – peptidiltransferaza (ribocim) ter tvori kanal, skozi katerega izhaja rastoč peptid
  -16S rRNA – pomembna v iniciaciji in terminaciji translacije ter dekodiranju zaporedja mRNA (mora se vezat na začetek).

Question 54

Kristalni strukturi ribosomskih podenot.

Answer 54

Ribosomski proteini dajejo trdnost ribosomu in fiksirajo molekule rRNA na svojih mestih.

Question 55

Ribocimi.

Answer 55

Molekule RNA, ki imajo katalitsko aktivnost (RNA-encimi).

Evkarioti, prokarioti, organeli.

Delujejo same ali pa kot nukleoproteini (kompleks RNA in protein, “hibridi”).

Imajo aktivno mesto.

Večina je intronov, ki se sami izrežejo.
◦ endoribonukleazna aktivnost, nadalje nastanek krožne RNA z izrezom oligonukleotida
◦ katalizirajo samo enkrat (proteinski encimi več reakcij)

RNazaP
◦ ribocim, ki lahko katalizira večkrat (samo dva sta taka – ta in pa 23S rRNA)
◦ ribonukleoprotein – funkcija v zorenju tRNA iz prekurzorske RNA
◦ protein drži RNA v aktivni sekundarni strukturi

Ribocimi - arhaični ostanki “RNA sveta”.

Question 56

mRNA.

Answer 56

5’ UTR - 5’ neprevedena regija (ne bo šel v proteinski prepis).

Začetek genetske informacije (iniciacijski kodon, startni kodon). - gre v proteinski prepis.

Konec genetske informacije (zaključni kodon, STOP kodon).

3’ UTR - 3’ neprevedena regija.

Question 57

tRNA.

Answer 57

• enojna veriga, področja dvojne verige-sekundarna struktura
• antikodon se veže na mRNA, ostali deli na rRNA in ribosomski protein

5’ -> D-zanka ima dva dihidrouridina -> antikodonska zanka prepozna stop kodon -> TpsiC-zanka (T-zanka) vsebuje timin, pseudouracil in cianin -> akceptorski konec (CCA).

Zadnji akceptorski konec z estrsko vezjo vezan na AK.

Question 58

Prenašalna RNA (tRNA).

Answer 58

• najbolj procesirane in modificirane molekule RNA
• antikodonska zanka-veže se na kodon, prepozna (dekodira) kodon in ga prevede v aminokislino (Tretji nukleotid - ohlapen (“wooble”-
  neobičajno parjenje (npr. G:U))
• vsak kodon specifična tRNA,
  določene aminokisline več
  tRNA
• 60 specifičnih tRNA v
  bakterijski celici, 100-110 v
  celici sesalcev
• 73- 93 nukleotidov, nekateri
  posttranskripcijsko metilirani,
  nenavadne baze
  (psevdouridin, inozin,
  dihidrouridin, …)
• CCA se lahko doda tudi
  posttranskripcijsko – encim
  CCA-nukleotidiltransferaza

Question 59

Stopnje translacije.

Answer 59

• iniciacija
• elongacija
• terminacija

Question 60

Kateri proteini sodelujejo pri posamezni stopnji translacije E. coli?

Answer 60

Iniciacija:
- IF1 Stabilizira 30S-podenoto
- IF2 Veže fmet-tRNA na kompleks 30S-mRNA
- IF3 Veže 30S podenoto in mRNA

Elongacija:
- EF-Tu Dostavi aa-tRNA na A-mesto ribosoma
- EF-Ts Aktivira EF-Tu
- EF-G Stimulira translokacijo

Terminacija:
- RF1 Katalizira sprostitev polipeptidne verige in disociacijo pri UAA in UAG
- RF2 kot RF1, samo da za UGA in UAA
- RF3 Stimulira RF1 in RF2
- IF3 disociacija

Question 61

Peptidna vez.

Answer 61

CO skupina ene AK (C-terminalni del) in NH2 druge AK (N-terminalni del) se povežeta z peptidno vezjo.

Sinteza peptida poteka od N-terminalnega dela proti C-terminalem delu.

Peptidna veriga je iz med seboj povezanih AK.
oligopeptid – kratka veriga
polipeptid - dolga veriga
dipeptidi, tripeptidi…

Question 62

Kaj je bralni okvir?

Answer 62

Zapis za protein se lahko nahaja v bralnem okvirju.

Molekula DNA ima 6 možnih bralnih okvirjev.

Če se translacija dogaja v pravilnem okvirju, rečemo da je v “zero frame” za
protein. Če je vnapačnem, potem rečemo, da je v “−1 frame”, če je
pomaknjen bralni okvir za enega nazaj
oz. “+1 frame”, če je pomaknjen za enega naprej.

3/32

Question 63

Vezava AK na tRNA.

Answer 63

AK aktivacijski encimi (aminoacil-tRNA sintetaze) - povezujejo ustrezno AK in tRNA.

Prepoznavna mesta med AK in aminoacil-tRNA sintetazo, sintetaza mora prepoznati antikodon in
diskriminacijsko bazo tik pod CCA in velikost variabilne zanke.

Aktivacija AK:
◦ AK+ATP→aminoacil-AMP + tRNA + P-P

Nabitje tRNA:
◦ aminoacil-AMP + tRNA → aminoacil-tRNA + AMP

Question 64

Aminoacilacija tRNA.

Answer 64

Je aktivacija + nabitje.

AK + tRNA + ATP -> aminoacil-tRNA sintaza -> aminoacil-tRNA + AMP + PP

Zadnji aminokislina je vezana z estrsko vezjo na AK.

Question 65

Translacijsko-iniciacijska regija.

Answer 65

V verigi s tisoči nt mora ribosom začeti na pravem mestu. Določa ga translacijsko-iniciacijska regija (TIR) oz. ribosomsko vezavno mesto (RBS
– ribosome binding site - AGGAGG , RDS – ribosome docking site - AUG).

RDS (znotraj je start kodon - mesto P)
RBS (ribosomsko prepoznavno zaporedje)

3/35

Question 66

Iniciacijski kodon in iniciatorska tRNA.

Answer 66

Iniciacijski kodon, ki ga prepozna iniciatorska tRNA.

Iniciacijski kodon je lahko AUG, GUG, redkeje tudi UUG ali CUG.

Iniciatorska tRNA je ena sama.
Prepoznavo oz. vezavo iniciatorske tRNA na iniciacijski kodon omogoča IF-2, vezan z GTP.

Iniciatorska tRNA vstopi direktno na P-mesto (edina).

Metionin mora biti opremljen s fenilsko skupino -> transformilaza -> fMet-tRNA.

3/36

Question 67

Iniciacijska tRNA in začetek translacije.

Answer 67

Direktna vezava na mesto P je verjetno mogoče ravno zaradi fMet – taka tRNA je podobna že peptidil-tRNA, ki je značilna za mesto P. Formilna skupina tudi preprečuje, da bi tako nabita tRNA lahko bila uporabna kot elongatorska tRNA.

Question 68

Dogodki v iniciaciji translacije.

Answer 68

Potrebni so IF1, IF2, IF3, iniciatorska tRNA, mRNA, mala ribosomska podenota.

Nastane 30S iniciacijski kompleks, ki se nato poveže s 50S podenoto v 70S iniciacijski kompleks.

Na malo podenoto, na mesto A se veže IF1, ki stabilizira 30S podenoto.

Nam mRNA se veže mala ribosomska podenota.

Na iniciatrosko tRNA se veže fmet-tRNA, na katero je vezana IF2 faktor, ki povzroči vezavo fmet-tRNA na kompleks 30S-mRNA. IF3 pa veže 30S podenoto in mRNA.

IF2 omogoči vezavo s 50S podenoto in nastane 70S kompleks.

3/38

Question 69

Translacija - elongacija.

Answer 69

Vezava 5‘->3‘ kodona s 3‘->5‘ antikodonom – pravilnost vezave zagotavlja specifičen del zaporedja 16S rRNA (decoding site).
Akceptorski konec aatRNA je v povezavi s 23 S rRNA, ki nato deluje s svojo peptidiltrans-ferazno funkcijo. Po nastanku peptidne vezi v ribosom
vstopi EF-G z GTP (=translokaza) in prestavi iz A na P- oz. iz P na Emesto.

Premik ribosoma za 3 nt v smeri 5’ -> 3’.

Question 70

Tretje mesto v kodonu.

Answer 70

En antikodon se lahko poveže z več kodoni
◦ nespecifično parjenje na 3 mestu kodona
◦ Tretji nukleotid (“wooble”-neobičajno parjenje (npr. G:U)
◦ Nekatere tRNA berejo več kodonov
◦ Nekatere kodone lahko prebere več tRNA
◦ 49 tRNA prepozna 64 kodonov

3/40

Question 71

Translacija - terminacija.

Answer 71

RF se veže na STOP kodon.

RF1 prepozna UAA in UAG.
RF2 prepozna UAA in UGA.

Polipeptid se sprosti.

RF3 - pomaga sprostit RF1 oz. RF2.

Ribosom disocira. Za disociacijo se poleg EF-G potrebuje še ribosomsksprostitveni faktor (ribosome release factor, RRF).

Question 72

Odstranitev formilne skupine oz. fMet.

Answer 72

fMet je potrebno odstraniti.

Dve možnosti:
- samo f-Met se odstrani (peptid-deformilaza)
- odstrani tudi metionin (metionin aminopeptaza)

Question 73

Ribosomi in policistronska mRNA.

Answer 73

Ribosomi v citoplazmi na policistronski mRNA.

Da se vidi polipeptid, mora biti vsaj 70 AK dolg.

Question 74

Hitrost translacije in transkripcije.

Answer 74

Hitrosti morata biti usklajeni. Transkripcija: 40 - 80 nt/s
Translacija: 60 nt/s

Question 75

Nivoji regulacije ekspresije genov.

Answer 75

1. sprememba strukture genoma/kromatina;
2. transkripcija;
3. procesiranje/zorenje/dodelava mRNA (pri evkariontih se doda kapa na 5´konec, 3´konec se cepi in doda poliadeninski rep; introni se odstranijo); Vse te spremembe vplivajo na stabilnost mRNA, možnost translacije mRNA, hitrost translacije in na aminokislinsko sestavo nastalega proteina;
4. regulacija/uravnava stabilnosti RNA (uravnava hitrosti razgradnje nastale mRNA);
5. regulacija na nivoju translacije, ki je kompleksen proces in potrebuje poleg mRNA številne encime, druge proteine in različne molekule RNA.
   Razpoložljivost in količina vseh teh dejavnikov vpliva na hitrost translacije oziroma nastanka proteinov. Na samo translacijo lahko vplivajo tudi določena zaporedja v sami mRNA;
6. post-translacijske modifikacije so tiste, ki mnogim proteinom šele
   omogočijo aktivnost.

Question 76

Klasifikacija regulacije.

Answer 76

Regulacija iniciacije transkripcije:

• Negativna regulacija
  -Negativno-inducibilna regulacija
  -Negativno-represibilna regulacija
• Pozitivna regulacija
  -Pozitivno-inducibilna regulacija
  -Pozitivno-represibilna regulacija
• Regulacija z atenuacijo transkripcije
  -Modulacija strukture RNA
  -Spremembe v procesivnosti RNA-polimeraze

Regulacija z razgradnjo mRNA:
- Od proteinov odvisni učinki
- Od RNA odvisni učinki
Regulacija iniciacije translacije
Regulacija sprostitve z ribosoma
Regulacija terminacije translacije

Postraslacijske modifikacije proteinov
Regulacija obnavljanja proteinov (protein turn over)
Inhibicija proteinske aktivnosti s povratno zvezo (feedback inhibition)

Question 77

Skupine transkripcijskih faktorjev glede na strukturni motiv.

Answer 77

Transkripcijski faktorji so proteini, ki se vežejo na DNA in da prepoznajo DNA potrebujejo strukturne motive.

Regulatorni proteini vsebujejo domene oziroma strukturne
motive, ki se lahko vežejo na DNA in prepoznajo zaporedja nukleotido:
▫ Vijačnica-zavoj-vijačnica “Helix-turn-helix”
▫ Cinkovi prsti “Zink finger”
▫ “Levcinska zadrga” je lahko DNA vezavna domena in uravnava dimerizacijo proteina
▫ Beta-nagubana površina

Question 78

Transkripcijski faktorji skupine vijačnica-zavoj-vijačnica.

Answer 78

“helix-turn-helix”

Pogosto pri bakterijah.

Usede se na prepoznavno mesto.

Ko se vežejo proteini na DNA se vežejo kot dimeri.

Question 79

Transkripcijski faktorji skupine cinkovi prsti.

Answer 79

• “zinc-finger”
• pogosto pri evkariontih
• potrebuje cinkove ione
• veže se na specifično mesto

Question 80

Transkripcijski faktorji skupine levcinska zadrga.

Answer 80

• “Leucine zipper”
• dimerizacija
• pogosto pri evkariontih
• vsaka sedma AK je levcin na razdalji osmih helikalnih zavojev
• dimer se zato lahko poveže

Question 81

Kooperativna vezava transkripcijskih faktorjev.

Answer 81

Stabilizira kompleks DNA-protein.

Če imamo NFAT se bo sem šibko vezal, če pa imamo AP1, delujeta kooperativno.

Question 82

Opiši operone, ki se ne izražajo konstitutivno.

Answer 82

Inducibilni:
Transkripcije ni, določene spremembe inducirajo transkripcijo.
Sami po sebi so utišani, pozitivno regulirani, ob vezavi faktorja se začne transkripcija, če se faktor odstrani je gen spet na OFF.

Represibilni:
Transkripcija običajno poteka, ob določenih spremembah pa se ustavi.
Gen se izraža, če zaradi regulacije pride do represorja, se ustavi transkripcija.

Question 83

Pozitivna in negativna regulacija na nivoju transkripcije.

Answer 83

Če z določenimi načini/regulatornimi molekulami lahko stimuliramo ekspresijo genov govorimo o pozitivni kontroli (uravnavi), ki je bolj pogosta pri evkariontih (regulatorni protein
je aktivator, ki z vezavo na DNA spodbudi transkripcijo).

Če pa z regulatornimi molekulami inhibiramo izražanje genov
govorimo o negativni kontroli (uravnavi), ki je bolj pogosta pri
bakterijah (regulatorni protein je pri bakterijah represor, ki z vezavo na DNA inhibira transkripcijo).

Question 84

Transkripcijski regulatorni sistemi.

Answer 84

Negativno-inducibilna regulacija: represor, če pride induktor se gen izraža, ker bo represor inaktiviran.

Negativno-represibilna regulacija:
če pride korepresor bo represor inaktiviran.

Pozitivno inducibilna regulacija:
če pride induktor

Question 85

Transkripcijska aktivacija z aktivatorji.

Answer 85

Gen je izklopljen -> aktivator se veže na prosto regulatorsko regijo -> vezava RNAP -> prepisovanje operona.

Question 86

Transkripcijska inaktivacija z represorji.

Answer 86

Ni represorja -> RNAP se veže -> ko pride represor in prekrije del zaporedja in RNAP ne pride zraven, da bi se vezala -> je represor, ni izražanja genov.

Question 87

Genska regulacija z dvokomponentnim sistemom.

Answer 87

Signal -> senzorski protein zazna signal -> fosforilacija v citoplazemzski domeni -> fosfatna skupina iz senzorskega proteina se prenese na regulatorni protein v DNA-vezavni domeni -> genska regulacija.

Question 88

Mono-, policistronska mRNA in regulon.

Answer 88

Monocistronska mRNA - en gen:
Sestavljena je iz enega cistrona, zato proizvede en sam protein.

Policistronska mRNA - operon:
Sestavljena je iz dveh ali več cistronov.

Regulon:
Skupina genov, ki so skupaj regulirani, ponavadi z istim regulatornim genom.

Question 89

Laktozni operon.

Answer 89

lacI: gen za uravnavanje, v njem se kodira laktoza represor.

lacZ: beta-galaktozidaza

lacY: Lac-permeaza

lacA: tiogalaktozid transacetilaza

Operon lac je primer, ko se zaporedje oparatorja prekriva s 3’ koncem promotorja in 5’ koncem prvega strukturnega gena.

Lac-permeaza -> beta-galaktozidaza -> glukoza in galaktoza

4/25

Question 90

Razgradnja laktoze.

Answer 90

Laktoza se preoblikuje v alolaktozo (to lahko lacZ razgradi) -> beta-galaktozidaza -> galaktoza in glukoza.

Da lahko lacZ deluje potrebuje tetramer, potrebuje 4 monomere povezane med sabo.

Alolaktoza (induktor) se veže na vezavno mesto za induktor.

Question 91

Alosterična interakcija.

Answer 91

LacI z vezanim induktorjem (IPTG) ima
zaradi vezave induktorja konformacijsko spremembo → alosterična interakcija

Question 92

Fosfotransferazni sistem (PTS).

Answer 92

cAMP nastaja tako, da celica prepozna, če ima glukozo ali ne.

Če ima glukozo, ne razgrajuje laktoze. Če je laktoza, to javlja celica z cAMP.

Ko glukoza prihaja v celico prehaja čez transportni kompleks, se zgodi fosforilacija, vezava s 6-fosfatom. S tem se glukoza ujame v celico. Ta fosfat pa more od nekod prit - pride iz energetsko bogate fosfoenolpiruvata (PEP). Fosfor gre na EI, potem na HPr in potem na EIIA in šele potem do glukoze. Ker se fosfat ves čas porablja, ne pride do aktivacije adenilat ciklaze.

Ko ni glukoze v celici se fosfat iz EIIA porablja za aktivacijo AC in pri tem je v celici veliko cAMP.
Če ni glukoze v celici, fosfat obtiči na EIIA in vodi aktivacijo adenilat ciklazo -> cAMP -> vezava na CRP -> vezava na DNA -> aktivacija operonov za razgradnjo drugih virov ogljika, ki niso glukoza.

EIIB in EIIC v membrani (adenilat ciklaza).

Celica more prepoznati ali ima glukozo ali laktozo. Če je glukoza to sporoči s cAMP.

Ko glukoza pride v celico, gre čez kompleks -> fosforilacija, ko gre skozi kompleks ob transportu čez EIIBC doda fosfat -> pride iz fosfoenol piruvata in se prenese na transportni protein EI -> HPr -> EIIA -> glukoza-6-fosfat.

Če je glukoza ni cAMP, cAMP se ne poveže s CRP, ni transkripcije lac genov.

Question 93

Lac-operon in njegova uravnava.

Answer 93

Če ni glukoze, ni alolaktoze. Represor lacI je aktiven in se veže na operator. Prekriva promotor in gen je utišan.

Če je laktoza, nastane alolaktoza. Represor dobi gor induktor (alolaktoza) in postane neaktiven. Tudi vezan se sprosti in RNAP se vsede na promotor in naredi transkript vseh teh genov lacZYA.

Če zmanjka glukoze, potem dobi CRP še cAMP, se ga aktivira, se veže na CRP vezavno mesto in se RNAP prikliče in dobimo veliko količino produktov.

Question 94

LacI.

Answer 94

Ima 3 vezavna mesta.
Vezavno mesto o1, ki je najbližje promotorju lac ima najpomembnejšo vlogo v represiji operona lac, ker se prekriva s promotorjem tega operona.

Delecija bodisi sigma 2 ali bodisi sigma 3 ima le majhen učinek na uravnavanje, medtem ko hkratna delecija obeh vodi v 50× zmanjšano represijo.

Hkratna vezava LacI na s igma1 in sigma 2, oz. sigma 1 in sigma 3, vodi
v upogib DNA. Regija, bogata z AT, olajša upogib.

Question 95

Pozitivna kontrola.

Answer 95

Regulatorni protein je aktivator, ki se poveže z DNA, vendar običajno ne
z operatorskim zaporedjem, in spodbudi transkripcijo.

Pozitivna kontrola je lahko inducibilna ali represibilna.

Question 96

Regulacija laktoznega operona.

Answer 96

4/48!!!

Question 97

Uporabnost operona lac.

Answer 97

V molekularni genetiki je zelo velika:

• uporaben za mnogo organizmov: bakterije, vinske mušice, človeške celice
• uporabljajo tako lacZ, kot promotor lac
• gen lacZ je med najpogosteje uporabljenimi reporterskimi geni
• začetni N-terminalni del LacZ ni bistven za delovanje (vstavitev poliklonskih mest)
• promotor lac in njegovi derivati so pogosto uporabljeni v ekspresijskih sistemih (zelo močni promotorji, ki so lahko uravnani)

Question 98

lac in lacl promotor ter derivati.

Answer 98

• Plac
• PlacUV5: ni občutljiv za katabolno represijo, aktiven je tudi če je glc v gojišču (deluje v LB).
• Ptac: je močnejši, ni občutljiv za katabolno represijo, a je inducibilen z IPTG.
• Placl
• Placlq: 10x večje izražanje Lacl - bolj reprimarno izražanje iz Plac.

Question 99

Lacl in njegova uporabnost.

Answer 99

• Lociranje regij DNA tekom rasti celice, kromosomske lokalizacije (prokarionti in tudi evkarionti)
• Genska fuzija lacI in gfp + lac o1 v tarčnem zaporedju
• Gen za zeleni flourescenčni gen povežemo z genom lacI, in nastane represor, ki se sveti ter vidimo kam se ta na DNA veže.

Question 100

L-arabinozni operon.

Answer 100

Trije operoni: 1-podobno kot lac operon (gen za tri encime) (araC je aktivator - ko se veže, se sinteza
začne, če pa nima vezanega Iara pa je represor) 2 in 3 – ne bomo pogledali.

Question 101

Razgradnja arabinoze.

Answer 101

Gre za obliko L-arabinoze, ki preko proteinov vstopa v celico, pretvori se v L-ribulozo, araB doda fosfat in dobimo
L-ribuloza-fosfat, araD pa zamenja stran OH skupine in nastane D-ksiluloza-fosfat. To se potem porabi v centralnem metabolizmu.

Question 102

Regulacija L-arabinoznega operona.

Answer 102

Regulatorna domena, linker, encimska domena in regulatorna ročica (prekriva aktivno mesto) - encim je neaktiven.
Na regulatorno domeno se veže ligand in se ta ročica odmakne iz aktivnega mesta in tako encim postane aktiven.

Če na dimer ni vezane arabinoze, je palične oblike, DNA je v zavoju (promotor je v zanki in je utišan).
Če pride arabinoza se veže na vezavno mesto in pride do tvorbe dimera v kvadratasti obliki, ta oblika se
veže na I1 in I2 pozicijo in z vezavo omogoča vezavo RNA-polimerazo. DNA se tudi zasuka. Če je pomanjkanje glukoze, se geni še bolj izrazijo (CAP).

4/70-73

Question 103

Genski rekombinacijski inženiring.

Answer 103

4/74,75

Question 104

Mehanizem landa red.

Answer 104

Homologni in heterologni del. Exo del se veže na konec homolognega dela. Potem se veže še beta -> SS-intermediat. -> Vstavitev namesto Okazakijevega fragmenta.

Question 105

Negativna represibilna uravnava/regulacija.

Answer 105

Imamo represor, ki se sintetizira v neaktivni obliki in šele potem ko se na njega veže nek korepresor
postane aktivne oblike, ki se veže za DNA in operon utiša.

4/77

Question 106

Triptofanski operon.

Answer 106

4/79

Question 107

Biosinteza triptofana.

Answer 107

4/79

Question 108

Regulacija triptofanskega operona I.

Answer 108

Z represorjem (TrpR) in korepresorjem (Trp) na nivoju promotorsko-operatorske regije.

Represor TrpR se lahko veže na DNA,
samo če je nanj vezan korepresor Trp.

Represor se sintetizira v neaktivni obliki in ne more utišati gena. Ko je triptofan se na koncu veže na represor in potem je ta aktiven; veže se na operatorsko zaporedje in operon je utišan in triptofan ne nastaja.

4/80-83

Question 109

Regulacija triptofanskega operona II.

Answer 109

Z atenuacijo (zaustavitev transkripcije) na nivoju poteka transkripcije. Vezava tRNA-Trp je odločilnega pomena za tvorbo atenuacijskih lasničnih zank.

AUG je startni kodon. UGGUGG-kod za triptofan; potem sledijo komplementarna zaporedja, ki se lahko med sabo povežejo in tvorijo stebričke, na koncu je UUUU.
4/85

Če sta 1 in 2 povezani, se povežeta tudi 3 in 4. Ti stolpički zaustavijo transkripcijo. Lahko pa pride do tvorbe zanke med 2 in 3 potem se
transkripcija nadaljuje. Na to vezavo vpliva ali so tRNA-trp na voljo ali ne. Če ribosom čaka na tRNA se tvori zanka 2-3 ta prepričuje vezavo med 3-4 in se transkripcija nadaljuje.
Tak način je možen, ker transkripciji pri bakterijah takoj sledi translacija.
4/86

Ribosom se premakne naprej v regijo 1-2 in tako ne more nastati lasnična zanka 2-3 -> transkripcija se zaustavi.

Ribosom se zaustavi na triprofanskih kodonih in tako lahko nastane lasnična zanka 2-3 -> transkripcija se nadaljuje.
4/87

Question 110

Atenuacija.

Answer 110

Atenuacija je primer, ko je izražanje uravnano z dvema različnima signaloma:
* koncentracijo triptofana v celici in
* številom molekul tRNA s pripetim triptofanom

Tak način je možen, ker transkripciji pri bakterijah takoj sledi translacija.
4/88

Question 111

Koncentracija triptofana v celici.

Answer 111

Triptofana je malo:

• Polimeraza DNA začne prepisovanje DNA, prepiše se regija 1 zaporedja 5´UTR.
• Ribosom se pripne na 5´konec zaporedja 5´UTR. Medtem, ko se prepisuje regija 2 se na ribosomu
  prevede regija 1.
• Ker je triptofana malo se ribosom ustavi na Trp kodonih v regiji 1. Ker se je ribosom ustavil,
  ne prekriva regije 2, medtem ko se prepisuje regija 3.
• Ko se prepiše regija 3, se mRNA regije 3 poveže z mRNA regije 2. Ko se nato prepiše regija 4 se ne more povezati z regijo 3, ker se je le-ta že povezala z regijo 2. Tako ne nastane atenuator
  in transkripcija se nadaljuje.

Triptofana je dovolj:

• Polimeraza RNA začne prepis regije 1 zaporedja 5´UTR
• Ribosom se pripne na 5´konec zaporedja 5´UTR. Medtem, ko se prepisuje regija 2 se na ribosomu
  prevaja regija 1.
• Polimeraza RNA prepiše regijo 3.
  Ker je triptofana dovolj (tRNA), se
  ribosom ne ustavlja na Trp kodonih.
• Ker ribosom prekriva del regije 2 (se za nekaj časa ustavi, zaradi STOP-kodona), se slednja ne more povezati z regijo 3. Prepiše se regija 4, ki se poveže z regijo 3 in tvori atenuator, ki ustavi transkripcijo.

Question 112

Operon fab.

Answer 112

Biosintezna pot (A) in operon za sintezo maščobnih kislin (B).
4/92

S črnim so označeni promotorji, ki jih aktivira transkripcijskih aktivator FadR. S sivo alternativni promotorji. FadR za vezavo, delovanje ne potrebuje dodatnega induktorja. Končni produkt
biosintezne poti (acil-CoA) pa se veže na FadR in mu prepreči vezavo na DNA in s tem sintezo encimov za biosintezo MK.

Question 113

Protismerna RNA.

Answer 113

Molekule RNA lahko uravnavajo izražanje nekaterih bakterijskih genov; Protismerna (antisense) RNA lahko uravnava translacijo mRNA.

Ko je zunaj celice osmolarnost nizka,
se ompF mRNA prepiše in nastane protein OmpF.

Ko je zunaj celice osmolarnost visoka,
se aktivira gen micF in prepiše v micF RNA. micF RNA se poveže s 5´koncem ompF RNA in s tem blokira mesto za vezavo ribosoma. Protein OmpF ne nastaja, ker je preprečena translacija.

OmpF – protein zunanje membrane, ki deluje kot kanal za pasivno difuzijo majhnih polarnih molekul.

4/93

Question 114

RNA-stikala (riboswitches).

Answer 114

So zaporedja (RNA) v mRNA (regulatorni elememti), ki vplivajo na izražanje genov.

Nekatere molekule mRNA imajo regulatorna zaporedja, ki jih imenujemo RNA-stikala, kamor se lahko vežejo različne molekule in s tem vplivajo na tvorbo sekundarnih struktur in posledično na izražanje genov.

Ko se regulatoren protein veže
na RNA stikalo, stabilizira sekundarno
strukturo, ki zakrije mesto vezave na
ribosom (rbs). Ni translacije mRNA.
Če regulatornega proteina ni, zavzame RNA stikalo takšno sekundarno strukturo, ki omogoči dostop do rbs mesta na mRNA. Translacija steče.

Aktivirana oblika vitamina B12 (koencim B12) se veže na RNA-stikalo. Posledično tvori mRNA sekundarno strukturo, ki prekrije rbs in ni translacije. Če ni koencima B12 tvori mRNA drugačno strukturo, ki ne prekrije rbs in translacija steče. Regulatorna molekula lahko v nekaterih primerih deluje tudi kot aktivator.

Question 115

Odziv na omejitev hranil.

Answer 115

Zaznava ogljika:
- odgovor na zaznavo ogljika je katabolna regulacija (bakterija se prilagodi, če je glukoza ali če je ni) -> CRP je regulatorni protein, ki javlja količino glukoze.
- mehanizem je DNA-vezavni aktivator/represor
- vpliva na lac , ara, gal, mal…
- odgovor na zaznavo ogljika je lahko tudi regulacija tipa metabolizma (fermentacija oz. oksidacija) - anaerobno ali aerobno okolje -> Cra je regulatorni protein
- mehanizem je DNA-vezavni aktivator/represor (odvisno kam se veže)
- vpliva na encime glikolize (fermentacija) in Krebsovega cikla (celično dihanje)

Zaznava dušika:
- dušik je nujen za tvorbo nukleotidov in AK
- spojina, ki jo zazna, da ve daje premalo dušika je amonijak (NH3)
- regulatorni protein je Sigma N, ki sintetizira faktor sigma (ta zazna promotorje, ki so prisotni ob pomanjkanju dušika)
- vpliva na glnA in operoni za razgradnjo AK
- regulatorni protein je lahko tudi ntrB in ntrC - regulator (veže se na DNA in omogoči izražanje genov)
- mehanizem je dvokomponentni sistem, ki ima dva ločena proteina (senzor - veže signal in regulator - nekaj naredi)

Zaznava fosforja:
- potreben je za nukleotide
- odgovor na zaznavo fosforja je pomanjkanje anorganskega ortofosfata (Pi)
- če ni anorganskega ortofosfata, se bo dvokomponentni sistem aktiviral, kar povzroči odziv v več kot 38 genov

6/2

Question 116

Odziv na omejeno rast.

Answer 116

Odziv na neugodne razmere (“stringent response”):
- odgovor na neugodne tazmere je odziv na pomanjkanje aa-tRNA (nabita tRNA) za proteinsko sintezo
- relA in spoT: javljajo, da je celica v neugodnem razmerju
- metabolizem (p)ppGpp - uravnava celico (rRNA, tRNA, ribosomski proteini, operoni za biosintezo AK

Odziv na stacionarno fazo:
- odgovor je preklop metabolizma na gene stacionarne faze
- regulatorni protein je sigma S
- geni se, zaradi sigma promotorja, vklopijo

Odziv na kisik:
- če je bakterija v anaerobnem okolju, se odzove fnr
- mehanizem je DNA-vezavni protein aktivator oz. represor
- vpliva na več kot 32 genov
- če je bakterija v aerobnem okolju se odzove arcAB (dvokomponentni sistem: arcA, arcB
- odzove se več kot 20 genov

Question 117

Odziv na stres.

Answer 117

Osmoregulacija:
- odgovor na hiter dvig osmotskega pritiska
- regulatorni proteini kpdD in kpdE, ki sta del dvokomponentnega sistema
- vpliva na kpdFABC
- odgovor na prilagoditev na osmotsko okolje (potrebno ko menja okolje, narava - gostitelj)
- regulatorni proteini envZ in ompR, ki so del dvokomponentnega sistema
- vpliva na ompC in ompF
- regulatorni protein micF, tu je mehanizem sRNA
- vpliva na ompF

Kisikov stres:
- zaščita pred kisikovimi radikali, ki lahko poškodujejo DNA
- regulatorni geni so socS
- mehanizem AraC-družina regulatorjev
- vpliva na sox, vključno s sodA in micF
- regulator oxyR
- mehanizem je Lys-družina DNA-vezavnih proteinov
- vpliva na regulon oxyR, vključno z katG

Toplotni šok:
- odgovor na hiter dvig temperature
- regulatorni protein rpoH se veže na RNAP, prebira gene, ki jih rabi, da se odzove na toplotni šok
- mehanizem je faktor sigma
- vpliva na stimulon Hsps, vključno z dnaK, dnaI, grpE, Ion, cplPX, hflB

Stres ovojnice (hitro doleti, ker je ena celica):
- odgovor na napačno zvite proteine Omp
- regulatorni protein je rpoE (sigma E - izrazi so napačno zviti proteini omp)
- mehanizem je faktor sigma
- vpliva na več kot 10 genov, med njimi rpoH in degP
- napačno zvit pil
- regulatorni proteini so cpxA in cpxR, ki so del dvokomponentnega sistema
- prekriva z regulonom RpoE

Šok pH:
- toleranca za kislo okolje
- mnogo regulatornih proteinov
- mnogo mehanizmov
- kompleksen vpliv

Question 118

Katabolna regulacija.

Answer 118

• različni viri ogljika omogočajo različno hitro rast – temu se mora prilagoditi sinteza celičnih makromolekul
• efekt glukoze (glukoza je najbolj zaželjen vir ogljika), izključitev induktorja
• od cAMP-odvisna in od cAMP-neodvisna uravnava

Protein Cra signalizira interno količino sladkornih metabolitov.

Skica 6/5

Question 119

Regulacija s CAP-cAMP.

Answer 119

• Vpliv na klasične katabolne operone
  ▫ lac, gal, ara, in mal
• Glede na način vezave CAP,
  razlikujemo dva tipa promotorjev:
  ▫ I (lac) – CAP veže alfa-CTD del RNAP – poveča vezavo RNAP na promotor
  ▫ II (gal – pG1) – CAP veže tako alfa-CTD, kot alfa-NTD – pospeši nastanek odprtega kompleksa promotorja
• Obstajajo tudi promotorji, kjer se
  veže več kot en dimer CAP in tako
  vpliva tako na vezavo RNAP kot
  nastanek odprtega kompleksa.
• CAP lahko deluje tudi tako, da upogne DNA, kar vpliva na dostopnost DNA za druge regulatorne proteine in RNAP.

Skica 6/6

Question 120

Bakterijski dvohibridni sistem z adenilat ciklazo.

Answer 120

• Dvohibridni sistemi so eksperimentalni sistemi za iskanje proteinov, ki interagirajo.
• Temeljijo na fragmentih dveh proteinov, ki kadar sta v kompleksu, povzročita neko spremembo, ki jo zlahka zasledimo.
• Gene teh dveh fragmentov kloniramo skupaj z geni proteinov, za katere želimo preveriti, če interagirajo.

7/6

Question 121

Katabolna regulacija s Cra.

Answer 121

• Cra protein (ime iz ang. catabolite
  repressor/activator), izvorno
  poimenovam FruR, (ang. fructose
  repressor).
• Zapisan v genu cra, je DNA-vezavni
  protein, podoben LacI ali GalR.
• Cra zavira operone, katerih produkti sodelujejo v centralnih biokemijskih poteh sladkornega katabolizma kot sta Embden-Meyerhof in EntnerDoudoroff pot, če je glukoza ali podobno dober sladkor prisoten
• Cra aktivira operone, katerih produkti sodelujejo v sintezi glukoze iz piruvata in drugih metabolitov.

6/8

Question 122

Katabolna regulacija v B. subtilis.

Answer 122

• Sploh nima cAMP
• Katabolna represija je dejansko
  represija
• Represor je protein CcpA (ang.
  catabolite control protein A):
  ▫ je DNA-vezavni protein z motivom HTH iz družine regulatorjev LacI/GalR
  ▫ veže se na mesta cre (ang. catabolite
  repressor)
  ▫ inaktivira gene, katerih izražanje mora biti zaradi prisotnosti glukoze zavrto
  ▫ aktivira gene, ki se zaradi prisotnosti
  glukoze morajo izražati
  ▫ pod njegovo uravnavo je približno 100
  genov
  ▫ njegovo delovanje odvisno od pozicije
  mesta cre
• aktivnost CcpA je uravnanva preko
  proteina Hpr
• rast na gojiščih z visoko koncentracijo
  glukoze vodi v nastanek fruktoze- 1,6-
  bisfosfata (FBP)
• visoke količini FBP vodijo v
  fosforilacijo specifičnega serinskega
  ostanka v Hpr (Hpr- S∼P)zaradi vpliva
  FBP na Hpr-kinazo
• Hpr- S∼P se veže na CcpA in tak
  kompleks se potem veže na cre
• Ko je koncentracija glukoze in torej
  tudi FBP nizka, Hpr-kinaza
  defosforilira
• Protein Crh lahko nadomesti protein
  Hpr, a Crh ni del PTS.

6/9,10

Question 123

Regulacija asimilacije dušika - geni.

Answer 123

Gen:
- glnA -> glutamin-sintetaza (encim, ki sintetizira glutamin) -> sinteza glutamina
- glnB -> protein PII (vpliva kaj se bo zgodilo z dvokomponentnim sistemom) -> inhibira fosfatazo NtrB, aktivira adenililtransferazo
- glnD -> uridil-transferaza -> transfer UMP na in z PII (aktivnost je odvisna, če ma UMP ali ne)
- glnF -> sigma N -> RNAP prepozna promotorje operonov Ntr
- ntrC in ntrB imata dvokomponentni sistem -> aktivacija promotorjev operonov Ntr (ntrC) in transfer fosfata na in z NtrC (ntrB)
- glnK -> glnK -> Regulacija adenililtransferazne aktivnosti

6/11

Question 124

Regulacija asimilacije dušika.

Answer 124

• Dušik je pomemben element, saj ga najdemo v nukleotidih,
  aminokislinah, vitaminih
• Je nujen element za rast
• Za bakterije je vir dušika bodisi amonijak (NH3) - preferirano, nitrat (NO3-) - če ni amonijaka ali N-vsebujoče organske spojine ali pa N2 iz atmosfere - če ni amonijaka, je energetsko bolj potratno
• Ne glede na vir N, vse biosintetske reakcije, ki rabijo N, ga rabijo v obliki NH3 ali NH2 iz glutamata oz. glutamina.
• Ker je NH3 neposredno ali posredno tista spojina, ki daje N za
  biokemijske reakcije, se večina ostalih oblik N reducirana do NH3, ki se ga nato uporabi - asimilatorna redukcija N-vsebujočih spojin.
• Obstaja tudi disimilatorna redukcija, v tej se uporablja NO3- za akceptor elektronov v anaerobni respiraciji – N se izloča kot N2 v atmosfero.
• Enterobakterije uporabljajo
  različne poti asimilacije N, odvisno od koncentracije NH3.
• Ko uporabljajo kot vir N aminokisline, je koncentracija
  NH3 nizka.
• Ko je v gojišču anorganski vir
  N, npr. NH4OH, je koncentracija NH3 visoka.
• Kemijske reakcije, ki potekajo
  v enem oz. drugem primeru
  se razlikujejo.

6/13,14

Question 125

Sistem Ntr.

Answer 125

• Operoni za uporabo N so del
  sistema Ntr (ang. nitrogen
  regulated)
• Regualcija sistema Ntr zagotavlja,
  da bakterije ne sintetizira encimov
  za uporabo N iz aminokislin ali
  nitrata, če je na razpolago NH3.
• Del regulona so tudi transportni
  sistemi za alternativne vire N.
• Signalno transdukcijsko pot
  tvorijo: NtrB, NtrC, GlnD in PII
• Količina N na voljo se zaznava
  preko količina glutamina v celici
• NtrB in NtrC sta dvokomponentni
  sistem

6/15

Question 126

Dvokomponentni sistem.

Answer 126

Integralni membranski protein, odziven na zunanje signale.

Bakterije z velikimi genomi imajo več 100 različnih dvokomponentnih sistemov.
Včasih ima en protein obe domeni.
Dvokomponentnih sistemov ni pri živalih.

6/16

Question 127

Transkripcijski faktor NtrC.

Answer 127

Ima:
▫ DNA-vezavno domeno
▫ Regulatorno domeno (Asp, ki se fosforilira)
▫ Domeno za transkripcijsko aktivacijo z ATP-vezavnim
mestom

Mehanizem aktivacije z NtrC ∼P:
▫ Veže se na mesto UAS, ki je več
kot 100 bp oddaljeno
▫ Da lahko deluje na RNAP, mora
priti do upogiba v DNA (pomen
IHF)
▫ Za nastanek odprtega kompleksa mora priti do razgradnje ATP

6/17

Question 128

Transkripcija operona glnA-ntrB-ntrC.

Answer 128

Trije promotorji:
▫ P2 – odziven na NtrC∼P
▫ transkripcijo s P2 dela RNAP s posebno sigmo, sigmo N
▫ P1 in P3 – transkripcijo z njiju
dela sigma70, transkripcijska
iniciacija s P1 in P3 je pod represijo NtrC∼P

Question 129

Promotor sigma N.

Answer 129

Sigma 70 promotor: večina hišnih genov.

Sigma N promotor: regulon Ntr in tudi
nekateri drugi geni (npr. geni za flagele pri Caulobacter spp.

6/19

Question 130

Faktor sigma N - gen rpoN.

Answer 130

• Ima:
  ▫ aktivacijsko domeno - domena za
  vezavo aktivatorja
  ▫ domeno za vezavo na sredico RNAP
  ▫ domeno za vezavo na DNA z
  motivom HTH
• Aktivacija poteka z vezavo
  aktivatorskega proteina več kot 100
  bp oddaljeno
• RNAP z vezanim sigmaN za nastanek
  odpretega kompleksa nujno
  potrebuje ATP – sprememba v
  konformaciji RNAP, ki omogoči
  odprtje DNA
• sigmoN najdemo tako pri po Gramu
  pozitivnih in tudi po Gramu
  negativnih bakterijah, a ni
  univerzalna

6/20

Question 131

Faktorji sigma.

Answer 131

• So značilni za bakterije in njihove fage - ne najdemo pri evkariontih
• Določajo tip promotorja, na katerega se veže RNAP
• Pomagajo RNAP, da tvori odprti kompleks na promotorju in tako
  prične s transkripcijo
• Imajo lahko vezavna mesta za povezavo z aktivacijskimi proteini
• Nedoslednosti pri poimenovanju (sigmaE pri E. coli je sigma za
  ekstracitoplazemski stres, sigmaE pri B. subtilis je za sporulacijo)
• Število faktorjev sigma v genomu nakazuje na kompleksnost
  okolja, v katerem neka bakterija živi:
  ▫ H. pylori – 3 faktorji sigma; živi v želodcu i nje prilagojen na konstantno okolje -> 3 sigma faktorji
  ▫ Streptomyces coelicolor – 63 faktorjev sigma; v zemlji (suša, vročina…) -> 63 faktorjev
• Dve skupini faktorjev sigma:
  ▫ skupina fatorja sigma70 (ima več predstavnikov)
  ▫ skupina faktorja sigmaN (samo ta) - potreba po dodatnem ATP.

Question 132

Adenililacija glutamin sintetaze (GS).

Answer 132

• Regulacija transkripcije gena glnA ni edini način regulacije aktivnosti GS
• Aktivnost tega encima je modulirana tudi z adenililacijo – encimom
  adenililtransferaza (vezava AMP na specifičen tirozinski ostanek na encimu)
• Adenililacija se dogodi ob visokih koncentracijah NH3
• Adenililirana oblika GS je manj aktivna in bolj dovzetna za inhibicijo s
  povratno zvezo z glutaminom:
  ▫ Visoka koncentracija NH3 – primarna vloga GS je tvorba glutamina za sintezo
  proteinov, če je glutamina dovolj, mora glutamin inhibirati GS, da ne nastane
  preveč glutamina
  ▫ Nizka koncentracija NH3 – več GS in bolj aktivno GS se rabi
• Na adenililacijo vplivata tudi GlnD in PII:
  ▫ Nizka koncentracija NH3 – PII ima vezan UMP → adenililtransferaza odstrani
  AMP z GS
  ▫ Visoka koncentracija NH3 – PII nima UMP → PII se veže na
  adenililtransferazo in jo stimulira, da dodaje AMP na GS
• Na adenililacijo vpliva tudi GlnK:
  ▫ visoka koncentracija NH3 – GlnK ima vezan UMP → stimulira
  adenililtransferazo, da doda AMP na GS

6/22,23

Question 133

Regulacija asimilacije dušika B. subtilis.

Answer 133

• Regulacija asimilacije dušika pri E. coli in drugih enterobakterijah temelji bistveno na
  posttranslacijskih modifikacijah (fosforilacija NtrC, uridilacija PII, adenililacija GS - glutamin sintetaza) in faktorju sigmi (sigma N)
• Regulacija asimilacije dušika pri B. subtilis pa temelji na interakcijah protein-protein (regulatorni protein TnrA).

Question 134

B. subtilis - regulacija s TnrA.

Answer 134

Ko je koncentracija glutamina visoka:
▫ TnrA deluje kot transkripcijski represor gena GS
▫ TnrA tvori tudi kompleks z GS in glutaminom → nižja aktivnost GS
▫ TnrA inhibira izražanje gena za glutamat sintazo

Ko je koncentracija glutamina nizka:
Inhibitorna aktivnost TrnA je blokirana, TrnA deluje kot aktivator transkripcije genov za uporabo sekundarnih virov dušika.

Question 135

B. subtilis - regulacija s GltC.

Answer 135

Ko je koncentracija alfa-ketoglutarata (vsebuje dušik) visoka:
▫ GltC deluje kot transkripcijski aktivator gena za glutamat sintazo

Ko je koncentracija glutamata visoka:
▫ Aktivacija z GltC je zmanjšana

GltC: reagira na alfa-ketoglutarat.

13 skica

Question 136

B. subtilis - regulacija s CodY.

Answer 136

CodY je DNA-vezavni globalni regulatorni protein, ki je ohranjen pri mnogo po Gramu pozitivnih bakterij

Je splošni senzor za fiziologijo celice

Običajno deluje kot represor genov, katerih produkti sodelujejo pri odzivu celice na pomanjkanje hranil (npr. gen za glutamat sintazo, geni za privzem in uporabo drugih AK, ki se jih lahko
uporabi za sintezo glutamata in glutamina)

DNA-vezavna aktivnost CodY je aktivirana z visokimi koncentracijami GTP ali visokimi koncentracijami razvejanih aminokislin (levcin, izolevcin, valin)
▫ Visok nivo GTP → pomeni, da ima celica dovolj energije
▫ Razvejane aminokisline so dober signal za metabolno aktivnost, ker je njihova sinteza odvisna od dostopnosti dušika, ogljika in fosforja → visoke koncentracije teh AK pomenijo, da celica ne strada

Question 137

Regulacija sinteze ribosomov in tRNA.

Answer 137

Celica mora zaznat ali lahko hitro raste ali ne.
Celica hitro raste -> več ribosom, zaradi večje potrebe proteinov.

• da celice lahko uspešno rastejo, morajo energijo kar je le mogoče najbolje izkoristiti
• eden izmed najbolj učinkovitih načinov, kako celice to lahko naredijo je z uravnjavanjem sinteze ribosomov in tRNA (ob vsakem času je več kot ½ sintetizirane RNA bodisi rRNA ali tRNA)
• celice naredijo le toliko rRNA in tRNA, kolikor jih rabijo (in še to morajo biti v ustreznem razmerju), kar pa je odvisno od hitrosti rasti
  ▫ hitro rastoča E. coli rabi 70.000 ribosomov
  ▫ počasi rastoča E. coli rabi manj kot 20.000 ribosomov

Question 138

Zgradba prokariotskih ribosomov.

Answer 138

rRNA + proteini + podenota -> sestavljen ribosom.

oznake genov (vseh genov je preko 50):
▫ rpl in rpm (npr. rplK – gen za ribosomski protein L11): rplA-rpmJ
▫ rps in sra (npr. rpsL – gen za ribosomski protein S12): rpsA-rpsU, sra (stac. faza)

Question 139

Pozicije genov za sestavine ribosomov.

Answer 139

84 min je začetek.

Med geni za ribosome so tudi geni za RNAP, tRNA in proteine potrebne v replikaciji.

Geni niso naključno porazdeljeni po kromosomu, ampak v večjih skupkih okoli oriC. Dva največja skupka sta okoli 73 in 90 min.

7/32

Question 140

Regulacija sinteze komponent ribosomov.

Answer 140

Sinteza ribosomskih proteinov in rRNA je usklajena, pa čeprav potekata sinteza ribosomskih proteinov in nastanek rRNA neodvisno drug od drugega in se rRNA in proteine L in S šele kasneje združi v funkcionalne ribosome.

Hitrost sinteze ribosomskih proteinov je prilagojena hitrosti sinteze rRNA – je
namreč translacijsko avtoregulirana - običajno en protein (veže se na rRNA v začetnih korakih sestavljanja podenote) iz celotnega operona to naredi za vse.

7/33

Question 141

Regulacija sinteze rRNA in tRNA.

Answer 141

• Nastanek rRNA
• v vsakem ribosmu je po en tip rRNA, zato je nastanek vseh treh iz ene pre-RNA smiseln in zagotavlja enake količine vseh treh

7/34

Question 142

Regulacija sinteze rRNA - transkripcija.

Answer 142

Nastanek rRNA: bakterije imajo več kopij operona za rRNA, da si rRNA lahko pripravijo v dovolj velikih količinah:
▫ E. coli: 7 kopij operona rRNA: rrnA, … rrnF,… rrnH z geni rrs (za 16S rRNA), rrl (za 23S rRNA) in rrf (za 5S rRNA) – rrnD ima dve kopiji rrf
▫ B. subtilis: 10 kopij operona za rRNA

Če je nuja lahko en operon rRNA prepisuje hkrati 50 RNAP.

Promotorji operonov rRNA so zelo močni sigma70-promotorji (zaporedja -10 in -35 se zelo ujemajo s konsenzusnim zaporedjem) + imajo še zaporedje UP (na to zaporedje se vežejo alfa-CTD domene RNAP, zato se poveča transkripcija).

Pred promotorjem se veže še regulator FIS, ki pospeši transkripcijo (FIS je več v log fazi, v stacionarni fazi njegova koncentracija pade).

Obstaja tudi antiterminacija – elementi za to so pozicinirani tik za promotorjem in med rrs ter rrl in preprečujejo zaustavljanje RNAP in predčasno terminacijo transkripcije.

7/35

Question 143

Regulacija sinteze rRNA – usklajenost s
hitrostjo rasti.

Answer 143

• celice, ki hitreje rastejo, rabijo več ribosomov – usklajenost s hitrostjo rasti
• preko koncentracije ATP oz. GTP
• promotorji operonov rRNA (pa tudi tRNA) so občutljivi za koncentracijo ATP oz. GTP – ki sta kot prva dodana v nastajajočo RNA (iniciacijski nukeotid), saj je +1 v matrici DNA bodisi T ali C -> veže se ATP, da dobimo vezan G ali A
• RNAP (R) se na te promotorje (P) sicer hitro veže (RPc), a odprt kompleks (RPo) se tvori samo za čisto kratko časa in se povrne hitro v zaprt kompleks (RPc), razen če ni na volja ATP oz. GTP.

7/38

Question 144

Nastanek ppGpp.

Answer 144

• najprej nastane pppGpp (prenos dveh P iz ATP na 3’-OH GTP)
• fosfatazna funkcija RelA nato pppGpp hitro pretvori v ppGpp (odcepi rdečo fosfatno skupino)

7/38

Question 145

Odziv na neugodne razmere - vloga SpoT.

Answer 145

• na znotrajcelično koncentracijo ppGpp vpliva tudi SpoT
• tako kot RelA lahko sintetizira pppGpp in iz njega ppGpp, a lahko ppGpp pretvori tudi nazaj v GDP
• aktivnost pretvorbe ppGpp v GDP je inhibirana ob pomanjkanju hranil
• B. subtilis ima samo en encim, ki ima tako funkcijo RelA kot SpoT
• encim B. subtilis je Rsh (RelA-SpoT homolog)

Question 146

Vloga ppGpp.

Answer 146

• koncentracija ppGpp
  torej naraste ob pomanjkanju hranil na
  ravnem gojišču,
• pa tudi s prehodom v stacionarno fazo rasti,
• in tudi v različnih drugih stresnih pogojih
• pravimo mu “splošni alarmon”

Question 147

Vloga DksA.

Answer 147

Pri E. coli protein DksA še poveča delovanje ppGpp na RNAP:
▫ še poveča se inhibicija transkripcije operonov rrn in
▫ poveča se stimulacija transkripcije promotorjev genov biosinteze AK

Protein DksA vstopi v kanal RNAP, skozi katerega drugače vstopajo dNTPji, in vpliva na delovanje RNAP.

Deluje odvisno od zaporedja bogata na AT ali GC.
AT + DksA -> aktivacija operonov, ki privedejo do produktov, ki pomagajo čez to fazo.
GC + DsaA -> geni, ki so potrebni za sintezo ribosomov -> mora se utišat.

Question 148

Odziv na neugodne razmere pri drugih bakterijah.

Answer 148

• homologi RelA/SpoT se najdejo skoraj v vseh bakterijskih genomih
• ni še znano, če vse te bakterije tudi na podoben način kot E. coli reagirajo na ppGpp
• homolog DksA ni tako pogost (npr. B. subtilis ga nima)
• v B. subtilis je za regulacijo operonov rrn bistvena koncentracija GTP, in ne ppGpp

Question 149

Toplotni šok.

Answer 149

Je med najbolj preučenimi globalnimi
odzivi.

Ob dvigu temperature E. coli vklopi vsaj 30 različnih genov, ki imajo zapise za proteine Hsps (ang. heat shock proteins).

geni Hsps se vklopijo tudi ob izpostavitvi etanolu in drugim
organskim topilom –odziv je torej bolj
splošen.

Odziv je bil najprej odkrit pri evkariontih.

Bakterija mora zaznat, da je v drugačnem okolju (v gostitelju; iz 11 C na 37 C).
Ob normalnih razmerah je zanka, v katero se ujame SD zaporedje.
Po toplotnem šoku, ni zanke in SD zaporedje je na razpolago.
Sigma H se veže na RNAP -> popravljajo DNA.
Lon, Clp se razgradi.
Ko se pa temperatura zniža se veže na sigma H DnaK, ki gre potem v razgradnjo.

Večina teh več kot 30 genov je tudi v
razmerah z normalno T vklopljena, a se
njihovo izražanje ob dvigu T bistveno poveča.

Question 150

Toplotni šok pri drugih bakterijah.

Answer 150

• večina drugih bakterij, vključno s B. subtilis ima drugačen odziv na toplotni šok: uporabljajo normalno sigmo in protein HrcA
• HrcA je represor, ki preprečuje izražanje genov toplotnega šoka ob normalni temperaturi
• vezavno mesto represorja HrcA je mesto CIRCE (zelo ohranjeno med bakterijami –je tudi pri cianobakterijah)
• šaperon, ki javlja stanje temperature je GroEL, ki ga celica rabi za zvitje HrcA (ob povišani T ga titrirajo napačno zviti proteini in GroEL ne zmore več zvijati HrcA).

7/45

Question 151

Splošni odziv na stres pri po Gramu negativnih bakterijah - sigma S.

Answer 151

Sigma S = sigma 38.

Za gene, katerih izražanje se mora povečati ob splošnem stresu (npr. stacionarni fazi, pomanjkanje hranil, oksidativne poškodbe, nizek pH)

SigmaS (stacionarna faza) je zelo podobna sigmi70 in prepozna sigmi70 podobne promotorje (včasih lahko preoznavata promotorje drug od drugega).

Poskusi z mikročipi so pokazali, da je 481 genov (več kot 10 % vseh genov)
pod kontrolo sigmaS (bodisi +, bodisi -):
▫ od teh 481 jih je 140 pod vplivom sigmaS v vseh testiranih stresnih razmerah v zgodnji stacioanarni fazi
▫ preostali 341 je vezanih na posamezne strese (npr. nizek pH, visoka ozmolarnost).

SigmaS = master regulator.

SigmaS mora hitro odgovoriti na zaznan stres: nivo mRNA rpoS je
vseskozi visok že v log fazi + posttranskripcijska regulacija:
▫ preprečeno je prevajanje mRNA rpoS (regulacija z regulatorno sRNA DsrA)
▫ razgradnja SigmaS (regulacija z RssB in Ira).

Sinteza DsrA se poveča ob nizkih temperaturah.

DsrA sRNA ima različno vezavo na
mRNA rpoS in mRNA hns!

RprA – je sRNA, ki lahko nadomesti DsrA v določenih razmerah.

H-NS je globalni regulator, ki zaradi svoje vezave na DNA, ki povzroči upogib DNA, zavre transkripcijo mnogo genov, povezanih z rastjo in metabolizmom.

Razpolovna doba sigmaS v log fazi je 1-2 min, a v stacionarni fazi in drugih stresih se razpolovna doba poveča in koncentracija simgaS tako hitro naraste.

ClpXP lahko razgradi sigmoS samo, če je nanjo vezan protein RssB (adaptor). V stresnih pogojih nastane antiadaptor Ira.

7/46-49

Question 152

Proteaza ClpXP.

Answer 152

Proteaza ClpXP je sestavljena iz dveh proteinov:
▫ sodčkastega šaperona iz 6
kopij ClpX, ki razvija proteine in
▫ proteaze ClpP, ki razgradi razvit protein.

Question 153

Proteaza Lon.

Answer 153

V dveh oblikah: heksamer (ko je nižja koncentracija Lon) in dodekamer (ko je višja koncentracija Lon).

ATPazne domene razvijejo, proteazne domene razgradijo.

Question 154

Splošni odziv na stres pri po Gramu
negativnih bakterijah – 6S RNA.

Answer 154

Še ena oblika postranslacijske regulacije – regulacija z regulatorno RNA 6S RNA
▫ ta regulatorna RNA je strukturno podobna promotorjem sigma70
▫ namesto na promotor se RNAP s sigma70 veže na 6S RNA in tako RNAP postane neaktivna
▫ RNAP s sigmaS se ne veže na 6S RNA
▫ koncentracija 6S RNA se poveča ob prehodu v stacionarno fazo

Question 155

Regulatorne RNA.

Answer 155

• sRNA igrajo zelo pomembno vlogo v regulaciji (rečemo tudi riboregulacija)
• riboregulacija je lahko na različnih nivojih
• večina sRNA se veže (tvorijo se komplementarni bazni pari) na drugo molekulo RNA, ki jo uravnava
• sRNA so lahko cis (nastanejo z nasprotne verige kot RNA, ki jo uravnavajo – protismiselna RNA) ali trans (večina jih je takih)

Slika 7/53:
* preprečujejo translacijo, če so komplementarne TIR
* vplivajo na terminacijo transkripcije,
če so komplementarne izven TIR
* vplivajo na plazmidno replikacijo
* se 100% ujemajo s svojo tarčo.

• preprečujejo translacijo, če se vežejo na TIR
• omogočijo translacijo, če se vežejo v bližini TIR in porušijo terminacijske zanke, ki zajemajo TIR
• povzročijo razgradnjo mRNA
• se ne ujemajo 100% s svojimi tarčami, zato za vezavo nekatere rabijo Hfq.

Obstajajo tudi regulatorne RNA, ki se ne vežejo na RNA, ampak na proteine, ki jih regulirajo – primer CsrB:
▫ je sRNA, ki tvori veliko število sekundarnih struktur
▫ te sekundarne strukture so podobne vezavnim mestom RNA-vezavnega proteina CsrA.

Primer regulatorne RNA, ki se veže na proteine je tudi 6S RNA.

V E. coli obstaja preko 100 različnih regulatornih RNA.

Zapisane so pogosto v intergenskih regijah.

Z bioinformatsko analizo se jih najde, ker imajo konsenzusne promotorje in
transkripcijske terminatorje, nimajo pa prepoznavnih odprtih bralnih okvirjev.

Najde se jih tudi z mikročipi in RNAseq.

Zaporedja so pogosto ohranjena med sorodnimi organizmi (kar drugače ne
velja za intergenska zaporedja).

Hfq kot vaba.

Question 156

Splošni odziv na stres pri po Gramu
pozitivnih bakterijah.

Answer 156

Pri teh bakterijah, vključno z B. subtilisom, je drug tip faktorja sigma –sigmaB - za prepis genov, katerih izražanje se inducira v stresnih razmerah (ima drugačno AK sestavo in prepozna drugačno promotorsko zaporedje).

Nastanek sigmaB temelji na inaktivaciji anti-sigma faktorja, proteina, ki se drugače veže na sigmoB in ji prepreči vezavo na RNAP.

Signalna pot za aktivacijo sigmaB je preko proteinov Rsb.

Proteini RsbR, S, T, X tvorijo kompleks (t.i. stresosom), ki zazna zunanji stres in preko RsbU inducira signalno kaskado s fosforilacijo.

Vsi proteini Rsb so namreč serinske ali
treoninske kinaze.

Končni rezultat je sprostitev sigmeB z antisigme RsbW in vezava SigmeB na RNAP (RsbV je anti-anti-sigma).

RsbX je fosfataza.

Različni proteini Rsb zaznajo različne stresne dejavnike in se kot odgovor
nanje fosforilirajo.

Question 157

Odziv na stres ovojnice.

Answer 157

Membrana je prva zaščita pred zunanjim stresom

Membrana reagira na spremembo v ozmolarnosti, prisotnost toksičnih spojin, toplotni šok, spremembo pH.

V normalnih pogojih je osmotski pritisk v celici večji kot v okolju. Integriteta celice se ohranja zaradi celične stene, a samo do neke mere. Zato mora celica reagirati na spremembo v ozmolarnosti. Spremba v ozomolarnsti lahko nakazuje tudi na nahajanje v gostitelju.

Stresni odziv skrbi za ohranitev integritete membrane:
▫ iznos/akumulacija K-ionov in drugih spojin (npr. prolin, glicin betain)
▫ E. coli in druge po Gramu negativne bakterije morajo skrbeti tako za osmotski pritisk v citoplazmi kot periplazmi (E. coli tako sintetizira
oligosaharide v periplazmi) in
▫ regulira sintezo porinov, ki tvorijo pore (beta-sodčki) v zunanji membrani – OmpF in OmpC.

Nestresne razmere:
OmpF – večje pore – omogočajo hitrejši prehod - nudijo prednost v vodnih okoljih.

Stresne razmere:
OmpC – manjše pore – ne dopuščajo prehoda večjih toksinov (npr. soli žolčnih kislin).

Okolje z višjo ozmolarnostjo – več OmpC, manj OmpF.
Okolje z nižjo ozmolarnostjo – manj OmpC, več OmpF.

Več OmpC in manj OmpF je tudi:
▫ pri višjih T,
▫ višjem pH,
▫ ob oksidativnem stresu,
▫ ob prisotnosti organskih topil (etanol),
▫ ob prisotnosti nekaterih antibiotikov,
▫ ob prisotnosti nekaterih toksinov

Gena za OmpC in OmpF sta tako v več
različnih regulonih.

Manjša pora OmpC tako omejuje gibanje mnogo toksičnih spojin v celico.

Question 158

Dvokomponentni sistem EnvZ-OmpR.

Answer 158

EnvZ je senzorska kinaza v
notranji membrani:
▫ NTD v periplazmi (zazna signal ?)
▫ CTD v citoplazmi (se fosforilira)
* EnvZ preda signal naprej
proteinu OmpR (se fosforilira), ki
je transkripcijski regulator, ki
uravnavo sintezo porinov
* Ob visoki osmolarnosti je protein
EnvZ bolj pogosto fosforiliran,
višji nivo OmpR∼P vodi v
aktivacijo transkripcije gena
ompC
* ob nizki ozmolarnosti prevlada
fosfatazna funkcija EnvZ in zato
je nivo OmpR∼P nižji, dogaja se
transkripcija ompF

Question 159

Protismerna (antisense) RNA uravnava translacijo mRNA gena ompF.

Answer 159

Nizka osmolarnost:
Ko je zunaj celice osmolarnost nizka, se ompF mRNA prepiše in nastane protein OmpF.

Visoka osmolarnost:
Ko je zunaj celice osmolarnost visoka,
se aktivira gen micF in prepiše v micF RNA. micF RNA se poveže s 5´koncem ompF RNA in s tem blokira mesto za vezavo ribosoma. Protein OmpF ne nastaja, ker je preprečena translacija.

OmpF – protein zunanje membrane, ki deluje kot kanal za pasivno difuzijo majhnih polarnih molekul.

7/63

Question 160

Dvokomponentni sistem CpxA-CpxR.

Answer 160

• CpxA je senzorska kinaza, ki se fosforilira v odziv na signal
• Signal je kopičenje proteinov v periplazmi, ki bi jih celica drugače morala iznesti (npr. fimbrije)
• CpxR je regulator, transkripcijskih aktivator
• CpxR ∼P aktivira več kot 100 različnih genov, med njimi tudi proteaze in šaperone, ki odstranijo v periplazmi nakopičene proteine

Question 161

Zunajcitoplazemski faktor sigmaE.

Answer 161

• Je še en sistem, ki se odzove na zunajcitoplazemski stres
• sigmaE omogoča prepis genov, katerih produkti delujejo v periplazmi:
  ▫ proteaze, ki razgradijo poškodovane periplazemske proteine
  ▫ šaperoni, ki pomagajo zvijati proteine, ki prehajajo periplazmo
• Regulacija sigmaE poteka preko proteina RseA, ki je anti-sigma faktor (protein RseB stimulira to vezavo).

RseA je protein v citoplazemski membrani, katerega domene segajo tako v citoplazmo, kot v periplazmo.
Citoplazemska domena veže sigmoE in ji s tem prepreči delovanje. Ob poškodbi zunanje membrane se proteini OMP nabirajo v periplazmi, ker ne morejo tvoriti porinov v zunanji membrani. C-terminalna
domena akumuliranih Omp se tako veže s C-terminalno perimplazemsko domeno proteaze DegS.

Ta vezava aktivira proteazno aktivnost DegS in tako odcepi periplazemsko domeno RseA.
Proteaza RseP nato odcepi citoplazmesko domeno RseA z vezanim sigmaE. Proteza ClpXP zatem razgradi preostali del RseA in tako se sprosti sigmaE, ki omogoča prepis regulona sigmeE.

Question 162

Regulacija, vezana na železo.

Answer 162

železo je pomemben
nutrient:
▫ mnogo encimov (npr.
Železova superoksiddismutaza) ima železo v aktivnem centru (vloga katalizatorja)
▫ mnogo transkripcijskihfaktorjev (npr. FNR, ki regulira gene za anaerobni metabolizem) ima železo (vloga senzorja nivoja kisika)

Železo v naravi obstaja v dveh oblikah:
▫ Fe3+
-Oblika Fe v velikih netopnih
spojinah
-Netopno železo
-Ga bakterije le stežka
uporabijo
▫ Fe2+
-Topno železo
-Ta oblika Fe se ob prisotnosti
kisika hitro spremeni v Fe3+

V naravi je v aerobnih okoljih
tako večinoma Fe3+ -> Bakterije izločajo sideroforje v
okolje, sideroforji vežejo Fe3+ v okolju in ga transportirajo v celico, v citoplazmi celice (reducirajoče
okolje) je nato Fe3+ pretvorjen v
Fe2+, sideroforje celica sintetizira samo, ko ima pomanjkanje železa-

Question 163

Represor fur.

Answer 163

DNA-vezavni represorski protein, ki se veže na DNA (motiv HTH na N-terminalnem koncu) in uravnava iniciacijo transkripcije. Na C-terminalnem koncu ima dimerizacijsko domeno in v sredini je vezavno mesto za železo.Oblika aporepresorja in represorja, ko ima vezan korepresor (= Fe2+).

Question 164

Regulon Fur – negativna regulacija.

Answer 164

Fur (Fur-Fe2+) deluje neposredno kot represor. Vezava Fe2+ povzroči konformacijsko spremembo Fur nastane aktiven represor, ki se veže na operatorska zaporedja Fur, ki delno prekrivajo zaporedja -10 sigma70 promotorja. RNAP se ne more več vezati na promotor.

Visok nivo Fe: geni za asimilacijo železa (npr. geni za siderofor).

Nizek nivo Fe: geni za asimilacijo železa (npr. geni za siderofor).

Ta regulacija je zelo ohranjena med po Gramu negativnimi bakterijami. Po Gramu pozitivne bakterije (ne vse!) imajo podoben represorski sistem (represor ima sicer nizko AK podobnost, je pa strukturno podoben).

Question 165

Regulon Fur – pozitivna regulacija – RyhB.

Answer 165

Fur (Fur-Fe2+) deluje posredno
preko sRNA RyhB. Zagotavlja, da se ob prebitku železa, železo porablja za različne železo-vsebujoče proteine (npr. akonitaza A, Fe superoksid dismutaza) in da se sintetizirajo proteini za hrambo železa (npr. feritinu podoben protein). Koncentracija takih proteinov ob prebitku Fe2+ torej naraste. Med tem ko v okolju z nizkim nivojem Fe2+ sinteza RyhB zagotavlja, da se takšni geni ne izražajo in se železo porablja samo za esencialne železo vsebujoče proteine.

Question 166

Akonitaza – translacijski represor.

Answer 166

Akonitaze so encimi v ciklu
trikarboksilnih kislin (TCA).

Citrat pretvorijo v izocitrat.

Vsebujejo Fe v obliki [4Fe4S]2+.

Proteini s takšno prostetično skupino so občutljivi za oksidacijo z O2.

E. coli ima dve akonitazi:
▫ AcnA
▫ AcnB (glavna akonitaza za cikel TCA in je tudi regulator genov metabolizma železa, ki se odzovejo na pomanjkanje železa)

7/72,73

Question 167

Bakteriofag lambda.

Answer 167

• kolifag z ikozaedrsko glavo in fleksibilnim repom
• linearna dsDNA, 48.502 bp, ~50 ORF
• eden najbolje raziskanih kompleksnih virusov
• uporaben tudi v DNA - tehnologiji kot vektor
• gostitelj je bakterija E. coli
• zapleten življenjski cikel * temperiran fag (obstaja v dveh življenjskih oblikah)

Sestavljen je iz glave, repa in repnih vlaken.

Question 168

Življenjski cikel faga lambda.

Answer 168

Litična pot:
fag takoj prične s svojim pomnoževanjem, ki se zaključi z
uničenjem (lizo) celice.

Lizogena pot:
fag se vključi v bakterijski kromosom - oblika provirusa (profag) in se podvojuje z njim, prenaša se v naslednjo generacijo bakterij.

Slika 8/4:
- fag se veže na receptor in potem sprosti DNA
- cirkularizacija faga
- fagna DNA se vključi v genom (profag)
- indukcija - vstop v litični cikel
- DNA se izreže in se genom razmnožuje
- fagi se sestavijo in se z lizo celice sprostijo v okolje.

Question 169

Za kaj je potreben genom lambde.

Answer 169

Potreben za:
- lizogenijo (CIII vzdržuje CII)
- lizogenijo in lizo (N - vklop zakasnjeno zgodnjih genov)
- lizogenijo (cI - lizogeni represor
- lizo (cro - konča z represijo)
- lizogenijo (CII - začne z represijo)
- lizo (Q - vklop poznih genov)

Question 170

Naštej pomembna zaporedja v genomu lambde in kakšna je njihova funkcija?

Answer 170

pL: Promotor za prepis v levo usmerjenih genov.

pR in pR‘: Promotor za prepis v desno usmerjenih genov.

oL in oR: Operatorja za vezavo represorjev CI in Cro.

tL1, tL2, tR1, tR234, tR′ :Terminacijska mesta.

nutL in nutR ter qut: Vezavna mesta za antiterminacijski protein.

pRE: Promotor za vzpostavitev represije (repressor establishment), aktiviran z CII.

pRM: Promotor za vzdrževanje represije (repressor maintenance), aktiviran z CI.

pI: Promotor za transkripcijo int, aktiviran z CII.

Question 171

Pomembni geni lambde in njihova funkcija.

Answer 171

N, Q: Antiterminatorski protein.

O, P: Iniciacija replikacije fagne DNA.

CI: Represor pL in pR, aktivator pRM.

CII: Aktivator transkripcije cI iz pRE in
aktivator transkripcije int iz pI.

CIII: Stabilizira CII, ker inhibira celično
proteazo.

Cro: Represor sinteze CI iz pRM.

Gam: Protein, potreben za replikacijo
RC, inhibira RecBC.

Red (beta in exo): Rekombinacija.

Int Integraza: (mestno-specifična
rekombinaza).

Xis: ekscisaza.

Question 172

Kaj vpliva na izbiro poti faga lambde?

Answer 172

• zapoznela zgodnja faza, ko se izražata tako cro kot cI je skupna lizogenemu in litičnemu ciklu, tako da je trenutek vzpostavitve ene ali druge poti vezan na to ali CII uspe omogočiti dovolj
  sinteze represorja CI, da preseže delovanje Cro
• gojišče (bogato gojišče vodi v litičen cikel)

Question 173

Vezava viriona in vstop DNA.

Answer 173

Virion - zrel virusni delec, ki je sposoben celico okužit in se v njej razmnoževat.

Fag lambda se s proteinom J adsorbira na protein LamB (receptor-porin) v zunanji membrani E. coli. Veže se na LamB in gre DNA skozi.
Protein LamB je trimerni porin za vnos manoze skozi zunanjo membrano, ki je receptor tudi za nekatere druge fage.

Skozi notranjo, citoplazemsko membrano DNA potuje s posredovanjem transportnih proteinov za manozo - manozni permeazni kompleks - vnos manoze skozi citoplazemsko membrano.

8/11

Question 174

Cirkularizacija lambde.

Answer 174

Cirkularizacija se dogodi takoj po vstopu fagne DNA v citoplazmo.

Linearen ds genom v virionu s ss konci (cos) na 5‘ koncih

V gostitelju se komplementarni konci cos med seboj povežejo in bakterijska ligaza zalepi vrzeli v fosfodiestrski verigi DNA.

Zaradi cirkularizacije tvorijo sedaj pozni geni eno samo transkripcijsko enoto, ki se prepiše s P‘R.

8/12,13

Question 175

Katere so tri periode v razvoju faga lambde.

Answer 175

Zgodnja:
- 2 gena-regulatorja: N in cro (določi ali gre v litično pot)
*RNAP prepiše N in cro iz PL in PR.

Zapoznela zgodnja:
- geni 4 regulatorjev: cI, cII, cIII (če se ti trije pojavijo - lizogena pot) in Q (litična pot)
- 7 genov za rekombinacijo oz.
integracijo
- 2 gena za replikacijo
*pN dovoli transkripcijo iz enakih promotorjev da se nadaljuje preko N in cro

Pozna: (samo litični cikel)
- 10 genov za glavo
- 11 genov za rep
- 2 gena za lizo

8/14

Question 176

Zgodnji in zapozneli zgodnji geni.

Answer 176

Zgodnji in zapozneli zgodnji geni so potrebni tako za litičen kot lizogen cikel/1

Lambda ima dva zgodnja (immediate
early) gena, N in cro, ki ju prepiše gostiteljska RNAP.

N je potreben za izražanje zapoznelih
(delayed early) zgodnjih genov.

Štirje od zapoznelih poznih genov so regulatorji, trije za lizogen del cikla in eden za litični del cikla.

Za lizogenijo so potrebni zapozneli pozni geni cI-cII-cIII.

Za litičen cikel se potrebuje zgodnji gen cro in zapoznel pozni gen Q, ki je potreben za transkripcijo poznih genov.

Question 177

Vzpostavitev lizogenije.

Answer 177

• produkta zapoznelih zgodnjih genov cII in cIII omogočita RNAP, da začne s
  prepisovanjem mRNA s promotorja PRE (RE – repressor establishment)
• PRE namreč nima tipičnega konsenzusnega zaporedja –10 in –35, ki ju prepozna RNAP
• protein zapisan v cII omogoči, da RNAP s promotorja PRE prične prepisovati mRNA
• protein zapisan v cIII zaščiti pCII pred degradacijo (pCII je namreč zaradi razgradnje z gostiteljsko proteazo HflA zelo nestabilen)
• transkripcija s PRE vodi v sintezo lambda-represorja CI in blokira translacijo mRNA gena cro (učinek protiprepisne RNA).
• za vzpostavitev lizogenije je nujen lambda-represor, zapisan v genu cI
• lambda represor deluje na operatorja OL in OR in prepreči sintezo mRNA s PL
  in PR (prepreči izražanje zgodnjih in zapoznelih zgodnjih genov ter posledično poznih genov)
• lambda represor CI se veže kot dimer
  na operatorja OL in OR in prepreči
  vezavo RNAP na PL in PR -> prepreči izražanje genov.

PRE je pomemben, da dobimo cI. cII je potreben, da se PRE prebere (ta nima mesta, da ga RNAP prebere) -> ko se cII veže, lahko prebere.

Question 178

Kako se veže lambda represor na DNA?

Answer 178

Lambda represor se na DNA veže kot dimer:
Monomer represorja CI ima dve domeni:
– N-terminalna domena ima funkcijo vezave na DNA (DNA-vezavno mesto)
– C- terminalna domena ima dimerizacijsko funkcijo

Lambda represor uporabi motiv HTH (helix-turn-helix) za vezavo na DNA:
Vsaka DNAvezavna domena se veže
na svoje lice DNA – dve kratki α-helikalni regiji (2 in 3) proteina CI se vežeta v veliki graben dvojne vijačnice
DNA.

Question 179

Vezava CI represorja na operator.

Answer 179

OR1, OR2, OR3 in OL1, OL2, OL3.

Če je dovolj represorja, se veže na tri vezavna mesta. Če je manj lambda represorja se veže najprej na OR1 (prekrije PR) potem OR2 (OR3 prost) in če ga je veliko se veže tudi na OR3 (prekrije PRM)

Ko se veže na OR1, prekrije mesto za vezavo RNAP, PR.

Oba operatorja OL in OR vsebujeta tri vezavna mesta za represor CI.
Oba operatorja OL in OR se prekrivata s promotorjem za RNAP.

Represor CI se veže kooperativno na operator.

• vezava represorja na eno vezavno mesto poveča afiniteto za vezavo
  represorja na sosednje vezavno mesto v operatorju
• največja afiniteta vezave je za OL1 in OR1 (10x večja), zato se represor
  najprej veže na vezav no mesto 1, zatem na OL2/OR2

8/23, 24

Question 180

Kako lambda represor CI vzdržuje lizogenijo?

Answer 180

Dokler lambda represor nastaja, tako dolgo je celica v lizogenem ciklu.

Vezava represorja CI na mestu OR2 omogoča vezavo RNAP na promotor PRM (RM – repressor maintenance) in tako se lahko dogaja prepisovanje gena cI.

Question 181

Avtoregulacija lambda represorja.

Answer 181

Malo represorja: veže se na OR1 in OR2, kar pomeni, da je PRM prosta. Sem se veže RNAP, nastane cI mRNA -> represorski monomer -> represorski dimer -> veže se na mesta O.

Veliko represorja: veže se na OR1, OR2 in OR3 -> se upogne in tako dobimo zavoj -> represor tako sam sebe zavre in promotor je ujet in se ne izrazi.

Question 182

Nastanek lizogene bakterije.

Answer 182

Regulator CII omogoči tudi transkripcijo s promotorja PI. Tako se izrazi gen za integrazo, ki omogoči vključitev lambde v kromosom bakterije.

Integraza omogoči mestno-specifično
rekombinacijo med attP in attB. (att –
attachment (mesto vezave), P - fag, B - bakterija). attP je homologen attB. -> fagna DNA se vključi (attP/B).

8/27-29

Question 183

Imunost za superinfekcijo.

Answer 183

Represor C1 podeli imunost za superinfekcijo z drugim fagom, ki ima enako regijo imunosti.

Če nov fag inducira DNA, ko je bakterija lizogena, ne bi uspelo.

Question 184

Vzpostavitev litičnega cikla.

Answer 184

Razgradnja represorja vodi v litičen cikel.

Ob indukciji se povezava med C in N domeno prekine -> zaključi se lizogeni cikel.

Poškodbe DNA preko sistema SOS in proteina RecA vodijo v indukcijo faga
lambda.

DNA se zaradi stresa, antibiotikov… poškoduje -> enoverižna DNA -> enoverižna DNA se poveže s RecA -> RecA-ssDNA -> nukleoproteinski kompleks -> razgradnja represorja -> operatorji se sprostijo in tako sta promotorja na voljo za RNAP -> Int/Xis sta potrebna, da se izključi fag -> fag v ciklični obliki v citoplazmi - litični cikel.

Cro se veže na L in D operator (na ista vezavna mesta kot CI-represor, le ta z obrnjeno afiniteto – najprej O3, potem O2 in nazadnje O1).
Cro inhibira sintezo lambda represorja
Preprečuje sintezo represorja iz PRM&raquo_space;akumulacija proteina Q, ki je pomemben za izražanje poznih genov in tako stimulira sintezo poznih genov-strukturnih proteinov»fagnih partiklov.

Vzpostavitev litičnega cikla je odvisna od antiterminatorskih faktorjev N in Q:
* pN: omogoča RNAP, da nadaljuje
prepisovanje preko terminatorjev v
zapoznele zgodnje gene
* pQ: omogoča RNAP, da nadaljuje
prepisovanje preko terminatorja v poznegene

8/31-34

Question 185

Antiterminacijski kompleks in vloga N.

Answer 185

Delujeta tako, da se transkripcije lahko nadaljuje preko mesta terminacije.

nut mesta niso aktivna v DNA, ampak so aktivna, ko so prepisana v mRNA.

Brez N:
Iz promotorja R se začne prepis nutR v mRNA. RNAP pride do vezavnega mesta tR1.

Z N:
N in AEBG kompleks se vežeta na RNAP. RNAP gre čez transkripcijski stop signal.
Ko se sintetizira mRNA, nastane kompleks iz proteinov Nus in N (lambda) na zaporedju nut. Ta kompleks se veže na RNA-pol in preprečuje, da bi polimeraza zastala na terminatorskih mestih, kar bi sicer povzročilo, da bi faktor ro prekinil
transkripcijo.

8/36,37

Question 186

Antiterminacijski kompleks in vloga proteina Q.

Answer 186

qut: od -35 do -10 -> te dve točki sta neugodno narazen in ko se RNAP veže ne more začet s transkripcijo -> pojavi se Q -> veže se na mesto qut -> RNAP se veže -> Q prisili, da se sigma faktor spremeni -> ta konformacijska sprememba povzroči, da RNAP prepozna dva mesta, ki sta podobna -35 in -10.

8/38,39

Question 187

Pomnoževanje DNA faga lambda.

Answer 187

Od začetka po mehanizmu podvojevanja „theta“, zatem, ko
koncentracija pomnožene DNA
naraste pa po mehanizmu „kotalečega se kroga“.

Nastanejo konkatemere, ki se pakirajo potem v fagne glave.

Glava nastane posebej in repek posebej in se potem združita.

Question 188

Kaj je mutacija?

Answer 188

Vsaka sprememba v zaporedju nukleotidov DNA, ki se deduje.

• sprememba v enem baznem paru
• sprememba v velikem številu baznih parov
• sprememba v obsežni regiji kromosoma
• zamenjave (AT -> GC)
• delecije (AGAT -> AAT)
• insercije (AAT -> AGAT)
• premik bralnega okvirja (na levi strani se vrine nukleoƟd in se bralni okvir premakne).
• duplikacija (del kromosomske informacije se podvoji)
• inverzija (del kromosomske informacije se “obrne naokoli”)

Enojna mutacija (single mutation) – povzročila jo je ena napaka v replikaciji/rekombinaciji/popravljanju (ni vezana na število spremenjenih baz).

Point mutation – točkovna mutacija. Hot
spots v DNA-pogoste mutacije.

Question 189

Loss-of-function (null), “leaky“, Gain-of-function.

Answer 189

a) mutacije, ko ni več produktov tega gena, gen se utiša.
b) mutacija zmanjša produkcijo
gena.
c) gen se tako spremeni, da dobimo nov protein z novo funkcijo.
d) če je gen prej bil utišan, ga mutacija spremeni in dobimo produkt. Funkcija se povrne.

Question 190

Mutante : reverante.

Answer 190

Prave reventante – sprememba ki je vodila v mutacijo se popravi (če se A doda, se potem tudi isti A odstani). Supresorske mutante. To preverjamo samo tako, da pogledamo DNA.

Domnevne revertante, ker lahko so tudi supresorske mutante - razlika v pogostnosti.

Question 191

Substitucija.

Answer 191

Dve vrsti substitucije:

• tranzicija (t zamenjal z c)
• transverzija (bazna tipa se zamenjata, t zamenja a).

Vzrok:

• Napačno parjenje baz: DNA-polimeraza se zmoti (G in T).
• Spontana deaminacija: baze se spreminjajo C se spremeni v U, povezava med G in U ni prava in se popravi.
• Oksidacija baz (gvanin -> oksidacija -> 8-oksogvanin

Posledice:

• drugačnosmiselne mutacije: T se je spremenil v C, v mRNA je namesto AUC, GUC in ta kodira drugo AK. AK lahko razdelimo v 5 skupin. Funkcijsko se lahko v skupini zamenjajo, ker so si med seboj podobne. Če se zaradi posledice mutacije ohrani isti tip AK, ni tako hude posledice, kot pa če se zamenjajo AK
  med skupinami.
• nesmiselne mutacije: ko se uvede stop kodon. GTT se spremeni v ATT, ta je v mRNA UAA (stop kodon). Amber (UAG),
  okra(UAA) in opal (UGA) (odvisno kateri stop kodon je bil uporabljen).
• polarni efekt - ena sama substitucija ima lahko zelo velik učinek: Rho mesto za terminacijo , na rut mesto na mRNA se veže Rho faktor in vrže polimerazo dol. Če so skos gor ribosomi, je rut mesto skos prekrit in se Rho faktor ne more vezat. In se naslednji geni lahko prepisujejo. Če je prislo do mutacije in je nastal stop kodon, se ribosom odveže, Rho se veže na rut in polimeraza pade iz DNA.

Značilnosti:

so točkovne mutacije
- pogosto “leaky”
- tudi nesmiselne mutacije so pogosto “leaky “
UGA>UAG>UAA
- hitro lahko revertirajo

Question 192

Premik bralnega okvirja.

Answer 192

Vzrok:

• DNA-polimeraza zdrsne. Ko se nukleotid ponavlja se lahko zgodi, da zdrsne in se okvir premakne.
• Za premikom bralnega okvirja sledijo popolnoma druge AK.
• Zdrs se pogosto dogodi na zaporedju, kjer so kratke ponovitve.

Patogene bakterije lahko premike bralnega okvirja pogosto uporabljajo. Imajo en gen .(mehenizmi izogiba imunskemu
sistemu).

Question 193

Delecije.

Answer 193

Vzroki:
- Rekombinacija med dvema neposrednima ponovitvama (ni nujno, da se 100 % ujemata), ki sta na dveh lokacijah (I-dveh različnih molekulah DNA, II – isti
molekuli DNA). Rekombinacija je pomemben vzrok delecije. Ko sta dve zaporedji ko sta si zelo podobni, da lahko med njima pride do zamenjave zaporedij, lahko je to znotraj iste molekule ali med različnimi. Te ponovitve mrajo bit dolge najmanj 50 bp. S tem se lahko del kromosoma izreže in obratno.

• Ponovitve morajo biti dolge vsaj 50 bp, da se na njih lahko dogaja rekombinacija.
• IS, Tn, geni rRNA – to so vse lahko možne ponovitve za rekombinacijo.

Značilnosti:

• Običajno niso “leaky”
• Nastanejo nefunkcionalni proteini oz. genski produkti
• Pogosto vzrok genskih fuzij oz. drugačne regulacije
• Dolge delecije nikoli ne morejo revertirati
• Označimo jih z grško črko delta ()

Question 194

Tandemske duplikacije.

Answer 194

Vzroki:

• rekombinacija: isto zaporedje se ponavlja. 2 molekuli z 2 ponovitvama, ena ponovitev se prestavi na drugo molekulo in imamo eno molekulo z eno ponovitvijo in eno z tremi.

Posledice:

• Nastanek tandemskih duplikacij v enem
  samem genu običajno inaktivira protein.
• Če pa je podvojena regija dovolj dolga –
  vključuje dva ali več genov – potem pa sploh ni posledic.

Bakterije lahko dolge duplikacije preživijo popolnoma brez vpliva na fenotip.

Značilnosti:

• Običajno tandemske duplikacije v enem
  genu niso “leaky”.
• A hitro lahko revertirajo in niso stabilne.

Mutacija se lahko hitro popravi, so nestabilne mutacije. Velik imen imajo za evolucijo, nastaneta 2 kopiji gena, ena se podvaja druga se ohranja.

Question 195

Inverzije.

Answer 195

Vzroki:

• rekombinacija: rekombinacija med dvema
  obrnjenima ponovitvama (ni nujno, da se 100 % ujemata).

Značilnosti:

• Hitro lahko revertirajo in niso stabilne, razen če je šlo za rekombinacijo med dvema ne čisto enakima obrnjenima ponovitvama.
• Pogosto ne vodijo v spremembo fenotipa – izjema regulacija.
• Zelo dolge inverzije so lahko problematične – npr. usmerjenost zaporedij KOPS.

9/36:
Promotor za fimA je na delu ki se lahko obrača. In če se del obrne, se fimA ne more izrazit.

Question 196

Insercije.

Answer 196

Vzroki:

• za kratke - zdrs
• za dolge - transpozicija

Značilnosti:

• Inaktivirajo gen
• Običajno niso “leaky”
• Transkripcijsko-terminacijska mesta TrE
  lahko motijo izražanje genov, ki jim sledijo.
• Lahko revertirajo, čeprav redko (pri TrE je to nemogoče, kratka ponovljena zaporedja, ki ostanejo so prekratka za rekombinacijo).

Question 197

Supresija mutacij.

Answer 197

Nekje drugje se zgodi mutacija, ki izniči vpliv neke druge mutacije.

Intragenski (v istem genu, ne pa na istem mestu) in intergenski supresorji (supresorska mutacija je nastala čisto v drugem genu, ki je vodla v situacijo, ki je popravla prvotno mutacijo).

Question 198

Intragenski suprepresorji.

Answer 198

• Originalna mutacija (substitucija) spremenila protein, da je postal neaktiven – druga mutacija v istem genu prinesla tako spremembo, da je protein spet aktiven
• Še en premik bralnega okvirja, ki izniči predhoden premik (vmes ni smel biti
  STOP ali vstavitev čisto moteče AK).

Question 199

Intergenski suprepresorji.

Answer 199

• Originalna mutacija (substitucija) spremenila protein, da je postal neaktiven – druga mutacija v drugem genu pa je
  prinesla tako spremembo, da je protein spet aktiven ali pa se je pojavil nek drug
  produkt, ki ga je nadomestil
• Preprečila kopičenje toksičnega produkt – primer gal

Question 200

Intra- in intergenski suprepresorji.

Answer 200

Gal geni so potrebni za pretvorbo gal v glu.

Galaktozno operon ima vse gene, ki galaktozo pretvarja v glukozo. Problematično je, če se zgodi mutacija v GalE je UDP-galactose toksično. Supresorska mutacija je mutacija GalK in se galaktoza ne spreminja in ni toksičnih produktov.

Question 201

Nonsense suprepresorji.

Answer 201

Nastanek:
Mutacija, ki tRNA spremeni tako, da
antikodon prebere STOP kodon.

Question 202

Kaj lahko vpliva na mutagenezo?

Answer 202

• fizikalni dejavniki (UV, X, g-žarki):
  UV svetloba deluje tako, da na dve sosednih timinih dela napačne vezave, zelo močne povezave. Polimeraza ima potem težave.
• kemijski dejavniki: analogi baz:
  Na dušik A se veže H in se A namesto s T veže z C.
• kemijski dejavniki: kemijske spojine, ki spremenijo baze:
  Adeninov NH2 se zamenja z O in se veže z C.
• kemijski dejavniki: kemijske spojine, ki spremenijo baze:
  Hidroksilamin: specifično odstrani amino
  skupino s C → tranzicija GC-AT
  MNNG: alkilirajoči dejavnik – doda
  metilno skupino na DNA
• kemijski dejavniki - interkalirajoče spojine:
  Etidijev bromid obarva DNA, ker se usede v dvojno vijačnico in moti polimerazo.

Question 203

Mutageneza.

Answer 203

• mutatorski sevi
• s transpozoni ali insercijska mutageneza
• supresija nesmiselne mutacije
• mestno specifična in vitro mutageneza z oligonukleotidi
• sinteza genov in vitro
• s PCR
• genske fuzije
• genetsko rekombinacijsko inženirstvo
• CRISPR-Cas

9/50 - 58

Question 204

Popravljalni mehanizmi-

Answer 204

1. sistemi, ki neposredno popravljajo poškodbe:
   -fotoreaktivacija (točno to odsopanje prepoznajo in razrešijo)
   -glikozilaze (prepoznavajo točno tisti poškodovan nukleotid, ker ma gor recimo oksi skupino, glikozilaze odsepijo te skupine)
   -odstranitev metilnih skupin…
   -9/59-60
2. mehanizmi, ki posredno popravljajo poškodbe
   -zaznajo poškodbo in izrežejo okolico
   -9/61
3. postreplikacijsko popravljanje
   -nastale, ker se je polimeraza zmotla in sama tega ni prepoznala. Mutacijo zazna sistem MutSLH in zna ugotovit ali je mutacija na novi ali stari verigi, ki se med sabo ločita po metilirane GATC zaporedja na starševski verigi. Vsako GATC zaporedje je metilirano. Sistem odstrani novo vorigo,
   DNA-polimeraza dopolni in ligaza zalepi.
   -9/62
4. Inducirano popravljanje
   -Ko je celica v razmerah, kjer je polno poškodb pride do odziva SOS. Zaradi poškodb so v DNA nastali prelomi, nastanejo enoverižne oblike DNA, na te se veže RecA. LexA je represor na sos
   genih. RecA z ssDNA povzroči, da se LexA dimeri razgradijo. LexA se sprosƟ in se izrazijo sos geni. Ti proteini popravljajo DNA.
   -9/63

Question 205

Kaj je transpozicija?

Answer 205

Transpozicija je prenos dela DNA iz enega mesta na drugo mesto istega genoma.

Element DNA, ki se prenese, označimo kot transpozicijski element.

Vrsta nehomologne rekombinacije (rekombinacija = prekinitev in ponovno spajanje DNA v novih kombinacijah; ni
potrebno obsežne homologije med dvema zaporedjema DNA, ki se bosta rekombinirali).

Z evolucijskega vidika so to ostanki virusov, ki so se ohranili v
gostiteljskih genomih.

Question 206

Nereplikativna in replikativna transpozicija.

Answer 206

Nereplikativna:

Cut and paste.

Donorska DNA + sprejemna DNA -> iz enega mesta se transpozicijski element izreže -> prestavi se na mesto sprejemne DNA.

Če se donorska DNA ne popravi, lahko ostane prekinjena.

Replikativna:

Donorska DNA + sprejemna DNA -> dve kopiji transpozicijskega elementa.

Question 207

Katere tri skupine transpozicijskih elementov poznamo?

Answer 207

1. IS
   Preprosti, ki imajo samo informacijo za transpozicijo. Imajo obrnjene ponovitve, ki jih transpozaza prepozna kot začetek in konec.
2. Tn z IS na koncih
   Dodatni geni - transpozoni.
3. Tn z obrnjenimi ponovitvami na koncu
   Obrnjene ponovitve so daljše kot pri insercijskih zaporedjih.

10/8

Question 208

Neposredne in obrnjene ponovitve v DNA.

Answer 208

Neposredne oz. istosmerne ponovitve:
Kratki zaporedji nukleotidov v
DNA, ki sta si identični ali skoraj
identični in se nahajata na isti
verigi DNA.

Obrnjene ponovitve:
Kratki zaporedji nukleotidov, v
komplementarnih verigah iste
molekule DNA, ki se vsaka v
smeri 5′ → 3′ enako ali skoraj
enako bereta.

10/11

Question 209

Opiši splošne lastnosti transpozicijskih elementov.

Answer 209

Specifičnost tarčnega mesta:
Nekateri TrE se vstavijo v popolnoma naključna tarčna mesta, večina TrE pa ima vsaj malo preference (v nekatera zaporedja se bolj pogosto vključi kot v druga).

Učinek na sosednje gene – t. i. polarni učinki:
Večina TrE s svojo vključitvijo povzroči polarne učinke, če se vključijo v gen z zapisom za policistronsko mRNA

Imunost tarčnega mesta
* Isti tip TrE se ne vključuje v DNA, kjer je vključen že TrE istega tipa
* Imunost lahko sega do preko 100,000 bp, a se ta razdalja za posamezne TrE razlikuje

Question 210

Temlejni koraki v transpoziciji.

Answer 210

Transpozon v donorski DNA -> transpozaza se usede na obrnjene ponovitve in tvori sinapso -> transpozon se izreže -> izbere si tarčno mesto in zareže v mesto (naredi zamaknjen rez) -> ostanejo “luknje” -> RNAP popravi luknje in dosintetizira kar manjka.

Question 211

Insercijska zaporedja.

Answer 211

• Najmanjši bakterijski TrE
• Običajno so dolga le okoli 750 do
  2000 bp
• Kodirajo encim transpozazo
• prvotno so bili v E. coli najdeni štirje
  različni elementi IS: IS1, IS2, IS3 in
  IS4. Večina sevov E. coli K-12 vsebuje
  približno šest kopij IS1, sedem kopij
  IS2 in manj kopij drugih
• čeprav imajo skoraj vse bakterije IS, imajo IS običajno stopnjo specifičnosti za posamezne
  vrste, kjer imajo evolucijsko najbližje bakterije tudi evolucijsko bližnje IS
• do danes je bilo v bakterijah najdenih na tisoče različnih elementov IS

Question 212

Sestavljeni transpozoni.

Answer 212

• dva elementa IS istega tipa tvorita večji transpozicijski element
• nekateri sestavljeni transpozoni, kot je Tn9, imajo končne IS v isti orientaciji, medtem ko jih imajo drugi, vključno s Tn5 in Tn10, v nasprotnih smereh

Question 213

Transpozicija sestavljenega transpozona.

Answer 213

Vsaka IS se lahko prenese neodvisno, če transpozaza deluje na oba konca. Ker pa so vsi konci IS v sestavljenem transpozonu enaki, lahko transpozaza, kodirana v enem od IS, prepozna konce katerega koli IS. Ko takšna ranspozaza deluje na IR na najbolj oddaljenih koncih sestavljenega transpozona, se oba elementa IS preneseta kot enota, pri čemer se geni med njima prenesejo. Ta dva IR se imenujeta “zunanja konca” obeh elementov IS, ker sta najbolj oddaljena drug od drugega.

10/17

Question 214

Sestavljanje plazmidov s IS.

Answer 214

Faktorje R ali plazmide R, ki vsebujejo veliko genov za odpornost, so lahko deloma nastali zaradi IS. Gen, z zapisom za odpornost proti Tet, je obdan z IS3, območje, ki vsebuje 5 drugih genov z zapisi za odpornosti, pa je obdano z elementoma IS1.

Question 215

Nesestavljeni transpozoni.

Answer 215

• dva IR elementa sta na konech – vedno se prenaša kot ena enota
• lahko povzroči tudi preureditve sosednje kromosomske DNA

10/19

Question 216

Mehanizem nereplikativne transpozicije.

Answer 216

Mehanizem prenosa Tn5:

Posamezne kopije transposaze (Tnp) se vežejo na vsak konec transpozona in nato vežejo drug na drugega, tako da se oba konca transpozona združita
(sinapsa).

Tn se izreže iz donorske DNK, da se na koncih elementa oblikujejo lasnice (fosfodiestrske povezave), ki se po hidrolizi razprejo.

Tn se prestavi na novo tarčno mesto, ki ga odpre transpozaza.

Replikacija zaključi podvajanje tarčnega mesta.

10/20

Question 217

Mehanizem replikativne transpozicije.

Answer 217

Mehanizem transpozicije Tn3:

Po cepitvi na 3′ koncih elementa, se element poveže z novim tarčnim mestom – nastane kointegrat.

Manjkajoči nukleotidi se dosintetizirajo.

Kointegrat se z rekombinacijo, ki jo izvede resolvaza TnpR na mestih RES, razreši.

Končni produkt je element Tn3 tako na novem mestu kot na starem mestu.

10/21

Question 218

Faze enostopenjske transpozicije.

Answer 218

1. izrez TrE,
2. prenos TrE,
3. sinteza manjkajočih
   nukleotidov.

10/22

Question 219

Faze dvostopenjske transpozicije.

Answer 219

1. izrez TrE,
2. povezava TrE in
   tarčnega mesta,
3. sinteza manjkajočih
   nukleotidov,
4. kointegrat,
5. razprtje kointegrata.

10/22

Question 220

Tn10

Answer 220

• nereplikativen transpozon
• tetraciklinska rezistenca

Question 221

Tn1721

Answer 221

• replikativen transpozon
• tetraciklinska rezistenca

Question 222

Uravnavanje transpozicije.

Answer 222

Transpozicija mora biti strogo uravnava in se sme zgoditi le redko; v nasprotnem primeru bi celična DNA postala “prepolna” s transpozoni, kar bi imelo številne škodljive učinke.
Pogostost transpozicije se giblje od približno enkrat na vsakih 103 delitev celic do približno enkrat na vsakih 108 celičnih delitev, odvisno od vrste transpozicijskega elementa.

Dva podobna elementa IS50 obdajata gene za odpornost proti antibiotikom. Samo IS50R kodira transpozazo Tnp in inhibitor, ki je N terminalno okrnjena različica samega sebe. Prav tako Dammetilacija IE-elementov IS50 preprečuje, da bi transpozaza rezala te konce in prenesla posamezne elemente IS50.

Question 223

Transpozicija je lahko usklajena s podvojevanjem kromosoma.

Answer 223

Transpozicija po replikaciji DNA olajša popravljanje DNA.
Pri več transpozonih replikacija DNK tako stimulira njihovo transpozicijo.

Replikacijske vilice se približajo transpozonu -> replikacija čez transpozon aktivira transpozicijo -> nereplikativna transpozicija vodi da se DNA veriga prelomi -> popravilo tega preloma začne sestrski kromosom -> nastane transpozon v donorski DNA.

10/26

Question 224

Katere transpozone poznamo?

Answer 224

• DDE (aspartat in glutamat)
• Y2 (dva tirozina)
• Y (tirozin)
• S (fosfoserin)

Odvisni so od aminokislin.

Question 225

Uporaba TrE.

Answer 225

Uporaba transpozicijskih elementov:
1. mutiranje genov;
2. prenašalci regij homologije, restrikcijskih mest, različnih zaporedij;
3. genske fuzije (transkripcijska fuzija, translacijska fuzija).

Question 226

Mutageneza s transpozoni.

Question 227

Kaj je konjugacija?

Answer 227

Je genski prenos ob nesposrednem stiku dveh bakterijskih celic.

Question 228

Faze konjugacije po gramu negativnih bakterij.

Answer 228

1. neposreden stik in zbliževanje
   F+ in F- celice
2. mobilizacija prenosa,
3. prenos enojne linearne molekule
   DNA s 5’ koncem in hkratna sinteza v donorju in recipientu;
4. zaokrožitev in nastanek funkcionalnega plazmida.

Question 229

Prenos DNA - molekularni dogodki.

Answer 229

Relaksaza je encim, ki reže.

Relaksaza se veže na tirozinski konec -> nastane kovalentna vez med relaksazo in 5’ DNA -> z relaksazo vred potuje plazmid v celico -> relaksaza se sprosti -> fosfodiestrska vez

Question 230

Kateri je najbolj preučen konjugativen plazmid?

Answer 230

Plazmid F.

Question 231

Kateri dve skupini produktov genov tra sodelujeta pri konjugaciji?

Answer 231

Skupina Dtr (“DNA transfer and replication”):
sodelujejo pri prenosu DNA in podvajanju; njihovi geni so nameščeni okoli oriT

Skupina Mpf (“mating-pair formation”):
sodelujejo pri vzpostavitvi stika, nastanku in vzdrževanju paritvenega para

Question 232

Regija tra plazmida F.

Answer 232

Za konjugacijo plazmida F je potrebnih ~ 40 genov:
* geni za uravnavanje (traJ, finO, finP),
* geni za sintezo in izgradnjo pilov (traA, traL, traE, traK, traB, traV, traC, trbI, traW, traU, traF, traQ, traG, traH, traX),
* geni za metabolizem DNA (traM, traY, traD, traI),
* geni za stabilizacijo prenosa (traN, traG)
* geni za površinsko izključitev (traS, traT)

Question 233

Princip protismiselne oz. protiprepisne RNA.

Question 234

Uravnavanje konjugacije.

Answer 235

10/53

Question 236

Prenos Hfr.

Answer 236

Enoverižna DNA se prenese -> dvoverižna prenesena DNA in dvoverižna lastna DNA -> homologna rekombinacija.

Question 237

Konjugacija po gramu pozitivnih bakterij.

Answer 237

Konjugativne plazmide so našli tudi pri mnogih po Gramu pozitivnih bakterijah, npr. Bacillus, Enterococcus, Streptococcus, Staphylococcus,
Streptomyces.

Njihov sistem konjugacije (z izjemo Streptomyces) je podoben sistemu konjugacije pri po Gramu negativnih bakterijah (npr. zaporedja oriT obeh
skupin so si zelo sorodna). Glavna razlika je v sistemu Mpf, saj je pri po Gramu pozivitnih bakterijah zaradi
sestave celične stene lahko bolj preprost.

Question 238

Konjugacija bakterije Enterococcus faecalis.

Answer 238

• so medicinsko pomembni
• imajo zanimiv način konjugacije
• uporabljajo posebne majhne
  peptide, ki jih recipientske celice
  sproščajo v okolje, t. i. FEROMONE
• feromoni pritegnejo donorske
  celice, da začnejo s konjugacijo
• feromoni so za posamezne
  plazmide specifični
• ko iskan plazmid prejmejo,
  prenehajo izločati njegov feromon

Question 239

Konjugacija bakterije Enterococcus faecalis.

Answer 239

Ob iznosu lipoproteina se odstranijo signalna zaporedja, zatem iz preostalega dela po proteolizi nastanejo 7-8 AK dolga zaporedja s Cterminalnega dela, ki se izločijo v okolje. V okolje se tako izločijo samo
aktivne oblike, ki delujejo kot feromoni in pritegnejo F+ celico.

Specifičen feromon prikliče specifičen plazmid.

Question 240

Kako se feromon sprosti v okolje?

Answer 240

Signalna peptidaza zazna, da je predolgo in odreže -> feromon se sprosti v okolje.

10/60

Question 241

Neinduciran donor.

Answer 241

• za zaznavo feromonov potrebuje kar nekaj specifičnih proteinov, lociranih na površini celice in v citoplazmi
• geni za te proteine so na konjugativnih plazmidih
• feromon je imenovan po tipu plazmida, ki ga pritegne (pAD1 – feromon je cAD1)

Question 242

Induciran donor.

Answer 242

• cAD1 se veže na TraC na površini celice
• TraC ga prenese na oligopeptidni
  permeazni sistem (Opp), ki ga vnese v
  citoplazmo
• v citoplazmi se veže na TraA in mu tako prepreči represijo transkripcije genov za konjugacijo
• tako nastane TraE, ki aktivira ostale gene tra
• nastane agregacijski protein Asa, ki pokrije površino donorske celice in sproži kontakt z recipientsko celico

Question 243

Konjugacijski par.

Answer 243

Po vzpostavitvi celičnega kontakta med
donorjem in recipientom, nastane
konjugacijska pora, skozi katero se prenese plazmidna DNA kot pri po Gramu negativnih bakterijah

Question 244

Transkonjuganta.

Answer 244

Po vzpostavitvi konjugativnega plazmida v recpientu, ta ne deluje več
kot recipient in ne privlači več plazmidov istega tipa * mehanizmi za to so trije:
1. izrazijo se površinski izključitveni proteini (niso narisani)
2. sintetizira se inhibitor (iAD1), ki se veže na TraC in prepreči ponovno aktivacijo
3. TraB veže neaktiven feromon, ki pripada lastnemu plazmidu in se tako onemogoči izolčanje tega feromona

Question 245

Konjugacija streptomicet.

Answer 245

• tvorba micelija, kjer se celice povezane (po delitvi se celice med sabo ne ločijo)
• za konjugacijo potrebujejo zelo malo genske informacije
• zaradi povezav je frekvenca konjugacije zelo visoka (vse do 100 %)
• konjugacija ima dva koraka: intermicelijski (med dvema micelijema) prenos vezan na produkt gena tra in intramicelijski prenos

Question 246

Kaj se lahko še prenese s konjugacijo?

Answer 246

• drugi nekonjugativni plazmidi, ki se jih lahko mobilizira
• imajo zaporedje oriT in regijo mob

Niso sami po sebi konjugativni.

Question 247

Trije koncepti na konjugaciji temelječih protimikrobnih dejavnikov.

Answer 247

1. v kromosomu donorja je zapis, ki preprečuje pretirano namnožitev
   konjugativnega plazmida -> prenos s konjugacijo -> v recipientu ni zaščitnega proteina, konjugativni plazmid se namnoži do propada celice
2. v kromosomu donorja je zapisan imunski protein, ki varuje pred na konjugativnem plazmidu zapisanim toksinom -> prenos s konjugacijo -> v recipientu ni imunskega proteina, toksin deluje
3. v kromosomu donorja je zapisan
   represor, ki preprečuje sintezo toksina
   -> prenos s konjugacijo -> v recipientu ni represorja, toksin se sintetizira

Question 248

Kateri je najpogostejši konjugativni plazmid v rastlinski biotehnologiji.

Answer 248

Ti plazmid.

1. Plazmid je odstranjen iz bakterije in T-DNA je razrezana.
2. Tuja DNA je razrezana.
3. Tuja DNA je vstavljena v T-DNA plazmida.
4. Plazmid je vstavljen nazaj v bakterijo.
5. Bakterija je uporabljena, da vstavijo T-DNA z tujim genom v rastlinsko celico.
6. Rastlinske celice rastejo v kulturi.
7. Rastlina nastane iz celice. Vse celice lahko tuj gen izrazijo.

Question 249

Konjugativna transpozicija.

Answer 249

Konjugativna transpozicija je intercelularno premikanje TrE s konjugacijo.

Konjugativni transpozoni so elementi DNA bakterij, ki se lahko premikajo intracelularno ali intercelularno.

Question 250

Konjugativni transpozoni ali integrativni konjugativni elementi
(ICE).

Answer 250

• običajno vključeni v kromosom in ne obstajajo v avtonomni obliki kot plazmidi
• pogosto imajo zapise za Tra in se lahko prenesejo v recipientske celice
• najbolj poznan je Tn 916

Question 251

Faze konjugativne transpozicije.

Answer 251

1. izključitev in tvorba intermediata;
2. vključitev ali prenos;
3. podvojitev in vključitev.

Question 252

Tn916.

Answer 252

• konjugativen transpozon
• tetraciklinska rezistenca

Question 253

Tn916 in drugi ICE so promiskuitetni

Answer 253

• Prenašajo se v številne vrste po Gramu pozitivnih bakterij in celo v nekatere po Gramu negativne bakterije.
• Gen za odpornost proti antibiotiku
  tetraciklinu, tetM, so našli tudi v številnih vrstah po Gramu pozitivnih in po Gramu negativnih bakterij.