Isolamento transtirretina recombinante Flashcards
A expressão em E. coli é o sistema apropriado para isolamento de proteínas sempre que é possível obter estas na forma solúvel ou insolúvel?
Solúvel
V ou F. A expressão em E. coli é adquada para proteínas que sofreram modificações pós-traducionais.
Falso
O que é que se utiliza para crescer a E. coli transformada quando se pretende ter a produção de uma grande quantidade de proteína?
Fermentador
O vetor de expressão é normalmente um … no qual deve ser clonado o … do gene eucariota que se pretende expressar.
Plasmídeo, cDNA
Um dos sistemas de expressão mais comuns envolve que promotor nas bactérias? O gene da polimerase é controlado pelo promotor … que é induzível pelo …
T7 RNA polimerase, lac, IPTG
A sobre-expressão da proteína alvo no citoplasma pode conduzir à formação de agregados insolúveis, os …
Corpos de inclusão (inclusion bodies)
A proteína alvo em corpos de inclusão (agregados) é fácil ou difícil de purificar? Porquê?
Fácil, por ser maioritária nestas partículas e por estas serem isoladas por centrifugação
Qual é a técnica laboratorial que visa separar a proteína de interesse das proteínas bacterianas?
Cromatografia
A separação por cromatografia baseia-se na distribiução das substâncias a analisar por duas fases, quais?
Fase estacionária e fase móvel
Na cromatografia, as moléculas com tendência a ficarem na fase estacionária movem-se a uma velocidade maior/menor do que as que têm maior afinidade para a fase móvel.
Menor
A cromatografia que separa as proteínas por forma e tamanho é a…
Filtração em gel
A cromatografia que separa as proteínas por carga é a…
Troca iónica
A cromatografia que separa as proteínas de acordo com o grau de hidrofobicidade é a…
Cromatografia de fase inversa
A cromatografia que separa as proteínas por ligação a metais é a…
Cromatografia de iões metálicos imobilizados
A cromatografia que separa as proteínas através de grupos tiol expostos é a…
Cromatografia covalente
A cromatografia que separa as proteínas através da afinidade a ligandos/inibidores/receptores/anticorpos é a…
Cromatografia de afinidade
V ou F. O trocador iónico tem carga oposta às proteínas que passam pela coluna
Verdadeiro
Em que consiste a cromatografia de troca iónica?
A separação dá-se por competição da ligação entre diferentes iões (proteínas ou iões salinos) com a mesma carga e um meio cromatográfico com carga oposta, o trocador iónico.
Os trocadores aniónicos têm carga…
Positiva
V ou F. Os trocadores catiónicos têm carga positiva
Falso
V ou F. Os trocadores aniónicos atraem cargas negativas
Verdadeiro
V ou F. Na cromatografia de troca iónica o pH não é relevante
Falso
O pH ao qual o numero de cargas positivas é igual ao de cargas negativas numa proteína é designado…
Ponto isoelétrico (PI)
A pH superior ao pI a proteína encontra-se carregada positivamente ou negativamente?
Negativamente
V ou F. A pH inferior ao pI da proteína esta encontra-se com carga +
V
V ou F. A pH inferior ao pI da proteína esta encontra-se com carga negativa
F
V ou F. Quando pH = pI a proteína tem carga positiva
F
Na cromatografia de troca iónica, quando a força iónica do eluente é alta, as proteínas começam a ser deslocadas do trocador iónico por ordem da sua força de ligação, sendo as mais fortemente/fracamente ligadas as primeiras a eluir.
Fracamente
Qual dos tipos de eluição: isocrática, descontínua ou de gradiente permite melhores separações entre os vários componentes de uma amostra. Porquê?
De gradiente devido ao poder crescente da eluição do meio
O que transporta a TTR?
Hormonas da tiroide (tiroxina) e vitamina A
O transporte de vitamina A pela TTR dá-se através da formação de um complexo com a proteína chamado…
RBP (Retinol Binding Protein)
A TTR tem massa molecular de cercade …. Da, sendo constituida por 4 subunidades de cerca de … Da cada. O seu ponto isoelétrico é …
55 000, 14 000, 5.5
A TTR está associada a que doença?
Amiloidose hereditária
O sistema de produção de TTR em E.coli usa o vetor de expressão:
pINTR
A indução da produção de TTR em E.coli é feita pela adição do…
IPTG
A TTR produzida em E.coli é secretada para o espaço periplasmatico sendo recuperada após … das bactérias.
Choque osmótico
Na cromatografia de troca iónica em DEAE-celulose esta é um trocador aniónico ou catiónico?
Aniónico (carga +)
Qual é a função do meio LB?
Meio de cultura rico que suporta o crescimento geral das bactérias E. coli. É utilizado para crescer rapidamente as culturas bacterianas antes de induzir a expressão da proteína recombinante.
Para que serve o meio M9CA?
Este é um meio de cultura definido, suplementado com aminoácidos, que fornece nutrientes essenciais para o crescimento das bactérias e a produção de proteínas recombinantes de maneira controlada.
Porque se adiciona ampicilina?
Selecionar apenas as bactérias transformadas com o plasmídeo que confere resistência à ampicilina.
Porque se faz incubação durante a noite a 37ºC?
Permitir o crescimento da cultura bacteriana até a fase estacionária.
O que é autoclavar?
Esterilização de materiais e soluções utilizando uma autoclave, que é um equipamento que usa vapor de água sob alta pressão e temperatura.
Porque se adiciona o MgSO4, a glucose e CaCl2?
Fornecer nutrientes e íons essenciais para o crescimento bacteriano.
Porque é que se faz novamente a incubação a 37ºC, com agitação, até a densidade óptica (DO) a 600 nm atingir 0.25?
Permitir que as bactérias cresçam até atingirem uma densidade celular adequada para a indução.
Porque se adiciona IPTG?
Induzir a expressão do gene TTR contido no plasmídeo. O IPTG liga-se ao repressor lac, permitindo a transcrição do gene TTR e a produção da proteína recombinante.
No choque osmótico, para que serve a centrifugação inicial?
Recolher as células bacterianas. Sediemento - bactérias. Sobrenadante - meio de cultura (rejeita-se)
Após a centrifugação, pesa-se o sedimento (pellet) e ressuspende-se o mesmo em solução de sacarose, para quê?
Cria um ambiente hiperosmótico que facilita a liberação de proteínas periplasmáticas (plasmólise celular)
Após o choque osmótico faz-se de novo centrifugação, para quê?
Separar as células dos componentes solúveis no periplasma
Na centrifugação APÓS o choque osmótico, ressuspende-se o pellet em Tris, para quê?
Rápida turgescência das células
Após a ressuspensão em Tris, agita-se no gelo durante 10 minutos, para quê?
Homogeneizar e manter as células frias para preservar a integridade das proteínas.
Para que se faz a centrifugação final?
Separar a solução de proteínas do pellet celular
Diz por tópicos os passos da purificação da TTR até ao final choque osmótico:
A. Pré-Cultura:
1- Meio LB (suplmentos nutricionais para crescimento celular)
2-Amp (seleção de bactérias resistentes) e inoculação com cultura bacteriana
3-Incubação
B. Cultura:
1. Meio M9CA (suplemento)
2. MgSO4, CaCl2 (nutrientes essenciais ao crescimento) e inoculação com culura
3. IPTG (indução da expressão da TTR)
4-Incubação
C. Choque osmótico:
1. Centrifugar 2x
2. Suspender pellet em sacarose (criar ambienye hiperosmótico para libertar proteínas do periplamsa) e ad. EDTA (destabilização de membranas e inibe proteases)
3. Centrifugar
4. Ressuspender em Tris (tampão)
5. Agitação gelo
Para que serve o EDTA?
Quelante de iões metálicos que enfraquece a parede celular ligando-se a lipossacáridos.
Para que serve o Tampão inicial: Glicina/acetato?
Este tampão é utilizado para equilibrar a DEAE-celulose e para lavar a coluna de cromatografia. Mantém o pH estável durante o processo de purificação
Porque é que se lê a densidade ótica da solução das proteínas após o choque osmótico /antes da cromatogtrafia?
Determinar a concentração inicial de proteínas na solução
Para que serve o passo: Remover o excesso de tampão da DEAE-celulose e equilibrar a solução contendo transtirretina (após diálise) com a resina por cerca de uma hora em agitação.
Permitir que as proteínas se liguem à DEAE-celulose, facilitando a separação por cromatografia
Qual é o tampão inicial utilizado na cromatografia? Para que serve?
Tampão glicina/acetato. Este tampão é utilizado para equilibrar a DEAE-celulose e para lavar a coluna de cromatografia. Mantém o pH estável durante o processo de purificação.
Na cromatografia, quando se faz a lavagem da DEAE-celulose com tampão inicial e medir periodicamente a OD do eluído até a OD a 280 nm ser bastante baixa (0.0), o que se pretende?
Que todas as proteínas e impurezas fracamente ligadas sejam removidas, mantendo a TTR ligada à resina. OD = 0 significa que já quase nenhuma proteína está a ser eluída
Porque é que a TTR é eluída com um tampão de glicina/acetato (NaCl)?
Utiliza-se um eluente com uma alta força iónica que faz eluir a TTR
V ou F. A DEAE-celulose tem carga positiva
V
Como é que a utilização de um tampão de NaCl faz eluir a TTR da coluna cromatográfica?
Os iões Cl- provenientes do NaCl vão competir com a TTR para se ligarem à DEAE-celulose (carga +) provocando a eluição da mesma
Porque é que após a eluição da TTR da coluna cromatográfica, se faz a sua diálise contra água durante a noite e, em seguida, liofilização?
Remover sais e outras pequenas moléculas através da diálise, e concentrar a proteína por liofilização, obtendo-a em forma seca
Na eletroforese as moléculas são submetidas a 2 forças, quais? Quando se atinge uma velocidade de migração constante?
Força elétrica e força de viscosidade. Quando estas forças tem a mesma intensidade
Na técnica de SDS-PAGE, que meio de suporte se utiliza?
a) acetato de celulose
b) gel de agarose
c) gel de poliacrilamida
c)
Como se define mobilidade eletroforética?
Velocidade por unidade de
campo eléctrico das macromoléculas
Qual a função do SDS na eletroforese SDS-PAGE?
SDS é um detergente aniónico que atribui uma forma cilindrica e carga negativa às proteínas, pelo que a sua separação se dará exclusivamente pela sua massa
Em SDS-PAGE, as proteínas movem-se no gel com uma velocidade que depende essencialmente da sua:
a) carga
b) massa
c) forma
Massa
O gel usado em SDS-PAGE diz-se descontínuo, constituido por duas partes, quais?
Stacking gel - parte mais larga onde se dá o empacotamento das proteínas
Running gel - resolução dos componentes da amostra
Para que é que é necessário determinar a curva de titulação isoelétrica quando se vai realizar uma eletroforese?
Para se saber o pI da proteína
Como se determina a curva de titulação isoelétrica aquando da realização de uma eletroferese?
1- Focagem isoelétrica do gel: anfólitos distribuem-se pelo gel criando um gradiente de pH
2- Aplica-se a amostra a analisar prependicularmente, e faz-se uma eletroforese. A proteína via migrar de acordo com a sua carga em cada ponto.
Em que consiste o Immunoblotting?
Basicamente, a técnica consiste na separação de proteínas, antigénios, por electroforese em gel de poliacrilamida, seguida da transferência electroforética das proteínas do gel para uma membrana de suporte, fazendo assim a réplica das proteínas separadas no gel. A localização do antigénio é determinada usando anticorpos específicos que são
marcados com compostos fluorescentes, radioactivamente ou acoplados a uma enzima
envolvida numa reação com produção de uma substância corada
Qual foi o corante utilizado para corar os geis obtidos em eletroforese?
Comassie Blue
4 amostras são colocadas nos poços de eletroforese quais?
1- Antes do IPTG
2-Depois do IPTG
3-Lisado
4-Pico
Porque é que num poço de eletroforese se adiciona um poço de “Antes do IPTG”?
Esta amostra é colocada antes da adição de IPTG (ativa a expressão da proteína). Serve como controlo para verificar a expressão basal da proteína sem indução - quantidade de TTR antes da indução da expressão.
Na eletroforese, o que significa o poço “Depois do IPTG”?
Verificar o aumento na produção da proteína de interesse após a indução com IPTG (mas antes do choque)
Na eletroforese o que significa o poço “Lisado”?
O lisado é o conteúdo celular que resulta da lise celular após indução com IPTG. Esta amostra contém todas as proteínas solúveis e insolúveis da célula
Na eletroforese o que significa o poço “Pico”?
Obtida da experiência anterior, é a fração de cromatografia que tem a TTR purificada, onde a densidade ótica é maior.
Antes da eletroforese, ferve-se as proteínas, para quê?
Desnaturação (colocá-la na sua estrutura primária)
Antes da eletroforese procede-se a outra centrifugação, para quê?
A centrifugação ajuda a remover quaisquer detritos ou partículas insolúveis que possam interferir na migração das proteínas durante a eletroforese
Porque é que na eletroforese se cora e descora?
Corane - O corante Coomassie liga-se às proteínas, permitindo a visualização das bandas após a eletroforese. Descorar- Remove o excesso de corante, melhorando a visualização das bandas específicas das proteínas
Porque é que na eletroforese se aplica uma amostra com padróes de peso molecular em paralelo aos poços das amostras que queremos analisar?
Os padrões de peso molecular são essenciais para determinar o tamanho das proteínas desconhecidas nas amostras, funcionando como referência
Na eletroforese, adiciona-se 20 microL de tampão de amostra SB que tem na sua constituição Tris HCl, SDS, glicerol e beta-mercaptoetanol. O que faz cada um destes reagentes?
-Tris HCl: controlo de pH
-SDS: desnaturação de proteínas e carga negativa
-glicerol: aumenta a densidade da amostra
-Beta-mercaptoetanol: reduz pontes de dissulfureto
No Immunoblotting recorre-se a um tampão de transferência para quê?
Facilitar a transferência de proteínas do gel para a membrana de nitrocelulose
Na transferência de proteínas no Immunoblotting, para que serve o corante Ponceau?
Corar temporariamente a membrana para verificar a transferência de proteínas
Np immunoblotting, a transferênica de proteínas é feita para uma membrana de…
Nitrocelulose
No immunoblotting para que serve o PBS?
Fornecer um ambiente isotónico para as reações
No immunoblotting para que serve a solução de leite em pó?
Bloquear a membrana de nitrocelulose para impedir que os anticorpos se liguem a esta mas sim às proteínas
Porque é que é necessário fazer a transferência das proteínas do gel de poliacrilamida (eletroforese) para uma membrana de nitrocelulose?
Os anticorpos não se conseguem ligar ás proteínas se elas tiverem no gel
Qual é a composição do tampão de transferência no immunoblotting e para que serve?
-Tris: manter o pH
-Glicina: manter o pH
-Metanol: faz desapegar o detergente SDS das proteínas que estão no gel para facilitar a sua transferênciaNo ta para a membrana
No immunoblotting, ao fazer-se a transferência das proteínas para a membrana de nitrocelulose, submete-se a “sandwich” a corrente elétrcia, para quê?
É esta corrente elétrica que faz mover as proteínas do gel para a membrana de nitro
No immunoblotting qual é o anticorpo primário?
Anti-transtirretina humana produzida em coelho (anti-humano)
No immuno-blotting, após a adição do anticorpo primário, faz-se uma lavagem com… Para quê?
PBS-T, para remover o anticorpo primário não ligado
O PBS-T é composto por dois componentes:
O PBS e Tween-20 (detergene suave para reduzir ligações não específicas)
No immunoblotting qual é o anticorpo secundário?
Anticorpo contra imunoglobulinas de coelho produzido em carneiro (anti-coelho)
Porque é que no immunoblotting, o anticorpo primário é anti-humano produzido em coelho mas o anticorpo secundário tem de ser anti-coelho?
O anticorpo primário tem de ser anti-humano para se poder ligar à TTR. O anticorpo secundário tem de se ligar ao anticorpo primário que é uma proteína de coelho por isso tem de ser anti-coelho
V ou F. No immunoblotting, o anticorpo secundário compete com o anticorpo primário para a ligação à TTR.
Falso, o anticorpo secundário liga-se ao anticorpo primário
No immunoblotting, qual anticorpo, primário ou secundário, é detetado por quimioluminescência?
Secundário
No immunoblotting, em que consiste a técnica de quimioluminescência?
o anticorpo secundário está acoplado a um substrato de uma enzima. Quando esta enzima atua no substrato emite radiação o que permite detetar a proteína de interesse.
Como se destingue o método de Western Blotting e ELISA?
Western Blotting - qualitativo. Mais para detetar a presença de x proteína.
ELISA - quantitativo. Para contabilizar mesmo a proteína de interesse
O método de ELISA assemelha-se ao WesternBlotting. Qual é a enzima e o substrato utilizados?
Peroxidase e peróxido de hidrogénio
Na placa de ELISA para que servem a coluna 1 e 2?
São os controlos. Na primeira linha temos só leite/coating buffer (sem TTR), serve para determinar o nível de background ou ruído do ensaio. Nos poços B a H temos concentração crescente de TTR que serve para fazer a reta de calibração e por comparação da absorvância, quantificar a TTR desconhecida.
No ELISA, para que serve a solução de substrato?
Mistura usada para detectar a atividade enzimática do conjugado anticorpo-peroxidase, produzindo uma mudança de cor (tem peroxido de hidrogénio)
