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Laboratório de Biofísica e Bioquímica > Isolamento transtirretina recombinante > Flashcards

Isolamento transtirretina recombinante Flashcards

1
Q

A expressão em E. coli é o sistema apropriado para isolamento de proteínas sempre que é possível obter estas na forma solúvel ou insolúvel?

A

Solúvel

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2
Q

V ou F. A expressão em E. coli é adquada para proteínas que sofreram modificações pós-traducionais.

A

Falso

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3
Q

O que é que se utiliza para crescer a E. coli transformada quando se pretende ter a produção de uma grande quantidade de proteína?

A

Fermentador

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4
Q

O vetor de expressão é normalmente um … no qual deve ser clonado o … do gene eucariota que se pretende expressar.

A

Plasmídeo, cDNA

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5
Q

Um dos sistemas de expressão mais comuns envolve que promotor nas bactérias? O gene da polimerase é controlado pelo promotor … que é induzível pelo …

A

T7 RNA polimerase, lac, IPTG

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6
Q

A sobre-expressão da proteína alvo no citoplasma pode conduzir à formação de agregados insolúveis, os …

A

Corpos de inclusão (inclusion bodies)

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7
Q

A proteína alvo em corpos de inclusão (agregados) é fácil ou difícil de purificar? Porquê?

A

Fácil, por ser maioritária nestas partículas e por estas serem isoladas por centrifugação

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8
Q

Qual é a técnica laboratorial que visa separar a proteína de interesse das proteínas bacterianas?

A

Cromatografia

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9
Q

A separação por cromatografia baseia-se na distribiução das substâncias a analisar por duas fases, quais?

A

Fase estacionária e fase móvel

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10
Q

Na cromatografia, as moléculas com tendência a ficarem na fase estacionária movem-se a uma velocidade maior/menor do que as que têm maior afinidade para a fase móvel.

A

Menor

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11
Q

A cromatografia que separa as proteínas por forma e tamanho é a…

A

Filtração em gel

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12
Q

A cromatografia que separa as proteínas por carga é a…

A

Troca iónica

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13
Q

A cromatografia que separa as proteínas de acordo com o grau de hidrofobicidade é a…

A

Cromatografia de fase inversa

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14
Q

A cromatografia que separa as proteínas por ligação a metais é a…

A

Cromatografia de iões metálicos imobilizados

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15
Q

A cromatografia que separa as proteínas através de grupos tiol expostos é a…

A

Cromatografia covalente

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16
Q

A cromatografia que separa as proteínas através da afinidade a ligandos/inibidores/receptores/anticorpos é a…

A

Cromatografia de afinidade

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17
Q

V ou F. O trocador iónico tem carga oposta às proteínas que passam pela coluna

A

Verdadeiro

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18
Q

Em que consiste a cromatografia de troca iónica?

A

A separação dá-se por competição da ligação entre diferentes iões (proteínas ou iões salinos) com a mesma carga e um meio cromatográfico com carga oposta, o trocador iónico.

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19
Q

Os trocadores aniónicos têm carga…

A

Positiva

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20
Q

V ou F. Os trocadores catiónicos têm carga positiva

A

Falso

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21
Q

V ou F. Os trocadores aniónicos atraem cargas negativas

A

Verdadeiro

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22
Q

V ou F. Na cromatografia de troca iónica o pH não é relevante

A

Falso

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23
Q

O pH ao qual o numero de cargas positivas é igual ao de cargas negativas numa proteína é designado…

A

Ponto isoelétrico (PI)

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24
Q

A pH superior ao pI a proteína encontra-se carregada positivamente ou negativamente?

A

Negativamente

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25
Q

V ou F. A pH inferior ao pI da proteína esta encontra-se com carga +

A

V

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26
Q

V ou F. A pH inferior ao pI da proteína esta encontra-se com carga negativa

A

F

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27
Q

V ou F. Quando pH = pI a proteína tem carga positiva

A

F

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28
Q

Na cromatografia de troca iónica, quando a força iónica do eluente é alta, as proteínas começam a ser deslocadas do trocador iónico por ordem da sua força de ligação, sendo as mais fortemente/fracamente ligadas as primeiras a eluir.

A

Fracamente

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29
Q

Qual dos tipos de eluição: isocrática, descontínua ou de gradiente permite melhores separações entre os vários componentes de uma amostra. Porquê?

A

De gradiente devido ao poder crescente da eluição do meio

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30
Q

O que transporta a TTR?

A

Hormonas da tiroide (tiroxina) e vitamina A

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31
Q

O transporte de vitamina A pela TTR dá-se através da formação de um complexo com a proteína chamado…

A

RBP (Retinol Binding Protein)

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32
Q

A TTR tem massa molecular de cercade …. Da, sendo constituida por 4 subunidades de cerca de … Da cada. O seu ponto isoelétrico é …

A

55 000, 14 000, 5.5

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33
Q

A TTR está associada a que doença?

A

Amiloidose hereditária

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34
Q

O sistema de produção de TTR em E.coli usa o vetor de expressão:

A

pINTR

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35
Q

A indução da produção de TTR em E.coli é feita pela adição do…

A

IPTG

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36
Q

A TTR produzida em E.coli é secretada para o espaço periplasmatico sendo recuperada após … das bactérias.

A

Choque osmótico

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37
Q

Na cromatografia de troca iónica em DEAE-celulose esta é um trocador aniónico ou catiónico?

A

Aniónico (carga +)

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38
Q

Qual é a função do meio LB?

A

Meio de cultura rico que suporta o crescimento geral das bactérias E. coli. É utilizado para crescer rapidamente as culturas bacterianas antes de induzir a expressão da proteína recombinante.

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39
Q

Para que serve o meio M9CA?

A

Este é um meio de cultura definido, suplementado com aminoácidos, que fornece nutrientes essenciais para o crescimento das bactérias e a produção de proteínas recombinantes de maneira controlada.

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40
Q

Porque se adiciona ampicilina?

A

Selecionar apenas as bactérias transformadas com o plasmídeo que confere resistência à ampicilina.

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41
Q

Porque se faz incubação durante a noite a 37ºC?

A

Permitir o crescimento da cultura bacteriana até a fase estacionária.

42
Q

O que é autoclavar?

A

Esterilização de materiais e soluções utilizando uma autoclave, que é um equipamento que usa vapor de água sob alta pressão e temperatura.

43
Q

Porque se adiciona o MgSO4, a glucose e CaCl2?

A

Fornecer nutrientes e íons essenciais para o crescimento bacteriano.

44
Q

Porque é que se faz novamente a incubação a 37ºC, com agitação, até a densidade óptica (DO) a 600 nm atingir 0.25?

A

Permitir que as bactérias cresçam até atingirem uma densidade celular adequada para a indução.

45
Q

Porque se adiciona IPTG?

A

Induzir a expressão do gene TTR contido no plasmídeo. O IPTG liga-se ao repressor lac, permitindo a transcrição do gene TTR e a produção da proteína recombinante.

46
Q

No choque osmótico, para que serve a centrifugação inicial?

A

Recolher as células bacterianas. Sediemento - bactérias. Sobrenadante - meio de cultura (rejeita-se)

47
Q

Após a centrifugação, pesa-se o sedimento (pellet) e ressuspende-se o mesmo em solução de sacarose, para quê?

A

Cria um ambiente hiperosmótico que facilita a liberação de proteínas periplasmáticas (plasmólise celular)

48
Q

Após o choque osmótico faz-se de novo centrifugação, para quê?

A

Separar as células dos componentes solúveis no periplasma

49
Q

Na centrifugação APÓS o choque osmótico, ressuspende-se o pellet em Tris, para quê?

A

Rápida turgescência das células

50
Q

Após a ressuspensão em Tris, agita-se no gelo durante 10 minutos, para quê?

A

Homogeneizar e manter as células frias para preservar a integridade das proteínas.

51
Q

Para que se faz a centrifugação final?

A

Separar a solução de proteínas do pellet celular

52
Q

Diz por tópicos os passos da purificação da TTR até ao final choque osmótico:

A

A. Pré-Cultura:
1- Meio LB (suplmentos nutricionais para crescimento celular)
2-Amp (seleção de bactérias resistentes) e inoculação com cultura bacteriana
3-Incubação

B. Cultura:
1. Meio M9CA (suplemento)
2. MgSO4, CaCl2 (nutrientes essenciais ao crescimento) e inoculação com culura
3. IPTG (indução da expressão da TTR)
4-Incubação

C. Choque osmótico:
1. Centrifugar 2x
2. Suspender pellet em sacarose (criar ambienye hiperosmótico para libertar proteínas do periplamsa) e ad. EDTA (destabilização de membranas e inibe proteases)
3. Centrifugar
4. Ressuspender em Tris (tampão)
5. Agitação gelo

53
Q

Para que serve o EDTA?

A

Quelante de iões metálicos que enfraquece a parede celular ligando-se a lipossacáridos.

54
Q

Para que serve o Tampão inicial: Glicina/acetato?

A

Este tampão é utilizado para equilibrar a DEAE-celulose e para lavar a coluna de cromatografia. Mantém o pH estável durante o processo de purificação

55
Q

Porque é que se lê a densidade ótica da solução das proteínas após o choque osmótico /antes da cromatogtrafia?

A

Determinar a concentração inicial de proteínas na solução

56
Q

Para que serve o passo: Remover o excesso de tampão da DEAE-celulose e equilibrar a solução contendo transtirretina (após diálise) com a resina por cerca de uma hora em agitação.

A

Permitir que as proteínas se liguem à DEAE-celulose, facilitando a separação por cromatografia

57
Q

Qual é o tampão inicial utilizado na cromatografia? Para que serve?

A

Tampão glicina/acetato. Este tampão é utilizado para equilibrar a DEAE-celulose e para lavar a coluna de cromatografia. Mantém o pH estável durante o processo de purificação.

58
Q

Na cromatografia, quando se faz a lavagem da DEAE-celulose com tampão inicial e medir periodicamente a OD do eluído até a OD a 280 nm ser bastante baixa (0.0), o que se pretende?

A

Que todas as proteínas e impurezas fracamente ligadas sejam removidas, mantendo a TTR ligada à resina. OD = 0 significa que já quase nenhuma proteína está a ser eluída

59
Q

Porque é que a TTR é eluída com um tampão de glicina/acetato (NaCl)?

A

Utiliza-se um eluente com uma alta força iónica que faz eluir a TTR

60
Q

V ou F. A DEAE-celulose tem carga positiva

A

V

61
Q

Como é que a utilização de um tampão de NaCl faz eluir a TTR da coluna cromatográfica?

A

Os iões Cl- provenientes do NaCl vão competir com a TTR para se ligarem à DEAE-celulose (carga +) provocando a eluição da mesma

62
Q

Porque é que após a eluição da TTR da coluna cromatográfica, se faz a sua diálise contra água durante a noite e, em seguida, liofilização?

A

Remover sais e outras pequenas moléculas através da diálise, e concentrar a proteína por liofilização, obtendo-a em forma seca

63
Q

Na eletroforese as moléculas são submetidas a 2 forças, quais? Quando se atinge uma velocidade de migração constante?

A

Força elétrica e força de viscosidade. Quando estas forças tem a mesma intensidade

64
Q

Na técnica de SDS-PAGE, que meio de suporte se utiliza?
a) acetato de celulose
b) gel de agarose
c) gel de poliacrilamida

A

c)

65
Q

Como se define mobilidade eletroforética?

A

Velocidade por unidade de
campo eléctrico das macromoléculas

66
Q

Qual a função do SDS na eletroforese SDS-PAGE?

A

SDS é um detergente aniónico que atribui uma forma cilindrica e carga negativa às proteínas, pelo que a sua separação se dará exclusivamente pela sua massa

67
Q

Em SDS-PAGE, as proteínas movem-se no gel com uma velocidade que depende essencialmente da sua:
a) carga
b) massa
c) forma

A

Massa

68
Q

O gel usado em SDS-PAGE diz-se descontínuo, constituido por duas partes, quais?

A

Stacking gel - parte mais larga onde se dá o empacotamento das proteínas
Running gel - resolução dos componentes da amostra

69
Q

Para que é que é necessário determinar a curva de titulação isoelétrica quando se vai realizar uma eletroforese?

A

Para se saber o pI da proteína

70
Q

Como se determina a curva de titulação isoelétrica aquando da realização de uma eletroferese?

A

1- Focagem isoelétrica do gel: anfólitos distribuem-se pelo gel criando um gradiente de pH
2- Aplica-se a amostra a analisar prependicularmente, e faz-se uma eletroforese. A proteína via migrar de acordo com a sua carga em cada ponto.

71
Q

Em que consiste o Immunoblotting?

A

Basicamente, a técnica consiste na separação de proteínas, antigénios, por electroforese em gel de poliacrilamida, seguida da transferência electroforética das proteínas do gel para uma membrana de suporte, fazendo assim a réplica das proteínas separadas no gel. A localização do antigénio é determinada usando anticorpos específicos que são
marcados com compostos fluorescentes, radioactivamente ou acoplados a uma enzima
envolvida numa reação com produção de uma substância corada

72
Q

Qual foi o corante utilizado para corar os geis obtidos em eletroforese?

A

Comassie Blue

73
Q

4 amostras são colocadas nos poços de eletroforese quais?

A

1- Antes do IPTG
2-Depois do IPTG
3-Lisado
4-Pico

74
Q

Porque é que num poço de eletroforese se adiciona um poço de “Antes do IPTG”?

A

Esta amostra é colocada antes da adição de IPTG (ativa a expressão da proteína). Serve como controlo para verificar a expressão basal da proteína sem indução - quantidade de TTR antes da indução da expressão.

75
Q

Na eletroforese, o que significa o poço “Depois do IPTG”?

A

Verificar o aumento na produção da proteína de interesse após a indução com IPTG (mas antes do choque)

76
Q

Na eletroforese o que significa o poço “Lisado”?

A

O lisado é o conteúdo celular que resulta da lise celular após indução com IPTG. Esta amostra contém todas as proteínas solúveis e insolúveis da célula

77
Q

Na eletroforese o que significa o poço “Pico”?

A

Obtida da experiência anterior, é a fração de cromatografia que tem a TTR purificada, onde a densidade ótica é maior.

78
Q

Antes da eletroforese, ferve-se as proteínas, para quê?

A

Desnaturação (colocá-la na sua estrutura primária)

79
Q

Antes da eletroforese procede-se a outra centrifugação, para quê?

A

A centrifugação ajuda a remover quaisquer detritos ou partículas insolúveis que possam interferir na migração das proteínas durante a eletroforese

80
Q

Porque é que na eletroforese se cora e descora?

A

Corane - O corante Coomassie liga-se às proteínas, permitindo a visualização das bandas após a eletroforese. Descorar- Remove o excesso de corante, melhorando a visualização das bandas específicas das proteínas

81
Q

Porque é que na eletroforese se aplica uma amostra com padróes de peso molecular em paralelo aos poços das amostras que queremos analisar?

A

Os padrões de peso molecular são essenciais para determinar o tamanho das proteínas desconhecidas nas amostras, funcionando como referência

82
Q

Na eletroforese, adiciona-se 20 microL de tampão de amostra SB que tem na sua constituição Tris HCl, SDS, glicerol e beta-mercaptoetanol. O que faz cada um destes reagentes?

A

-Tris HCl: controlo de pH
-SDS: desnaturação de proteínas e carga negativa
-glicerol: aumenta a densidade da amostra
-Beta-mercaptoetanol: reduz pontes de dissulfureto

83
Q

No Immunoblotting recorre-se a um tampão de transferência para quê?

A

Facilitar a transferência de proteínas do gel para a membrana de nitrocelulose

84
Q

Na transferência de proteínas no Immunoblotting, para que serve o corante Ponceau?

A

Corar temporariamente a membrana para verificar a transferência de proteínas

85
Q

Np immunoblotting, a transferênica de proteínas é feita para uma membrana de…

A

Nitrocelulose

86
Q

No immunoblotting para que serve o PBS?

A

Fornecer um ambiente isotónico para as reações

87
Q

No immunoblotting para que serve a solução de leite em pó?

A

Bloquear a membrana de nitrocelulose para impedir que os anticorpos se liguem a esta mas sim às proteínas

88
Q

Porque é que é necessário fazer a transferência das proteínas do gel de poliacrilamida (eletroforese) para uma membrana de nitrocelulose?

A

Os anticorpos não se conseguem ligar ás proteínas se elas tiverem no gel

89
Q

Qual é a composição do tampão de transferência no immunoblotting e para que serve?

A

-Tris: manter o pH
-Glicina: manter o pH
-Metanol: faz desapegar o detergente SDS das proteínas que estão no gel para facilitar a sua transferênciaNo ta para a membrana

90
Q

No immunoblotting, ao fazer-se a transferência das proteínas para a membrana de nitrocelulose, submete-se a “sandwich” a corrente elétrcia, para quê?

A

É esta corrente elétrica que faz mover as proteínas do gel para a membrana de nitro

91
Q

No immunoblotting qual é o anticorpo primário?

A

Anti-transtirretina humana produzida em coelho (anti-humano)

92
Q

No immuno-blotting, após a adição do anticorpo primário, faz-se uma lavagem com… Para quê?

A

PBS-T, para remover o anticorpo primário não ligado

93
Q

O PBS-T é composto por dois componentes:

A

O PBS e Tween-20 (detergene suave para reduzir ligações não específicas)

94
Q

No immunoblotting qual é o anticorpo secundário?

A

Anticorpo contra imunoglobulinas de coelho produzido em carneiro (anti-coelho)

95
Q

Porque é que no immunoblotting, o anticorpo primário é anti-humano produzido em coelho mas o anticorpo secundário tem de ser anti-coelho?

A

O anticorpo primário tem de ser anti-humano para se poder ligar à TTR. O anticorpo secundário tem de se ligar ao anticorpo primário que é uma proteína de coelho por isso tem de ser anti-coelho

96
Q

V ou F. No immunoblotting, o anticorpo secundário compete com o anticorpo primário para a ligação à TTR.

A

Falso, o anticorpo secundário liga-se ao anticorpo primário

97
Q

No immunoblotting, qual anticorpo, primário ou secundário, é detetado por quimioluminescência?

A

Secundário

98
Q

No immunoblotting, em que consiste a técnica de quimioluminescência?

A

o anticorpo secundário está acoplado a um substrato de uma enzima. Quando esta enzima atua no substrato emite radiação o que permite detetar a proteína de interesse.

99
Q

Como se destingue o método de Western Blotting e ELISA?

A

Western Blotting - qualitativo. Mais para detetar a presença de x proteína.
ELISA - quantitativo. Para contabilizar mesmo a proteína de interesse

100
Q

O método de ELISA assemelha-se ao WesternBlotting. Qual é a enzima e o substrato utilizados?

A

Peroxidase e peróxido de hidrogénio

101
Q

Na placa de ELISA para que servem a coluna 1 e 2?

A

São os controlos. Na primeira linha temos só leite/coating buffer (sem TTR), serve para determinar o nível de background ou ruído do ensaio. Nos poços B a H temos concentração crescente de TTR que serve para fazer a reta de calibração e por comparação da absorvância, quantificar a TTR desconhecida.

102
Q

No ELISA, para que serve a solução de substrato?

A

Mistura usada para detectar a atividade enzimática do conjugado anticorpo-peroxidase, produzindo uma mudança de cor (tem peroxido de hidrogénio)

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