Introduction cellules et méthode Flashcards
cellules
unité fondamentale du vivant
exemples de cellule isolée
bactéries, protozoaires
organismes supérieurs
communautés de cellules
types cellulaires
procaryote et eucaryote
procaryote
cellule sans noyaux (1-2 micromètre)
-> organisme rudientaire
eucaryote
cellule complexe avec noyau et des organites (5 - 100 micromètre ou plus)
composition de cellule eucaryote (schéma à faire)
Membrane plasmique, Noyau, Appareil de Golgi, Membrane nucléaire, vésicule, réticulum endoplasmique, mitochondrie (correction schéma dans diapo)
ex organisle unicellulaire
bactéries, archées et plupart des protistes
Orga pluri ou multicellulaire
constitué de plusieurs cellules comme les plantes et animaux
caractéristique membrane plasmique
bicouche lipidique asymétrique + (glycol) proteines
- Glycocalyx
but membrane plasmique
intégrité cellulaire / Homéostasie
cytoplasme
Phase liquide où baigne les organites
• Fraction liquide du cytoplasme sans les organites soit obtenue après centrifugation
position cytoplasme
entre la membrane plasmique et l’enveloppe nucléaire
organites dans le cytosol du cytoplasme
Golgi
• Lysosome
• Mitochondrie
• Réticulum endoplasmique
Composition moléculaire du cytosol
Gel colloïde (4 fois plus visqueux que l’H2O)
Ph =7,0 (pH intracellulaire 7,4)
85% d’H2O
Ions: Na+, K+, Cl-, Mg2+, Ca2+
Gaz: O2, CO2
Molécules: Glucides, lipides, acides aminés, nucléotides, autres métabolites…
Macromolécules: Protéines, polysaccharides, glycoprotéines, acides nucléiques
biomolécules dans la cellule
des protéines
- des acides nucléiques, organisées ou non dans le cadre d’organites.
caractéristique du protéine du cytosol
La concentration protéique du cytosol est très élevée (estimation de 200 mg/mL)
- Les protéines représentent environ 20 à 30% du volume du cytosol
- Nombreuses protéines liées aux membranes (membrane plasmique ou des organites)
organites à double membrane
- Noyau (chromatine, nucléole et enveloppe nucléaire double)
- Mitochondrie (membrane externe perméable, membrane interne(crête),
matrice contenant ADNmt - Chloroplaste: ADN, chlorophylle
système endomembranaire
Ensemble des cavités cytoplasmiques limitées par des membranes inter-communicantes entre elles
ex de système endomembranaire
Réticulum endoplasmique (RE), appareil de golgi, lysosomes, endosome, peroxysome
def RE
réseau de cavités en continuité avec membrane nucléaire
types de RE
RE rugueux + ribosomes
RE lisse sans ribosome
def Appareil de golgi
empilement de saccules aplatis
def lysosomes
vésicules de digestion (enzyme)
def endosome
réseau de vésicules à pH acide
def peroxysome
vésicules riches en enzyme
disfonctionnement cellulaire =
pathologie
Nombres à connaitre pour les méthodes d’étude
- atome = 0,2 nm = 2 Ångström(s) = 2 Å
- ribosome = 20 nm
- bactérie = mitochondrie = 2 µm
- cellule = 20 µm
Conditions de qualité d’une analyse morphologique
- qualité de l’échantillon
- qualité du microscope.
1 m = (en mm, micro, nm)
10e3 mm
10e6 micromètre
10e9 nm
qualité du microscope
capacité de résolution du microscope
caractéristique cellule
minuscules
- incolores
- transparentes
autre nom microscopie optique
microscopie photonique
caractéristique optique
La plus ancienne utilisée.
Le plus de variantes.
type de microscopie optique
microcopie :
en lumière directe
en constraste de phasae
à fluorescence
principe microscopie en lumière directe
en absorbant certaines longueurs d’onde de la lumière.
principe microscopie en contraste de phase
en provoquant un déphasage des différents rayons lumineux.
principe microscopie à fluorescence
en émettant de la lumière à une autre longueur d’onde que celle d’origine.
But microscopie optique
elle va nous permettre d’observer des détails espacés de 0,2 µm et de structures plus petites que sa
longueur d’onde.
• Sa limite de résolution est définie par la longueur d’onde de la lumière visible qui varie de 0,4
µm(violet) à 0,7µm (rouge vif)
Première limite à l’observation en microscopie photonique
la limite de résolution de l’œil
conséquence d’observation d’objet trop petit en microscopie optique
plus de details
causes des effets de diffraction en microscopie optique
les photons ne suivent pas un trajet
strictement rectiligne
- ils traversent donc l’objet observé
selon des parcours légèrement différents,
interférant les uns avec
les autres
résolution petite =
image detaillé
résolution grande =
Qualité d’image “pas bonne” (content Étienne ?)
caractéristique microscopie optique en lumière directe
le plus simple.
• Utilisation de colorants (Naturels ou permettant le marquage)
principe de la microscopie optique en lumière directe (MOELD)
La lumière blanche émise par une lampe est concentrée sur la préparation et la traverse.
Selon l’intensité de la coloration, la lumière sera plus ou moins
absorbée et l’endroit apparaitra plus ou moins sombre, les zones peu marquées restant relativement claires.
principe coloration pour MOELD
La coloration est due soit à un colorant qui se fixe de façon préférentielle à une molécule particulière
ou une famille de molécules, soit à un précipité sombre
origine précipé coloration du MOELD
du à l’action d’une enzyme et se produit à l’endroit ou celle-ci se trouve, ce qui permet
d’observer la répartition de l’enzyme dans la structure biologique.
principe du microscope optique à contraste de phase (MOCDP)
basé sur le fait que les structures biologiques sont transparentes, mais qu’elles ont un
indice de réfraction différent.
Les rayons lumineux vont donc subir des déviations en passant d’un milieu à un autre, cela se traduit par
un déphasage entre les rayons.
caractéristique MOCDP
basé sur le fait que les structures biologiques sont transparentes, mais qu’elles ont un
indice de réfraction différent.
but MOCDP
observation des cellules vivantes. (important en culture cellulaire)
impact suppression des rayons lumineux en fonction du déphasage en MOCDP
permet d’obtenir une image en
niveau de gris qui visualise tous les changements de milieu à l’intérieur de l’objet observé
étape microscopie optique (sauf MOCDP)
fixation
inclusion
coupe
coloration
produits de fixation en optique
formol, formaldéhyde: pontage des protéines
alcool: fixation des glucides
Bouin: formaldéhyde + acide picrique + acide acétique
supports d’inclusion pur l’optique
paraffine,
résines, acrylique et époxy,
celloïdine
(congélation possible)
épaisseur de coupe selon l’inclusion en optiqque
5 µm dans paraffine,
≤ 1 µm ‘’semi fines’’ dans résine.
appareil pour coupe en optique
microtone
type de coloration
“Naturels” (Hematoxyline, éosine…)
Synthétique (Giemsa)
Bichromes (deux colorant en même temps)
Trichrome (deux colorants en même temps)
principe microscopie à fluorescence
La lumière émise par une source de lumière blanche est filtrée pour isoler la longueur d’onde qui va exciter
la préparation puis focalisée sur la zone d’observation par l’objectif..
caractéristiques MF
- Utilise la capacité de molécules à émettre de la lumière quand on les éclaire avec une longueur d’onde supérieur
- L’image obtenue est inverse de celle obtenue en lumière directe
- les objets observés se détachent en lumineux sur le fond sombre, le contraste final étant alors beaucoup plus élevé.
- il est possible d’utiliser plusieurs marquages simultanément qui seront excités et émettront avec des longueurs d’onde différentes. (faut faire plusieur photo et les racommodé pour voir mouv des cellules ou position particulier)
def microscopie confocale
microscopie optique réalisée sur une très faible profondeur de champ (environ 400 nm)
principe confocale
En positionnant le plan focal de l’objectif à différents niveaux de profondeur dans l’échantillon de réaliser des séries d’images à partir desquelles on peut obtenir une représentation tridimensionnelle de l’objet.
but confocal
reconstruction de l’objet par ordinateur permet de faire une construction 3D.
le microscope confocal fonctionne en
lumière réfléchie ou en fluorscence
source de lumière confocal
laser -> microscope confocal à balayage
en quel sciences est utilisé confocal
en biologie ainsi qu’en sciences des
matériaux.
Principe MET
Utilise un faisceau de particules d’électrons pour illuminer un échantillon et en créer une image très agrandie.
résolution MET
Grande résolution (jusqu’à x 5 millions de fois et microscopes optiques limités x 2000 fois).
caractéristique MET
S’explique la longueur d’onde d’un électron beaucoup plus petite que celle d’un photon de lumière
visible.
◦ Des lentilles électrostatiques et électromagnétiques pour former l’image en contrôlant le faisceau
d’électrons et le faire converger sur un plan particulier par rapport à l’échantillon
étapes MET
fixation
inclusion
coupe
cryofixation
fixation MET
glutaraldéhyde: pontage des protéines
tétroxyde d’osmium: fixation (et coloration) des lipides
Inclusion MET
résines époxy: Epon, Araldite
coupe MET
≈ 50 nm ‘’ultra fines’’,
couteau verre ou diamant
Cryofixation MET
Congélation brusque (propane liquide, Hélium liquide, hydrogène
liquide en ‘’haute pression’’)
Observation directe ou inclusion-coupe…..
ou sont disposés les échantillons en MET
grille de cuivre (3 mm) recouvert de carbone et/ou d’un film plastique
autre type de MET
Ombrage
Immunomarquage
tomographie
cryomicroscopie
def ombrage
faire un moule pour observer
def immunomarquage
utilise anticorps associés à des particules d’or, avant fixation.
principe tomographie
technique qui consiste à reconstruire le volume d’un objet à partir d’une série de mesures déportées à l’extérieur de l’objet. Ces mesures peuvent être effectuées à la surface même ou à une certaine distance.
Après une reconstruction informatique, le résultat fournit de nombreuses informations
principe cryomicroscopie
permet de réduire les dommages d’irradiation causés par le faisceau d’électrons. Elle permet également de préserver la morphologie et la structure des échantillons.
avantages/inconvénients cryomicroscopie
- Pas d’utilisation de colorant ou de fixateur chimique: congélation très rapidement des échantillons biologiques sous forme hydratés dans de l’éthane liquide
• Nécessite une reconstruction 3D
principe MEB
technique de microscopie électronique capable de produire des images en haute
résolution de la surface d’un échantillon en utilisant le principe des interactions électrons-matière.
A noter que le MET permet d’observer des coupes !
caractéristique MEB
- Grandissement: de ≈10 à … ≥100 000,
◦ Spécimen fixé ou congelé,
◦ Souvent recouvert d’une pellicule métallique.
