Intra II enzymologie Flashcards
Que pouvez vous dire sur les protease ?
Le clivage peptidique est une des réactions enzymatiques les plus fréquentes chez les protéines.
Les protéases sont parmi les premiers catalyseurs biologiques à être purifiés et caractérisés.
• Ces enzymes sont très répandues et ont plusieurs fonctions dont:
• Digestion
• Clivage de précurseurs hormonaux
• Clivage de précurseurs viraux (exemple: VIH, SARS-CoV-2)
• Coagulation du sang
• Dégradation des protéines cellulaires
• Elles jouent un rôle de régulation dans plusieurs processus physiologiques.
C’est quelle réaction que toutes les proteases catalysent et c’est quelle autre réaction que plusieurs proteases catalysent ?
Toutes les protéases catalysent la même réaction (hydrolyse du lien peptidique), mais utilisent divers mécanismes pour y arriver.
Peptide
Composante carboxyle
Composante amine
Plusieurs protéases catalysent aussi l’hydrolyse du lien ester. Cette activité estérase a été très utile à l’élucidation du mécanisme de la
chymotrypsine.
Ester
Acide carboxylique
Alcool
Parler de la classification des proteases
Les proteases sont classes en classes en diverses familles selon leur site actif , leur mécanisme d’action et leur structure tertiaire
Il y’a 5 classes mecanistiques ( ser, thr, cys, Asp, métallo)général et plusieurs familles de protease
C’est quoi site actif et c’est quoi site spécifique ?
Site actif : région de l’enzyme contenant les groupes catalytiques impliqués directement dans la réaction chimique
Site spécifique: défini par les résidus de l’enzyme qui viennent en contact avec le substrat et forment la région où le substrat lie l’enzyme
C’est quoi un sous site ?
Le site de liaison d’un substrat polypeptidique est divisé en une série de sous site. Un sous site est défini comme une region de l’enzyme qui interagit avec un acide aminé du polypeptide
Que peut catalyser la chymotrypsine ?
La chymotripsine peut catalyser l’hydrolyse des liens amide et Ester , en particulier ceux du côté C-terminal des résidus tyrosine , phenylalanine, tryptophan, methionine
Parlé de la présence d’un intermédiaire acyl- enzyme ?
L’activité estérase a été très utile à l’élucidation du mécanisme de la
chymotrypsine.
L’acétate de para-nitrophényle (ou p-nitrophényl acétate; PNPA) est un substrat ester de la chymotrypsine. Le groupe phényle s’apparente aux chaînes latérales des résidus acceptés par l’enzyme.
Lorsque la liaison ester du PNPA est coupée deux produits sont générés: l’ion p-nitrophénolate et l’ion acétate.
A l’état stationnaire, à quoi correspond à la production plus lente des produits libérés ?
À la vitesse limitante de la réaction ( hydrolyse de l’intermédiaire)
Que permet de définir l’extrapolation au temps zéro des courbes de l’état stationnaire ?
La concentration initiale d’enzyme active (dans certains cas )
Extrapolation au temps zéro: environ 0,63 mil de p- nitro phénomène est produit par Mole d’enzyme . Quelles sont les explications possibles que vous pouviez donner à ça ? ( indice , il n’y a que deux explications)
Soit la forme active de l’enzyme est pure à 63% ou soit la constante de formation de l’acyl-enzyme est beaucoup plus grande que celle de la déacylatin et donc ne permet pas à l’acyl- enzyme de s’accumuler entièrement
C’est quoi Kcat , c’est quoi Km et c’est quoi Kcat/KM?
Kcat: vitesse de renouvellement, le nombre de molécule de substrat converti en produit par unité de temps et par site actif , lorsque l’enzyme est saturé par le substrat
Km: constante de michaelis menten
Concentration en substrat où v0=1/2
Vmax
Caractérise l’interaction entre l’enzyme et un substrat donné
Constante de dissociation apparente
Km différents de KD constante de dissociation du complexe ES (KD= K-1/K1)
Km=KD seulement lorsque l’équilibre entre (E+S) et ES est rapide
Kcat/km: constante de spécificité ; indicateur de l’efficacité catalytique d’une enzyme envers un substrat donné
Qu’est ce qu’il faut pour expliquer la cinétique bi-phasique observée lors de l’hydrolyse du PNPA par la chymotrypsine ?
Il faut faire intervenir un intermédiaire supplémentaire (EA) où le substrat forme un lien covalent avec l’enzyme durant la réaction.
Quel est l’avantage du PNPA ?
1) lors de l’hydrolyse de la liaison Ester de PNPA , la formation de l’intermédiaire acyl-enzyme est suivie d’une plus lente libération du produit P2. Un tel profil enzymatique est caractéristique d’un mécanisme à 3 étapes ( 2phases dans le mécanisme de coupure)
2) il est important de comprendre que lors de l’hydrolyse de la liaison amide par la chymotrypsine, un profil différent est observé , la formation de l’intermédiaire est donc l’étape limitante de la réaction
Pouvez vous parler de l’implication de la serine 195 ?
L’enzyme acétylé( enz-CO-CH3) est stable à un PH faible et a pu être isolée . Une analyse d’acides aminés a permis de découvrir que le groupe acétyle est lié à la serine 195
La chymotrypsine contient 27 résidu de serine mais seul un , la serine 195 réagit avec le DFP. De même , les DFP inactive les autres protéines en faisant également une liaison covalente avec la serine active . C’est un inhibiteur irréversible
Quels autres inhibiteurs comme DFP , connaissez vous ?
Gaz sarin ( très dangereux utiliser dans les armes chimiques de destruction massive )
PMSF( pas soluble dans l’eau et aussi toxique )
AEBSF ( plus Soluble dans l’eau et moins toxique que son prédécesseur PMSF )
TPCK( inactive la chymotrypsine)
