Inför Tenta Flashcards
Vilka är de fyra huvudstegen vid bakteriekloning?
- Klyv med restriktionsenzym
- Ligera
- Transformera in i bakterie
- Selektera
Vad är skillnaden på endonukleaser och exonukleaser?
Endonukleaser klyver i DNA-molekylen på mer eller mindre specifika ställen. Exonukleaser tar bort nukleotider från änden av DNA-molekylen
Vilket restriktionsendonukleas anses passa bäst för kloning, och varför?
Typ II, eftersom det är mest specifikt
Vad är en kloningsvektor, och vilka regler finns för att något ska kunna vara en kloningsvektor? (4)
Är en DNA-molekyl som kan användas för att för in främmande DNA i en cell. Regler:
- Måste kunna ta sig in i värdcellen
- Måste kunna replikeras inne i cellen för att producera kopior av sig själv
- Måste inneha polylinker/MCS (Multiple cloning site)
- Måste inneha selektionsmarkörer
Vad är en reportergen, och ge exempel på användningsområden
en DNA-sekvens som kodar för ett protein som enkelt kan påvisas. Exempel:
- Man kan kontrollera hur lyckat ett kloningsförsök är
- Man kan sätta in sekvenser framför reportergenen och undersöka om de fungerar som promotorer och isf hur starka de är
- Man kan undersöka hur effektivt genen translateras eller följa vart genprodukten tar vägen i cellen
Vad kallas restriktionsenzymer som har samma igenkänningssekvens?
Isoschizomerer
Vad innebär staraktivitet?
Vissa restriktionsenzymer blir för aktiva, och klipper på ställen som inte är deras igenkänningssekvens
Vilka tre huvudformer av polymorfismer finns?
- SNP (Single nucleotide polymorphism)
- TRP (Tandem repeat polymorphism)
- Elements
Vad innebär metoden RFLP vid SNP?
Står för restriction fragment length polymorphism, och bygger på att SNP skapar eller eliminerar klyvningsställen. Mha PCR amplifierar man först DNA-delen man är intresserad av, därefter använder man sig av restriktionsenzym som ska/inte ska klyva där möjlig SNP återfinns. Därefter körs provet på southern blot
Hur fungerar alleldiskrimineringsmetoden med qPCR?
Genom att ha prober som matchar området där möjlig SNP återfinns kommer denna antingen kunna eller inte kunna binda in. Man kan dessutom ha olika fluorescerande prober för de olika SNP. Om SNP återfinns på en av allelerna men inte den andra kommer två olika fluorescens emitteras. Använder man sig av multiplex PCR kommer de olika färgade fluorescensen emittera en tredje färg
Vilka olika typer av TRP finns?
Microsatelliter (STRP) och Minisatelliter (VNTR)
Hur kan RFLP användas vid analys av TRP?
Genom att klyva ändarna där TRP återfinns, amplifiera och därefter köra proven på gel där storleken på fragmenten, och därmed antalet kopior, analyseras.
Hur kan RFLP användas vid analys av Elements?
Genom att klyva ändarna där elementet återfinns (om det finns), och amplifiera. Därefter körs provet på gel, där beroende på om insertet (elementet) finns eller inte blir det olika stort. En person kan antingen vara homozygot (+/-) eller heterozygot för elementet
Nämn tre metoder som kan användas för att studera protein-DNA interaktion, med ett känt protein
- EMSA
- Footprinting
- ChIP-Seq
Hur fungerar EMSA?
Bygger på att komplex mellan DNA och proteiner vandrar långsammare än fritt DNA i en nativ PAGE. Man kan därmed undersöka om proteiner binder till en viss sekvens. Man kan även undersöka protein-protein interaktioner när de interagerar med DNA; om ett protein kräver inbindning av ett annat protein t.ex.
Hur fungerar footprinting?
Används när man vill veta var ett specifikt protein binder. Man har två prover med samma amplifierade sekvens. Till proven tillsätts DNAse I (som klyver DNAt) i en lagom mängd, så det bara klyver varje molekyl på ett ställe. Till det ena provröret tillsätts dessutom proteinet av intresse. Genom att sedan köra proverna på gel kan man avgöra var proven har klyvts, och efter jämförelse med det andra provet kan man avgöra var proteinet binder.
Hur fungerar ChIP-seq?
Används när man vill veta var i genomet som ett protein binder. Fungerar genom att provet först fixeras, och därmed alla proteiner som är kopplade till DNA’t. Därefter klyvs DNA’t i mindre bitar, så ett protein/bit återfinns. En antikropp som matchar det eftersökta proteinet sätts till lösningen. Antikroppen har en magnetisk bead, vilket innebär att det kan särskiljas från övrigt innehåll i provet. Efter upprening separeras DNA’t från antikroppen, och kan sekvenseras. Därefter jämförs sekvensen med genomet för att se var sekvensen passar in, och därmed även var proteinet sitter.
Nämn och förklara en metod som kan användas för att studera inbindningen mellan ett okänt protein och DNA
DNA-affinitets kolonn. Två kolonner; ett med specifikt DNA och ett med ospecifikt DNA. Till båda kolonner sätts flera olika proteiner. Proteiner som inte binder tvättas bort. Därefter elueras proteinerna från kolonnen. Proteinerna som fäste på kolonnerna körs på gel. Eftersom man är ute efter ett protein som binder specifikt letar man efter band som återfinns i kolumnen med specifik DNA och inte i kolumnen med ospecifik DNA. De band som uppfyller kraven identifieras mha MS.
Tre metoder för att leta efter ytterligare interaktionspartner
- Affinitetskolonn, med protein som “bete”
- Immunoprecipitering
- BioID
Förklara affinitetskolonn med protein som bete
Protein binder först till kolonnen, och därefter tillsätts flera olika proteiner. Proteiner som inte binder tvättas bort. Därefter elueras proteinerna från kolonnen. De eluerade proteinerna körs därefter på gel
Förklara immunprecipitering
Här vill man se om ett protein och en molekyl (alt. protein) interagerar. Till lösning innehållande det möjliga komplexet sätts antikroppar som binder till ett av proteinerna. Beads som binder till antikropparna tillsätts, och dras mot en magnet, vilket ger en fällning av det proteinet som har bundit till antikroppen. Provet tvättas rent från antikroppar och beads. Därefter tillsätts antikropp som binder till den andra molekylen/proteinet. Därefter Western Blot, vilket påvisar en möjlig inbindning.
Förklara BioID
Baseras på att ett promiskuöst biotin-ligas (BirA) binds till proteinet av intresse. BirA kommer sätta på biotin på de molekyler som interagerar med det kopplade proteinet (det av intresse). Till lösning innehållande protein kopplat till BirA, flera olika proteiner och mycket biotin. Proteinerna låts reagera med varandra, varpå man kan använda streptavidin som binder till biotin för att rena upp provet. Därefter körs de proteiner som band (och därmed finns med i det upprenade provet) i MS
Vilka tre distinkta enzymatiska aktiviteter har Reverse transkriptas?
- RNA-beroende DNA-polymeras som transkriberar cDNA från RNA-templatet
- Hybridberoende exoribonukleas (RNas H), som bryer ner RNAt när DNAt har syntetiserats
- DNA-beroende DNA-polymeras, som syntetiserar en ny DNA-sträng komplementär till den första
Ge exempel på applikationer för genterapi
- Vid genetiska sjukdomar. För att korrigera genetiska defekter. Än så länge begränsat till sjukdomar som orsakas av en enda gen som är defekt eller underuttryckt = monogenic (vanliga försök hittils: Cystisk fibros, Severe combines immunodeficiency/SCID)
- Cancer. Föra in gen som kodar för toxisk produkt eller enzym som omvandlar pro-drug till toxisk produkt. Immunstimulerande behandlingar, eller uttryck av tumörsupressorgener
- Vaccin. Uttrycka antigen från patogen under begränsad tid för att stimulera immunsvar
- Vaskulära sjukdomar. Gener för hormon som stimulerar kärltillväxt efter t.ex. hjärtinfarkt
Vilka typer av genterapi finns?
- Genförstärkande terapi. Tillskott av funktionell gen. Är till nytta om sjukdomen är reversibel och inte har orsakat permanent skada på kroppen
- Geninhiberingsterapi. Introducerar en gen var produkt inhiberar uttrycket av en annan gen, eller påverkar aktiviteten av en annan genprodukt
- Inducerad celldöd. Genom tillsättning av antingen självmordsgener (direkt celldöd) eller markörgen/pro-drugs (indirekt inducerad celldöd)
- Normalisering av skadad gen. Defekt gen blir utbytt av funktionell gen
Vad innebär in vivo genterapi, och vilka är för- och nackdelarna
Genetiskt material förs in i patientens celler med hjälp av vektorer.
Mindre invasiv, tekniskt mer komplex, ingen möjlighet att kontrollera, mindre målspecifik, högre risk för immunrespons
Vad innebär ex vivo/in vitro genterapi, och vilka är för- och nackdelarna?
Patientens celler tas ut och genetiskt material förs in i cellen (med hjälp av vektor). Därefter förs cellerna tillbaka in i patienten.
Mer invasiv, tekniskt mindre komplex, möjlighet att kontrollera, mer målspecifik, lägre risk för immunrespons
Exempel på virala vektorer
h
Vad behöver man tänka på när man väljer vektor?
Vad är målet med behandlingen? Effektivt föra in genetiskt material och ge hög expression, vilka är målcellerna? Vill man ha stabil eller transient expression? Storleksbegränsning på insert
Hur fungerar virala vektorer? För- och nackdelar
Hela eller delar av virusets genom är ersatt med terapeutiska gener. Är ofta inte replikationskompetenta. \+ Effektiv transfer och högt uttryck \+ Långtidsuttryck - Risk för toxicitet och inflammation - Dyrt att producera
Hur fungerar icke-virala vektorer? För- och nackdelar
Terapeutiska gener bärs vanligen i en plasmid. Kräver fysikaliska eller kemiska metoder för att föra in det genetiska materialet i celler
+ Få biverkningar
+ Transfer av stora gener
- Låg in vivo transfer
Risker med genterapi (5)
- Oönskade hälsoeffekter
- Genen integreras på fel plats
- Viruset återaktiveras
- Viruset triggar en immunorespons
- Återupprepade behandlingar ökar risken för allvarliga tillbud
Varför utförs genetisk forskning? (5)
- Säkrare diagnos och prognos
- Bättre patientstratifiering
- Nya behandlingar utifrån fysiologiska mekanismerna bakom sjukdomen, eller mot specifika mutationer
- Kunskap för att identifiera personer med risk för att utveckla sjukdom och därmed undvika utlösande faktorer
- Kan bidra till att förstå vilken roll miljöfaktorer har för att utveckla en viss sjukdom
Vad står TAD för, och vad är det?
Topologically associating domains. Område som separeras med insulatorprotein, och ser till att enbart rätt gen transkriberas. Kan muteras (kopplas bort) vilket innebär att en gen i “nästa TAD” som egentligen borde vara tyst också transkriberas.
Vilka 6 monogena nedärvningsmönster finns?
- Autosomal dominant
- Autosomal recessiv
- Y-bunden
- X-bunden dominant
- X-bunden recessiv
- Mitokondriell
Krav för genetiska markörer (3)
- Markörer måste vara jämnt utspridda över genomet, och man måste känna till deras position.
- De måste vara polymorfa, dvs. finnas i flera olika varianter
- De olika varianterna måste vara relativt vanliga inom en population
Vilka 3 sekvenseringar kan göras med NGS?
Targeted sequencing, Whole-exome sequencing och Whole-genome sequencing
Vad innebär monogen sjukdom?
En enda gen ligger bakom sjukdomen (=mendelsk sjukdom)
Vad innebär polygen sjukdom?
Flera olika gener bidrar tillsammans till fenotyp eller sjukdom
Vad innebär multifaktoriell sjukdom?
En kombination av varianter i flera gener och miljöfaktorer bidrar till uppkomst av sjukdom.
