GST PULL DOWN

Question 1

quel est le but du GST PULL DOWN

Answer 1

démontrer une interaction entre 2 protéines X et Y

Question 2

Procédé du gst pull down

Answer 2

1) on produit et on purifie une protéine recombinante Y fusionné avec de la GST –> Y-GST
2) on couple Y-GST à une bille d’agarose glutahion
(on a donc agarose-glutathion-GST-Y)
3) incubation dans milieu biologique (plasma, lysat cellulaire)
4) séparation des protéines liées et non liées au complexe par centrifugation
5) élimination du surnageant car billes lourdes
6) mise sur gel SGS-PAGE + bleu de coomasie pour faire apparaitre les bandes
7) WB avec ajout d’un AC anti protéine X

Question 3

Résultats du gst pull d

Answer 3

Si une bande alors interaction entre X et Y

Si absence de bande alors pas d’interaction

Question 4

GST DEF

Answer 4

glutathione Sulfo Transférase

Question 5

AVANTAGES/INCONVENIENTS du gst pull down

Answer 5

• simple et rapide
• souvent de faux positif ie que l’interaction ne se fait pas comme il faut et que l’on n’obtient pas agarose glucathion GST Y X

–> il faut donc faire si possible cette expérience in vivo

Question 6

RBD et PBD pulldown?

Answer 6

• RBD quand on ajoute du Rho Binding Domain –> effecteur de RhoA (famille de prot G mono) = meilleure activation
• PBD: quand on ajoute l’effecteur de cdc42 et Rac1 (les autres familles de prot G)