Grüne Gentechnik Flashcards
Bedeutung von Pflanzen für den Menschen (Übersicht)
Nahrung
Futterpflanzen
Gewürze/Süßsstoffe
Geliermittel
Genussmittel
Medikamente
Drogen
Technische Produkte (Düfte, Fasern, Gerbstoffe, Farbstoffe, Holz)
Fossile Brennstoffe
Biokraftstoffe
Kautschuk
Wachse
Lacke, Öle, Harze
Kork
Dekoration
Methoden der klassischen Züchtung
Auslesezüchtung
Kombinationszüchtung /Kreuzungszüchtung
Hybridzüchtung (-> Heterosiseffekt)
Einkreuzen einzelner Eigenschaften (Bsp. Zwergwüchsigkeit)
Protoplastenfusion (über Artgrenzen hinweg)
Vegetative Vermehrung über Gewebekulturen
Wann ist eine Pflanze transgen?
Immer dann, wenn Transformation stattgefunden hat -> wenn DNA von außen herangetragen wird
Übersicht: Methoden der Erzeugung transgender Pflanzen
Direkte Transformation
Protoplastentransformation
Elektroporation
Biolistische Trafo
Transformation mit Agrobacterium tumefaciens:
Protoplastentransformation
- Präparation von Protoplasten
- Zugabe von DNA, Polyethylenglykol (PEG), zweiwertigen Ionen -> Destabilisierung der Plasmamembran
Nachteil
Regeneration von Pflanzen aus Protoplasten ist sehr umständlich & zeitaufwendig
Elektroporation
- Protoplasten, normale Zellen, Gewebe, Embryokulturen, Kalluskukturen, …
- Anlegen eines kurzen Strompulses mit hoher Spannung (ca 2000 Volt) -> Poren in der Membran
- erfolgreich angewandt für alle wichtigen Getreide
Was ist der Heterosis Effekt?
Besondere Leistungsfähigkeit von Hybriden gegenüber reinerbigen Eltern
Kombinations-/Kreuzungszüchtung
Ziel: Erhöhung der genetischen Variabilität
Einbringen von Variabilität durch Kreuzung
- zufällige Verteilung der elterlichen Chromosomen in Meiose I
- diploide homozygote Elterngeneration -> Gameten -> uniforme heterozygote F1 Generation -> 4 Gameten (große genetische Vielfalt)
Crossing over
Austausch von Stücken zwischen homologen Chromatiden während der Prophase I
-> erhöht Diversität
Hybridzüchtung
Kombination dominanter „positiv wirkender“ Allele
- aber: Vermehrung der Hybridpflanzen führt zu Auskreuzen der positiven Eigenschaften (wegen Heterozygotie) -> Saatgut muss jedes Mal neu gekauft werden
- Mais wird fast ausschließlich als Hybrid-Mais verkauft, um Heterosis Effekt auszunutzen
Worauf muss bei Hybridzüchtung besonders geachtet werden?
Effektive Verhinderung von Selbstbefruchtung notwendig
- z.B. durch manuelle Emaskualtion (Entfernung der Staubblätter, die Pollen enthalten)
- Einsatz von männlich sterilen Linien (CM/S-Linien: cytoplasmatisch männliche Sterilität)
Einkreuzen von Zwergwüchsigkeit
Vorteil Zwergwüchisger Pflanzen:
- fallen nicht so leicht um
- Pflanze verbraucht weniger Ressourcen für die Produktion von „Stroh“
-> besserer Ernteindex
Gibberellinsäure = Wichtiges Phytohormon, bewirkt Sprosslängenwachstum
Einkreuzen Einzelner Eigenschaften
A Elitelinie (hoher Ertrag) X B Donorlinie (Zwergwüchsig)
1. Kreuzen und anschließend selbsten der F1 Generation -> homozygotes Gen für Zwergwüchsigkeit
2. wiederholtes Rückkreuzen mit Elitelinie und Selbsten
-> Auskreuzen der anderen Donorgene
Es werden immer Chromosomenabschnitte eingekreuzt, keine einzelnen Gene!!!
Mutationszüchtung
Erhöhung der natürlichen Mutationsrate durch z.B.:
- Röntgenstrahlung
- UV-Strahlung
- Gamma-Strahlung
- Chemikalien
Bsp.: mittlerweile über 30000 Sorten (v.A. Getreide)
- Farbe (Grapefruit)
- Zwergwuchs (Reis Calrose 76)
-Gerste golden promise
- Resistenz (japanische Birne gegen Pilzkrankheit)
Kreuzung über Artgrenzen hinweg
In seltenen Fällen möglich - bei nah verwandten Arten
Bsp. Triticale: Kreuzung aus Triticum (Weizen) und Secale (Roggen) AABB X RR
Genome anders zusammengesetzt (Tetralogie, diploid)
1. Transplantation des noch lebenden Embryos auf Nährmedium -> Entwicklung steriler haploider Pflanzen
2. Behandlung mit Colchizin
- Gift der Herbstzeitlosen
- bindet an Tubuli—Monomeren -> Mikrotubuli können nicht bilden
Verdopplung der Chromosomenzahl ohne Zellteilung
-> fertiles. Hexaploides Triticale kann entstehen AABBRR
Kreuzung über Artgrenzen hinweg -> Erzeugung von Protoplasten
-> Erzeugung von Protoplasten
Nur Fusion verschiedener Zellen, statt ganzer Pflanzen
1. Pflanzliches Gewebe mit Pektinase behandeln (löst Mittellamele auf, isoliert)
2. einzelne Zellen mit Zellwand mit Cellulase behandeln (löst Zellwand auf, zellwandfrei)
3. Protoplasten = isolierte, zellwandlose Pflanzenzellen, die in iso-osmotischer Lösung gehalten werden
Kreuzung über Artgrenzen hinweg -> Protoplastenfusion
- Mischung von Protoplasten aus Mesophyllzellen und Kalluszellen (undef. Gewebe)
- Anlagerung der Zellen durch Zugabe von Polyethylenglykol (oder elektrischer Spannung)
- Verschmelzung der Protoplasten zu 1 Zelle mit Erbgut aus beiden Ursprungszellen
Protoplastentransformation
Präparation von Protoplasten
Zugabe von DNA, Polyethylenglykol und zweiwertigen Ionen -> Destabilisierung der Plasmamembran
Nachteil: Regeneration von Pflanzen aus Protoplasten ist sehr umständlich und zeitaufwändig
Elektroporation
Protoplasten. Normale Zellen, Gewebe, Embryokulturen, Kalluskulturen
Anlegen eines kurzen Strompulses mit hoher Spannung (ca 2000 Volt) -> Poren in der Membran
Erfolgreich angewandt für alle wichtigen Getreide
Biolistische Transformation
- Hauptsächlich verwendete und effektivste Methode des direkten Gentransfer -> Mehrzahl der kommerziell verwendeten genetischen Nutzpflanzen
- DNA-beladene Gold- oder Wolframpartikel werden mit hoher Geschwindigkeit auf Pflanzenzellen geschossen
- Zellen, Gewebe, Kalluskulturen, ganze Pflanze
- transients (vorübergehende) Trafo möglich
- Trafo von Organellen möglich
- Nachteil: transformierte Zellen werden beschädigt
Transformation von Organellen
- was geht (nicht)
- Vorteile
Schwierigkeiten
- Plastidentransformation durch Biolistik möglich (chloroplasten, Leukoplasten, …)
- Trafo von Mitochondrien in Pflanzen bisher nicht möglich
Vorteile transgender Plastide:
- Zielgerichteter DNA Einbau durch homologe ReKombination
- Hohe Kopienzahl des
- Keine Gene-silencing Effekte, wie sie im Kerngenom vorkommen können
- Mehrere Gene als 1 Operon mit nur einem Promotor hintereinander schalten
- in der Regel enthalten Pollen keine Plastiden -> keine Auskreuzung des Transgens
Schwierigkeiten
Erlangung der Homoplasie (alle Plastide mit gleicher, transformierter DNA)
Bestandteile Plasmide
- ori: Replikationsursprung zur Vermehrung in E.coli
- Resistenz Gen mit bakteriellem Promotor zur Selektion in E.coli (Ampicillin)
- Markergenmit pflanzlichem Promotor u Terminator zur Selektion transformierter Pflanzen (Kanamycinresistenz) -> muss in der Pflanze exprimiert werden
Plasmide zur direkten Transformation.
Gene of interest (zu transformierendes Gen) + pflanzlicher Promotor &Terminator
Wichtig:
- Pflanze. Vermehr keine Plasmide (nur Bakterien) -> bei transgener Pflanze hat immer Einbau des Plasmids als lineare DNA in Genom stattgefunden
- Auch lineare DNA kann zur Trafo genutzt werden
Warum funktioniert Transformation mit Agrobacterium tumefaciens?
Pflanzenpathogen -> bewirkt Wurzelhalstumore
Pathogenität abhängig von Tumorinduzierendem Plasmid (Ti-Plasmid)
Transfer DNA (T-DNA) auf Ti-Plasmid wird in Pflanzenzellen übertragen und in Genom integriert => natürlicher Geningenieur
Aufbau eines Ti-Plasmids
T-DNA: Gene tragen eukaryotische Promotoren und Terminatoren, um in der Pflanze aktiv sein zu können
vir-Region (ausgeschaltet, wenn nicht in Pflanze): Gene für Übertragung der T-DNA
Opinkatabolismus: Abbau und Verwendung der aufgenommenen Opine
ori
Transfergen für Konjugation zwischen Agrobakterien
Biotechnologische Wirkweise der Trafo mit A.tumefaciens
Gensequenzen LB, LR = notwendig und hinreichend für Erkennung der T-DNA
- zwischen Grenzen kann beliebige DNA eingebracht werden
- Ti-Plasmide ohne Hirmonbiosynthese-Gene = entwaffneter Ti-
Gene des Ti-Plasmids können auf verschiedene Vektoren verteilt werden = binäre Vektorsysteme
Binäre Vektorsysteme
großes Plasmid = Helferplasmid mit vir-Genen aber ohne T-DNA verbleibt in A.tumefaciens -> Stamm, verbleibt dann unverändert
kleines Plasmid (5-14kBp): mit T-DNA und Elementen zur einfachen Handhabung
z.B. mit:
- Resistenzgene für Selektion in Bakterien und Pflanzen
- ori für Vermehrung in E.coli u A.tumefaciens
-> Klonierung und Vermehrung des Plasmids in E.coli
-> dann Transformieren von Agrobakterien mit dem Plasmid
Transformation von Pflanzen mit Agrobacterium - Bsp. Tabak
Typische Situation: Regeneration ganzer Pflanzen über Kallus-Stadium
- Inkubation von Blattstücken in Agrobakteriensuspension (30 min.)
- auslegen der Blattstücke auf Medium (2 Tage)
- umlegen der Blattstücke auf Medium mit Antibiotika I Phytohormone
-> abtöten der Agrobakterien
-> Selektion transformierter Pflanzenteile (Kanamycin)
-> Bildung von Kalli, aus denen Sprosse entstehen
- abschneiden der Sprosse und umsetzen auf neues Medium
- Sprosse bewurzeln sich => Transgene Pflanze
- Tabak kann vegetativ vermehrt werden