Grundlagen Flashcards
Plasmid
ringförmiges DNA-Molekül
Wie nennt man die Enden eines DNA-Strangs und wodurch sind sie charaktierisiert?
5’ (Phosphat)
3’ (OH)
Wie wurden Restriktionsendonukleasen entdeckt?
als DNA-restringierende Systeme bei der Phageninfektion von Bakterien (zur Verteidigung)
Wie erfolgt der Abbau von DNA durch Nuklease?
Spaltung an Zucker-Phosphat-Rückgrad (Phosphodiesterbindung)
Was ist die Methylase-Aktivität?
Anhängen einer Methylgruppe
Was macht Restriktionsendonuklease des Typs I aus?
- zugleich Methylase und Nuklease
- benötigen: ATP, Mg2+, S-Adenosylmethionin
- spezifische Bindungsstelle, schneiden aber ca. 1000 BP davon entfernt (undefinierter Abstand)
Was macht Restriktionsendonukleasen des Typs II aus?
- benötigen ATP, Mg2+
- schneidet in definiertem Abstand der nicht-palindromischen Erkennungssequenz
Was macht Restriktionsendonukleasen des Typs III aus?
- oft verwendet
- benötigen Mg2+
- palindromische Erkennungssequenz
- Bindungs- und Schnittstelle identisch
- spezifische Puffer.-Anforderungen
Was unterscheidet blunt und sticky ends?
- sticky: Überhänge müssen kompartibel sein, spezifischer Zusammenbau, thermodynamisch günstiger
- blunt: jedes kann mit jedem zusammengebaut werden, thermodynamisch ungünstiger
Was sind Isoschizomere/Neoschizomere?
Iso..: gleiche Erkennungssequenz, schneiden gleich
Neo..:gleiche Erkennungssequenz, schneiden unterschiedlich
Was sind Methylierungspaare?
Enzyme mit gleicher Erkennungssequenz aber unterschiedlicher Methylierungsabhängigkeit
Unterschied Exo-/Endonukleasen
- Exo: spalten vom Ende einzelne Nukleotide ab
- Endo: spalten beliebig innerhalb der Nukleinsäure (hinterlassen kurze Oligonukleotide)
Wofür verwendet man DNase I footprinting?
- Proteine schützen DNA
- das Stück, das nciht von den Endonukleasen zerschnitten wurde, kann man sequenzieren (es bleibt heile)
Was machen DNA-Ligasen?
baut Zucker-Phosphat-Rückgrad wieder auf
-> Ligation von DNA-Enden (glatt oder klebrig), Verknüpfung von Bruchstellen
Was machen Phosphatasen?
-hydrolysiert die Phosphatgruppen (reduziert Religationsrate)
Was machen Kinasen?
Übertragen Phosphat von ATP auf 5’-Ende von Nukleotiden
Was machen Transferasen?
hängen Nukleotide an die freie OH-Gruppen an
Eigenschaften von DNA-Polymerase I?
-Holoenzym (kann in beide Richtungen arbeiten und so Fehler korrigieren)
Was sind thermostabile DNA-Polymerasen?
-tolerant gegenüber hohen Temperaturen
Wofür verwendet man RNA-Polymerasen?
-synthetisieren RNA von einem DNA-Template ohne Primer, haben Erkennungssequenzen
Was machen Reverse Transkriptasen?
wandeln RNA wieder in DNA um (benötigen Doppelstrang-Primer)
Template
Substrat der PCR-Reaktion
Primer
kurze Oligonukleotide zur Initiation der Polymerisation
dNTPs
Nukleotidphosphate werden in den neuen Strang eingebaut
Polymerase
Enzym zur Synthese der DOppelstränge
PCR-Denaturierung, T?
Trennung der Doppelstränge bei 95°C
PCR-Annealing, T?
Anlagerung der Primer an den geöffneten Doppelstrang (55°C)
PCR-Elongation, wie schnell, T?
Neusynthese des fehlenden Doppelstrangs (1min/kb), 72 °C
lytischer Zyklus
Entwicklungsphase, in der die Wirtszelle lysiert wird, nachdem neue Virionen gebildet wurden
lysogener Zyklus
DNA wird vorübergehend in Genom des Wirts integriert, Wirtszelle nicht lysiert
Wo bilden sich auf einer, mit Bakterien-Phagen-Schicht ausgefüllter Platte Plaques?
an den Stellen, wo Viren Bakterien angegriffen haben
Was charakterisiert das Genom des Lambda-Phagen?
recht viele, dicht gepackte Gene, regulatorische Gene, die über lysogenen/lytischen Zyklus entscheiden, nicht gebrauchte Region: für Klonierungsvektor
Was charaktierisiert Replacementvektoren?
es können größere Stücke eingebaut werden und in höherer Dichte analysiert werden
Was charakterisiert Insertionsvektoren?
es können nicht so große Stücke eingebaut werden, dafür können viele analysiert werden (für cDNA-Bibliotheken)
Assemblierung des Phagen
Kopf und Schwanz bauen sich selbst zusammen, Cos-Regionen unterstützen DNA-Füllung
in vitro-Verpackung von DNA in Phagen
-Kopf und Schwanz als einzelne temperatursensitiv, zusammengebaut replizierbar
Herstellung einer Phagen DNA Bank-
- DNA-Stück/Gen muss auffindbar und statistisch vorhanden sein
- jedes Phagen-Plaque enthält genau ein anderes Stück DNA
Wie findet man den Phagen in einer DNA-Bank mit der DNA, die man möchte?
- hybridiseren mit Gensonde (Nitrocellulosefilter)
- alkalische Lösung lysiert Phagen und denaturiert DNA -> Autoradiographie: Signal bei DNA, die komplementär zur Probe ist
Was ist cDNA?
-eukaryotische mRNA wird mit OligodTPrimer hybridisiert, dann mit reverser Transkriptase zu cDNA transkribiert, dann mit oligodCPrimer hybridisiert
transient
Fremdgen nur zeitweise in Organismus (nicht vererbt)
stabil
Fremdgen in Genom integriert, dauerhaft exprimiert und vererbt
Was sind Vorraussetzungen für die Transformation durch ein Ti-Plasmid?
selektierbares Markergen, Promotor, codierende DNA, Polyadenylierungssignal
Welche Eigenschaften kann ein Promotor eines Ti-Plasmids haben?
konstitutiv (überall), Gewebe-spezifisch, induzierbar (zeitweise)
Biolistic (transformation)
biological + ballistic
“forward genetics”
Phänotyp->Genotyp (Gen erkennen, das Phänotyp verursacht)
“reverse genetics”
Genotyp->Phänotyp (Gen bekannt, welcher Phänotyp wird ausgelöst?)
Wie werden gewebespezifische Knock-outs hergestellt durch das Cre-Iox-System?
Cre-Recombinase erkennt Loci zwischen Lox-Sequenzen an bestimmten Stellten und schneidet Sequenz heraus (durch Rekombination) -> Gen ist ausgeknockt/Herausschneiden von Stop-Sequenzen
Was sind repeat units?
kurze DNA-Stücke, die sich immer wieder wiederholen
Was sind repeat regions?
angereicherte repetitive DNA, Großteil der DNA, kann auch regulative Funktionen haben
Was für Sequenzen enthalten Chromosomen?
unikale/mittel-/hoch-repetitive Sequenzen, Strukturgene, Gene für rRNA, Transposons, Satelliten-DNA
Wie ist das Grundprinzip der FISH (Floureszenz in situ Hybridisierung)?
Hybridisierung bekannter, markierter (radioaktiv mark. Phosphat/floureszenzmarkierte Nukleotide) DNA-Fragmente mit präparierten Chromosomen
Nenne drei Beispiele zur Anwendung von FISH
Analyse von Chromosomenabberationen (Pränataldiagnostik), Genomvergleiche, Diagnostik
Was ist der Unterschied von Hybridisierungssignal und Painting bei FISH?
Hybridisierungssignal: nur ein Stück markiert
Painting: gesamtes Chromosom markiert (über Chromosom verteilt)
Wofür kann man multicolour FISH verwenden?
physikalische Abstandsmessung auf dem Chromosom
Wofür nimmt man Microarrays?
Erfassung der Genexpression aller Gene (Transkriptom-Analyse), wie schwach/stark ist ein Gen exprimiert?
Was sind Oligonukleotid-Array-Chips?
hochaufgelöster kleiner Chip, der bis zu 200.000 unterschiedliche Genproben abbildet
Wie führt man eine Gen-Chip-Hybridisierung durch?
RNA wird revers transkribiert mit Floureszenzfarbstoff-DNA (Einfrieren des Expressionszustands des Organismus)
Was macht man bei der Genchiphybridisierung, damit weniger Fehler auftreten?
Man versucht, für jedes Gen mehrere Oligos zu machen. Nur wenn alle leuchten, zähle ich das als positiv
Was versteht man unter der Auswertung von coregulierten Genen?
Gengruppen, die sich ähnlich verhalten, sind in Cluster-Analyse zu erkennen (Expressionsverwandtschaft, erst reagieren alle nicht, dann reagieren alle: Gene könnten gemeinsam an einem Prozess wirken)
Was ist der natürliche Ursprung des CRISPR/Cas-Systems? Was ist der Grund-Mechanismus?
- adaptives bakterielles Immunsystem gegen Phagen-DNA
- Mechanismus: Fremd-Nukleinsäuren werden erkannt und abgebaut
Was ermöglicht CRISPR/Cas der Gentechnologie?
Man kann Gene präzise zerstören, Gene austauschen/reparieren, seit kurzer Zeit auch einzelne Basen verändern (CAS9)
-> riesige Toolbox aus Proteinen
Was sind die CAS-Gene?
sind immer neben CRISPR-Lokus, codieren für Protein, das erkannte DNA bearbeitet/zerstört
Wie ist die CRISPR-Sequenz aufgebaut?
spacer: unterschiedlich (Stück Viren-DNA, spezifisch für Pathogen), repeats: immer gleich
Was ist besonders an den Einsatzmöglichkeiten von CRISPR-CAS?
es wird zu keinem Zeitpunkt Fremd-DNA ins Pflanzengenom integriert
Definition Markergen
erlaubt Selektion von gesuchten Ereignissen, in der Regel dominant
Definition Reportergen
nicht dominant selektiv, Genprodukte sind aber leicht durch biochemische, histochemische oder photometrische Methoden nachweisbar
Welche Merkmale können Reporter-/Markergene aufweisen?
selektierbar, quantifizierbar, einfach/preiswert, in lebenden Organismen?, sensitiv/optisch hoch aufgelöst
Was ist das Two-Hybrid-System?
System zum Nachweis von Protein-Protein-Interaktionen in lebenden Hefezellen
Was ist ein One-Hybrid-System?
System zur Identifizierung von unbekannten Proteinen bzw. Untersuchung von Proteinen, die an eine bekannte DNA-Sequenz binden (welches Protein bindet an Promotor?)
Three-Hybrid-System
Untersuchung von Proteinen, die an eine bekannte RNA-Sequenz binden
Was ist ein überbrücktes 2-Hybridsystem?
drei Proteine, zwischen X und Y bindet ein Protein nur als Brücke (daran ist keine Fusionsdomäne)
Welche Eigenschaften können die Aminosäure-Seitenketten haben? Nenne jeweils ein Beispiel.
- Hydrophobe Wechselwirkungen (van der Waals-Kräfte): Glycin, Alanin
- Wasserstoff-Brücken: Tyrosin
- Salzbrücken (Ladung): Lysin (+) und Aspartat (-)
- Floureszenz (aromatische Reste): Pheynalalanin, Tryptophan
- Disulfidbrücken: Cystein
Was ist die Degeneriertheit des genetischen Codes?
Es existieren mehrere Kombinationen für die gleiche Aminosäure (aber verschiedene tRNA’s)
Was ist die Primärstruktur eines Proteins?
lineare Aminosäureabfolge (Polypeptidsequenz)
Was ist die Sekundärstruktur eines Proteins?
alpha-Helix, beta-Faltblatt
Was ist die Tertiärstruktur eines Proteins?
räumliche Anordnung der Sekundärstrukturen (meist Chaperon-vermittelt)
Was ist die Quartärstruktur eines Proteins?
Zusammenlagerung von 2 oder mehr gefalteten Proteinketten (Chaperone) zu Multimeren
In welchen Bereichen kann man rekombinante Proteine anwenden?
Industrie: Waschmittel/Lebensmittel: alpha-Amylase, Diagnostik: Antikörper (Tumordiagnostik), Therapeutische Nutzung (humanes Insulin), Wissenschaftliche Forschung (Strukturanalysen)
Wie läuft die Herstellung rekombinanter Proteine ab?
Amplifikation der DNA-Sequenz, Klonierung in Vektor, Transformation in Zielorganismus, Selektion transgener Individuen, Kultivierung und Induktion der Expression, Extraktion von Gesamt-Protein, Aufreinigung des Proteins
Nenne zwei Vorteile und zwei Nachteile von prokaryontischen Expressionssystemen!
Vorteile: einfache Handhabung, schnelles Wachstum, Nachteile: fremde Proteine akkumulieren häufig in inclusion bodies, falsche Proteinfaltung, keine post-translationalen Modifikationen
Nenne zwei Vor- und zwei Nachteile in eukaryontischen Systemen!
Vorteile: Expression induzierbar, hohe Ausbeuten
Nachteile: komplexere Handhabung, Glykolysierungsmuster abweichend von anderen Systemen
Welche wichtigen Stelllen haben Expressionsvektoren?
Promotor, MCS/Fremdgen, Terminator, Selektionsmarker, Origin of replication
Wie funktioniert die IPTG-Induktion der Proteinexpression?
im nicht induzierten Zustand ist Promotor durch Repressor reprimiert, IPTG deaktiviert Repressor und das Zielprotein wird exprimiert
Was sind in-vitro-Expressionssysteme?
künstliches, zellfreies System mit Proteinbiosynthese-Werkzeugen aus eurkaryontischen Zellen und dem Expressionsvektor, feeding-Kammer und Reaktionskammer, durch semipermeable Membran getrennt, sehr teuer!
Welche Verfahren gibt es zum Zellaufschluss und worauf beruhen sie?
Potter (Kolben in Reagenzglas zerreibt Bakterien), Mixer (schließt auch Bakterien auf), Ultraschall-Bad (Schwingungen), French press (starke Pumpe, sehr kleiner Spalt)
Was ist das Grundverfahren der Herstellung von Protein-Roh-Extrakten?
- in Pufferlösung (Konstanz von pH-Wert und Ionenstärke garantieren) homogenisieren, 2. Zelltrümmer abzentrifugieren und Überstand abnehmen, 3. Proteingehalt bestimmen und Proben lagern
Worauf beruht die Proteinkonzentrations-Bestimmung nach Bradford?
Coomassie Brilliant Blue mit verdünnter Proteinlösung mischen, photometrische Messung (optische Dichte OD) und Konz. anhand einer Protein-Eichgerade bestimmen
Was bedeutet SDS-PAGE?
SDS (Puffer) -PolyAcrylamidGelElektrophorese (von Proteinen), Protein-Trennung nach Ladung
Was ist der Unterschied bei Sammel- und Trenngel?
Sammelgel: größere Poren, mehr Beweglichkeit, Fokussierung der Proteine in scharfer Bande), Trenngel: kleine Poren, saubere Auftrennung
Womit färbt man Protein-Gele? Worauf beruht die Färbung?
Coomassie (brilliant blue) bindet an positiv geladene (basische) Seitenketten, Silbernitrat (genauer), Silberionen binden an negativ geladene (saure) Seitenketten
Was ist das Prinzip der 2D-Gelelektrophorese?
2 Trennmethoden:
- isoelektrische Fokussierung anhand des isoelektrischen Punkts der Proteine im pH-Gradienten (dort ist Ladung 0 und es bewegt sich nicht mehr)
- Trennung im SDS-Gel anhand ihrer Masse
-> Auswertung mit “Spot-Pickern” und Massenspektrometrie
Wie funktioniert die Dialyse nach Salzfällung?
Enfernung überschüssiger Salze und Konzentrierung des Proteins (Nutzung eines geeigneten Dialyse-Schlauchs mit passender Ausschlussgröße)
Wie funktioniert die Fraktionierung durch Größenausschluss-Chromatographie?
kleine Moleküle verfangen sich in Gel-Matrix und eluieren daher später
Wie funktioniert die Affinitätsreinigung (6x His-tag)?
Bindung an komplexiertes Nickel, nach Waschen Eluition mit Imidazol (funktioniert auch unter denaturierten Bedingungen, kann Protein-Konformation beeinflussen)
Wie funktioniert die Affnitätsreinigung mit Strep-trag II?
Proteine mit Strep-tag II binden an Strep-Tactin, werden gewaschen und dann wieder kompetitiv von der Matrix gelöst (Verdrängung mit Desthiobiotin) und eluieren daher relativ rein (Strep-tag kann dann abgespalten werden)
Wie kann man tags nachträglich abspalten?
Enzyme erkennen bestimmte Sequenz (z.B. Enterokinase) und schneiden dahinter das tag ab (Kombination mit Reinigungstags)
Was ist der Western-Blot?
Protein-Transfer von SDS-Gelen auf einen festen Träger (Spannung angelegt, sodass Proteine auf Nitrocellulose-Membran übertragen werden), Nachweis durch Ponceau Rot
Was sind Proteinmarker?
enthalten Protein oder deren Fragmente definierter Größe, teilweise farblich hervorgehoben
Was ist wichtig, wenn man die einzelnen Proteine auf dem Western Blot mit spezifischen Antikörpern nachweisen möchte?
man muss unbesetzte Bindungsstellen der Membran blockieren mit z.B. BSA oder Milchpulver
Wie kann man ein Protein durch Antikörper nachweisen?
Makromoleküle (Antigene) werden von Antikörpern spezifisch gebunden und können so indirekt nachgewiesen werden
Wie werden polyklonale Antikörper gewonnen?
Immmunisierung von Säugern mit dem Antigen, Blutserum wird aufgereinigt
Wie werden monoklonale Antikörper gewonnen?
Immunisierung von Säugern mit dem gewünschten Protein, Entnahme von Milz-B-Lymphozyten, Fusion mit Myelomzellen (können sich potenziell unendlich teilen), Selektion der Hybridzellen und Klonierung (bilden alle denselben Antikörper)
Was unterscheidet Mono- und Polyklonale Antikörper?
Monoklonale: hochspezifisch: erkennen nur ganz spezifischen Teil eines Proteins, aufwendig, hohe Reproduzierbarkeit,
Polyklonale: Mischung unterschiedlicher Antikörper, erkennen mehrere Teile des Proteins (besserer Nachweis), unerwünschte Kreuzreaktionen, Problem der Batch-to-batch Konstanz
Was ist die direkte Immunodetektion?
Durch Konjugation des Antikörpers mit funktionellen Gruppen kann ein Nachweis erfolgen: radioaktive Isotope, Enzyme, Chromo/Flourophore, Metallionen
Was ist die indirekte Immunodetektion?
sekundärer Antikörper, der an primären Antikörper bindet (stark erhöhte Flexibiltät), reduziert Fehleranfälligkeit
Was ist Chemilumineszenz-Detektion?
Das an den zweiten Antikörper gebundene Enzym setzt ein Substrat um und dabei wird Licht einer best. Wellenlänge frei (CCD-Kamera nimmt Lumineszenz auf)
Was ist das ELISA-Prinzip?
Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay: Antigene werden an einen festen Träger gebunden und mittels Enzym-markierter Antikörper nachgewiesen
Was ist Sandwich-ELISA?
Antikörper werden an einen festen Träger gebunden und binden das Antigen, dies wird dann mittels Enzymmarkierter Antikörper nachgewiesen
