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Genomics > Grundlagen > Flashcards

Grundlagen Flashcards

1
Q

Plasmid

A

ringförmiges DNA-Molekül

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Q

Wie nennt man die Enden eines DNA-Strangs und wodurch sind sie charaktierisiert?

A

5’ (Phosphat)

3’ (OH)

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3
Q

Wie wurden Restriktionsendonukleasen entdeckt?

A

als DNA-restringierende Systeme bei der Phageninfektion von Bakterien (zur Verteidigung)

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4
Q

Wie erfolgt der Abbau von DNA durch Nuklease?

A

Spaltung an Zucker-Phosphat-Rückgrad (Phosphodiesterbindung)

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5
Q

Was ist die Methylase-Aktivität?

A

Anhängen einer Methylgruppe

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6
Q

Was macht Restriktionsendonuklease des Typs I aus?

A
  • zugleich Methylase und Nuklease
  • benötigen: ATP, Mg2+, S-Adenosylmethionin
  • spezifische Bindungsstelle, schneiden aber ca. 1000 BP davon entfernt (undefinierter Abstand)
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7
Q

Was macht Restriktionsendonukleasen des Typs II aus?

A
  • benötigen ATP, Mg2+

- schneidet in definiertem Abstand der nicht-palindromischen Erkennungssequenz

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8
Q

Was macht Restriktionsendonukleasen des Typs III aus?

A
  • oft verwendet
  • benötigen Mg2+
  • palindromische Erkennungssequenz
  • Bindungs- und Schnittstelle identisch
  • spezifische Puffer.-Anforderungen
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9
Q

Was unterscheidet blunt und sticky ends?

A
  • sticky: Überhänge müssen kompartibel sein, spezifischer Zusammenbau, thermodynamisch günstiger
  • blunt: jedes kann mit jedem zusammengebaut werden, thermodynamisch ungünstiger
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10
Q

Was sind Isoschizomere/Neoschizomere?

A

Iso..: gleiche Erkennungssequenz, schneiden gleich

Neo..:gleiche Erkennungssequenz, schneiden unterschiedlich

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11
Q

Was sind Methylierungspaare?

A

Enzyme mit gleicher Erkennungssequenz aber unterschiedlicher Methylierungsabhängigkeit

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12
Q

Unterschied Exo-/Endonukleasen

A
  • Exo: spalten vom Ende einzelne Nukleotide ab

- Endo: spalten beliebig innerhalb der Nukleinsäure (hinterlassen kurze Oligonukleotide)

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13
Q

Wofür verwendet man DNase I footprinting?

A
  • Proteine schützen DNA

- das Stück, das nciht von den Endonukleasen zerschnitten wurde, kann man sequenzieren (es bleibt heile)

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14
Q

Was machen DNA-Ligasen?

A

baut Zucker-Phosphat-Rückgrad wieder auf

-> Ligation von DNA-Enden (glatt oder klebrig), Verknüpfung von Bruchstellen

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15
Q

Was machen Phosphatasen?

A

-hydrolysiert die Phosphatgruppen (reduziert Religationsrate)

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16
Q

Was machen Kinasen?

A

Übertragen Phosphat von ATP auf 5’-Ende von Nukleotiden

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17
Q

Was machen Transferasen?

A

hängen Nukleotide an die freie OH-Gruppen an

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18
Q

Eigenschaften von DNA-Polymerase I?

A

-Holoenzym (kann in beide Richtungen arbeiten und so Fehler korrigieren)

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19
Q

Was sind thermostabile DNA-Polymerasen?

A

-tolerant gegenüber hohen Temperaturen

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20
Q

Wofür verwendet man RNA-Polymerasen?

A

-synthetisieren RNA von einem DNA-Template ohne Primer, haben Erkennungssequenzen

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21
Q

Was machen Reverse Transkriptasen?

A

wandeln RNA wieder in DNA um (benötigen Doppelstrang-Primer)

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22
Q

Template

A

Substrat der PCR-Reaktion

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23
Q

Primer

A

kurze Oligonukleotide zur Initiation der Polymerisation

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24
Q

dNTPs

A

Nukleotidphosphate werden in den neuen Strang eingebaut

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25
Q

Polymerase

A

Enzym zur Synthese der DOppelstränge

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26
Q

PCR-Denaturierung, T?

A

Trennung der Doppelstränge bei 95°C

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27
Q

PCR-Annealing, T?

A

Anlagerung der Primer an den geöffneten Doppelstrang (55°C)

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28
Q

PCR-Elongation, wie schnell, T?

A

Neusynthese des fehlenden Doppelstrangs (1min/kb), 72 °C

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29
Q

lytischer Zyklus

A

Entwicklungsphase, in der die Wirtszelle lysiert wird, nachdem neue Virionen gebildet wurden

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30
Q

lysogener Zyklus

A

DNA wird vorübergehend in Genom des Wirts integriert, Wirtszelle nicht lysiert

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31
Q

Wo bilden sich auf einer, mit Bakterien-Phagen-Schicht ausgefüllter Platte Plaques?

A

an den Stellen, wo Viren Bakterien angegriffen haben

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32
Q

Was charakterisiert das Genom des Lambda-Phagen?

A

recht viele, dicht gepackte Gene, regulatorische Gene, die über lysogenen/lytischen Zyklus entscheiden, nicht gebrauchte Region: für Klonierungsvektor

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33
Q

Was charaktierisiert Replacementvektoren?

A

es können größere Stücke eingebaut werden und in höherer Dichte analysiert werden

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34
Q

Was charakterisiert Insertionsvektoren?

A

es können nicht so große Stücke eingebaut werden, dafür können viele analysiert werden (für cDNA-Bibliotheken)

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35
Q

Assemblierung des Phagen

A

Kopf und Schwanz bauen sich selbst zusammen, Cos-Regionen unterstützen DNA-Füllung

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36
Q

in vitro-Verpackung von DNA in Phagen

A

-Kopf und Schwanz als einzelne temperatursensitiv, zusammengebaut replizierbar

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37
Q

Herstellung einer Phagen DNA Bank-

A
  • DNA-Stück/Gen muss auffindbar und statistisch vorhanden sein
  • jedes Phagen-Plaque enthält genau ein anderes Stück DNA
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38
Q

Wie findet man den Phagen in einer DNA-Bank mit der DNA, die man möchte?

A
  • hybridiseren mit Gensonde (Nitrocellulosefilter)
  • alkalische Lösung lysiert Phagen und denaturiert DNA -> Autoradiographie: Signal bei DNA, die komplementär zur Probe ist
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39
Q

Was ist cDNA?

A

-eukaryotische mRNA wird mit OligodTPrimer hybridisiert, dann mit reverser Transkriptase zu cDNA transkribiert, dann mit oligodCPrimer hybridisiert

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40
Q

transient

A

Fremdgen nur zeitweise in Organismus (nicht vererbt)

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41
Q

stabil

A

Fremdgen in Genom integriert, dauerhaft exprimiert und vererbt

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42
Q

Was sind Vorraussetzungen für die Transformation durch ein Ti-Plasmid?

A

selektierbares Markergen, Promotor, codierende DNA, Polyadenylierungssignal

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43
Q

Welche Eigenschaften kann ein Promotor eines Ti-Plasmids haben?

A

konstitutiv (überall), Gewebe-spezifisch, induzierbar (zeitweise)

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44
Q

Biolistic (transformation)

A

biological + ballistic

45
Q

“forward genetics”

A

Phänotyp->Genotyp (Gen erkennen, das Phänotyp verursacht)

46
Q

“reverse genetics”

A

Genotyp->Phänotyp (Gen bekannt, welcher Phänotyp wird ausgelöst?)

47
Q

Wie werden gewebespezifische Knock-outs hergestellt durch das Cre-Iox-System?

A

Cre-Recombinase erkennt Loci zwischen Lox-Sequenzen an bestimmten Stellten und schneidet Sequenz heraus (durch Rekombination) -> Gen ist ausgeknockt/Herausschneiden von Stop-Sequenzen

48
Q

Was sind repeat units?

A

kurze DNA-Stücke, die sich immer wieder wiederholen

49
Q

Was sind repeat regions?

A

angereicherte repetitive DNA, Großteil der DNA, kann auch regulative Funktionen haben

50
Q

Was für Sequenzen enthalten Chromosomen?

A

unikale/mittel-/hoch-repetitive Sequenzen, Strukturgene, Gene für rRNA, Transposons, Satelliten-DNA

51
Q

Wie ist das Grundprinzip der FISH (Floureszenz in situ Hybridisierung)?

A

Hybridisierung bekannter, markierter (radioaktiv mark. Phosphat/floureszenzmarkierte Nukleotide) DNA-Fragmente mit präparierten Chromosomen

52
Q

Nenne drei Beispiele zur Anwendung von FISH

A

Analyse von Chromosomenabberationen (Pränataldiagnostik), Genomvergleiche, Diagnostik

53
Q

Was ist der Unterschied von Hybridisierungssignal und Painting bei FISH?

A

Hybridisierungssignal: nur ein Stück markiert
Painting: gesamtes Chromosom markiert (über Chromosom verteilt)

54
Q

Wofür kann man multicolour FISH verwenden?

A

physikalische Abstandsmessung auf dem Chromosom

55
Q

Wofür nimmt man Microarrays?

A

Erfassung der Genexpression aller Gene (Transkriptom-Analyse), wie schwach/stark ist ein Gen exprimiert?

56
Q

Was sind Oligonukleotid-Array-Chips?

A

hochaufgelöster kleiner Chip, der bis zu 200.000 unterschiedliche Genproben abbildet

57
Q

Wie führt man eine Gen-Chip-Hybridisierung durch?

A

RNA wird revers transkribiert mit Floureszenzfarbstoff-DNA (Einfrieren des Expressionszustands des Organismus)

58
Q

Was macht man bei der Genchiphybridisierung, damit weniger Fehler auftreten?

A

Man versucht, für jedes Gen mehrere Oligos zu machen. Nur wenn alle leuchten, zähle ich das als positiv

59
Q

Was versteht man unter der Auswertung von coregulierten Genen?

A

Gengruppen, die sich ähnlich verhalten, sind in Cluster-Analyse zu erkennen (Expressionsverwandtschaft, erst reagieren alle nicht, dann reagieren alle: Gene könnten gemeinsam an einem Prozess wirken)

60
Q

Was ist der natürliche Ursprung des CRISPR/Cas-Systems? Was ist der Grund-Mechanismus?

A
  • adaptives bakterielles Immunsystem gegen Phagen-DNA

- Mechanismus: Fremd-Nukleinsäuren werden erkannt und abgebaut

61
Q

Was ermöglicht CRISPR/Cas der Gentechnologie?

A

Man kann Gene präzise zerstören, Gene austauschen/reparieren, seit kurzer Zeit auch einzelne Basen verändern (CAS9)
-> riesige Toolbox aus Proteinen

62
Q

Was sind die CAS-Gene?

A

sind immer neben CRISPR-Lokus, codieren für Protein, das erkannte DNA bearbeitet/zerstört

63
Q

Wie ist die CRISPR-Sequenz aufgebaut?

A

spacer: unterschiedlich (Stück Viren-DNA, spezifisch für Pathogen), repeats: immer gleich

64
Q

Was ist besonders an den Einsatzmöglichkeiten von CRISPR-CAS?

A

es wird zu keinem Zeitpunkt Fremd-DNA ins Pflanzengenom integriert

65
Q

Definition Markergen

A

erlaubt Selektion von gesuchten Ereignissen, in der Regel dominant

66
Q

Definition Reportergen

A

nicht dominant selektiv, Genprodukte sind aber leicht durch biochemische, histochemische oder photometrische Methoden nachweisbar

67
Q

Welche Merkmale können Reporter-/Markergene aufweisen?

A

selektierbar, quantifizierbar, einfach/preiswert, in lebenden Organismen?, sensitiv/optisch hoch aufgelöst

68
Q

Was ist das Two-Hybrid-System?

A

System zum Nachweis von Protein-Protein-Interaktionen in lebenden Hefezellen

69
Q

Was ist ein One-Hybrid-System?

A

System zur Identifizierung von unbekannten Proteinen bzw. Untersuchung von Proteinen, die an eine bekannte DNA-Sequenz binden (welches Protein bindet an Promotor?)

70
Q

Three-Hybrid-System

A

Untersuchung von Proteinen, die an eine bekannte RNA-Sequenz binden

71
Q

Was ist ein überbrücktes 2-Hybridsystem?

A

drei Proteine, zwischen X und Y bindet ein Protein nur als Brücke (daran ist keine Fusionsdomäne)

72
Q

Welche Eigenschaften können die Aminosäure-Seitenketten haben? Nenne jeweils ein Beispiel.

A
  • Hydrophobe Wechselwirkungen (van der Waals-Kräfte): Glycin, Alanin
  • Wasserstoff-Brücken: Tyrosin
  • Salzbrücken (Ladung): Lysin (+) und Aspartat (-)
  • Floureszenz (aromatische Reste): Pheynalalanin, Tryptophan
  • Disulfidbrücken: Cystein
73
Q

Was ist die Degeneriertheit des genetischen Codes?

A

Es existieren mehrere Kombinationen für die gleiche Aminosäure (aber verschiedene tRNA’s)

74
Q

Was ist die Primärstruktur eines Proteins?

A

lineare Aminosäureabfolge (Polypeptidsequenz)

75
Q

Was ist die Sekundärstruktur eines Proteins?

A

alpha-Helix, beta-Faltblatt

76
Q

Was ist die Tertiärstruktur eines Proteins?

A

räumliche Anordnung der Sekundärstrukturen (meist Chaperon-vermittelt)

77
Q

Was ist die Quartärstruktur eines Proteins?

A

Zusammenlagerung von 2 oder mehr gefalteten Proteinketten (Chaperone) zu Multimeren

78
Q

In welchen Bereichen kann man rekombinante Proteine anwenden?

A

Industrie: Waschmittel/Lebensmittel: alpha-Amylase, Diagnostik: Antikörper (Tumordiagnostik), Therapeutische Nutzung (humanes Insulin), Wissenschaftliche Forschung (Strukturanalysen)

79
Q

Wie läuft die Herstellung rekombinanter Proteine ab?

A

Amplifikation der DNA-Sequenz, Klonierung in Vektor, Transformation in Zielorganismus, Selektion transgener Individuen, Kultivierung und Induktion der Expression, Extraktion von Gesamt-Protein, Aufreinigung des Proteins

80
Q

Nenne zwei Vorteile und zwei Nachteile von prokaryontischen Expressionssystemen!

A

Vorteile: einfache Handhabung, schnelles Wachstum, Nachteile: fremde Proteine akkumulieren häufig in inclusion bodies, falsche Proteinfaltung, keine post-translationalen Modifikationen

81
Q

Nenne zwei Vor- und zwei Nachteile in eukaryontischen Systemen!

A

Vorteile: Expression induzierbar, hohe Ausbeuten
Nachteile: komplexere Handhabung, Glykolysierungsmuster abweichend von anderen Systemen

82
Q

Welche wichtigen Stelllen haben Expressionsvektoren?

A

Promotor, MCS/Fremdgen, Terminator, Selektionsmarker, Origin of replication

83
Q

Wie funktioniert die IPTG-Induktion der Proteinexpression?

A

im nicht induzierten Zustand ist Promotor durch Repressor reprimiert, IPTG deaktiviert Repressor und das Zielprotein wird exprimiert

84
Q

Was sind in-vitro-Expressionssysteme?

A

künstliches, zellfreies System mit Proteinbiosynthese-Werkzeugen aus eurkaryontischen Zellen und dem Expressionsvektor, feeding-Kammer und Reaktionskammer, durch semipermeable Membran getrennt, sehr teuer!

85
Q

Welche Verfahren gibt es zum Zellaufschluss und worauf beruhen sie?

A

Potter (Kolben in Reagenzglas zerreibt Bakterien), Mixer (schließt auch Bakterien auf), Ultraschall-Bad (Schwingungen), French press (starke Pumpe, sehr kleiner Spalt)

86
Q

Was ist das Grundverfahren der Herstellung von Protein-Roh-Extrakten?

A
  1. in Pufferlösung (Konstanz von pH-Wert und Ionenstärke garantieren) homogenisieren, 2. Zelltrümmer abzentrifugieren und Überstand abnehmen, 3. Proteingehalt bestimmen und Proben lagern
87
Q

Worauf beruht die Proteinkonzentrations-Bestimmung nach Bradford?

A

Coomassie Brilliant Blue mit verdünnter Proteinlösung mischen, photometrische Messung (optische Dichte OD) und Konz. anhand einer Protein-Eichgerade bestimmen

88
Q

Was bedeutet SDS-PAGE?

A

SDS (Puffer) -PolyAcrylamidGelElektrophorese (von Proteinen), Protein-Trennung nach Ladung

89
Q

Was ist der Unterschied bei Sammel- und Trenngel?

A

Sammelgel: größere Poren, mehr Beweglichkeit, Fokussierung der Proteine in scharfer Bande), Trenngel: kleine Poren, saubere Auftrennung

90
Q

Womit färbt man Protein-Gele? Worauf beruht die Färbung?

A

Coomassie (brilliant blue) bindet an positiv geladene (basische) Seitenketten, Silbernitrat (genauer), Silberionen binden an negativ geladene (saure) Seitenketten

91
Q

Was ist das Prinzip der 2D-Gelelektrophorese?

A

2 Trennmethoden:

  • isoelektrische Fokussierung anhand des isoelektrischen Punkts der Proteine im pH-Gradienten (dort ist Ladung 0 und es bewegt sich nicht mehr)
  • Trennung im SDS-Gel anhand ihrer Masse

-> Auswertung mit “Spot-Pickern” und Massenspektrometrie

92
Q

Wie funktioniert die Dialyse nach Salzfällung?

A

Enfernung überschüssiger Salze und Konzentrierung des Proteins (Nutzung eines geeigneten Dialyse-Schlauchs mit passender Ausschlussgröße)

93
Q

Wie funktioniert die Fraktionierung durch Größenausschluss-Chromatographie?

A

kleine Moleküle verfangen sich in Gel-Matrix und eluieren daher später

94
Q

Wie funktioniert die Affinitätsreinigung (6x His-tag)?

A

Bindung an komplexiertes Nickel, nach Waschen Eluition mit Imidazol (funktioniert auch unter denaturierten Bedingungen, kann Protein-Konformation beeinflussen)

95
Q

Wie funktioniert die Affnitätsreinigung mit Strep-trag II?

A

Proteine mit Strep-tag II binden an Strep-Tactin, werden gewaschen und dann wieder kompetitiv von der Matrix gelöst (Verdrängung mit Desthiobiotin) und eluieren daher relativ rein (Strep-tag kann dann abgespalten werden)

96
Q

Wie kann man tags nachträglich abspalten?

A

Enzyme erkennen bestimmte Sequenz (z.B. Enterokinase) und schneiden dahinter das tag ab (Kombination mit Reinigungstags)

97
Q

Was ist der Western-Blot?

A

Protein-Transfer von SDS-Gelen auf einen festen Träger (Spannung angelegt, sodass Proteine auf Nitrocellulose-Membran übertragen werden), Nachweis durch Ponceau Rot

98
Q

Was sind Proteinmarker?

A

enthalten Protein oder deren Fragmente definierter Größe, teilweise farblich hervorgehoben

99
Q

Was ist wichtig, wenn man die einzelnen Proteine auf dem Western Blot mit spezifischen Antikörpern nachweisen möchte?

A

man muss unbesetzte Bindungsstellen der Membran blockieren mit z.B. BSA oder Milchpulver

100
Q

Wie kann man ein Protein durch Antikörper nachweisen?

A

Makromoleküle (Antigene) werden von Antikörpern spezifisch gebunden und können so indirekt nachgewiesen werden

101
Q

Wie werden polyklonale Antikörper gewonnen?

A

Immmunisierung von Säugern mit dem Antigen, Blutserum wird aufgereinigt

102
Q

Wie werden monoklonale Antikörper gewonnen?

A

Immunisierung von Säugern mit dem gewünschten Protein, Entnahme von Milz-B-Lymphozyten, Fusion mit Myelomzellen (können sich potenziell unendlich teilen), Selektion der Hybridzellen und Klonierung (bilden alle denselben Antikörper)

103
Q

Was unterscheidet Mono- und Polyklonale Antikörper?

A

Monoklonale: hochspezifisch: erkennen nur ganz spezifischen Teil eines Proteins, aufwendig, hohe Reproduzierbarkeit,
Polyklonale: Mischung unterschiedlicher Antikörper, erkennen mehrere Teile des Proteins (besserer Nachweis), unerwünschte Kreuzreaktionen, Problem der Batch-to-batch Konstanz

104
Q

Was ist die direkte Immunodetektion?

A

Durch Konjugation des Antikörpers mit funktionellen Gruppen kann ein Nachweis erfolgen: radioaktive Isotope, Enzyme, Chromo/Flourophore, Metallionen

105
Q

Was ist die indirekte Immunodetektion?

A

sekundärer Antikörper, der an primären Antikörper bindet (stark erhöhte Flexibiltät), reduziert Fehleranfälligkeit

106
Q

Was ist Chemilumineszenz-Detektion?

A

Das an den zweiten Antikörper gebundene Enzym setzt ein Substrat um und dabei wird Licht einer best. Wellenlänge frei (CCD-Kamera nimmt Lumineszenz auf)

107
Q

Was ist das ELISA-Prinzip?

A

Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay: Antigene werden an einen festen Träger gebunden und mittels Enzym-markierter Antikörper nachgewiesen

108
Q

Was ist Sandwich-ELISA?

A

Antikörper werden an einen festen Träger gebunden und binden das Antigen, dies wird dann mittels Enzymmarkierter Antikörper nachgewiesen

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