Geral Flashcards
1) Assinala com um V as afirmações verdadeiras e com um F as falsas:
a) As nucleases de cadeia simples são específicas das moléculas de RNA.
b) Num “Southern-Blot” e numa libraria de DNA é necessário desnaturar o DNA que se fixou nas membranas.
c) A polimerase do DNA polimeriza no sentido 3’–5’ no entanto os “primer’s” emparelham no sentido 5’-3’.
d) A DNA ligase de coli é a enzima mais indicada para ligar moléculas de DNA com extremos cegos.
e) Os vectores vaivém são plasmídeos naturais de coli.
f) O DNA transferido para uma membrana num “Northern-blot” deve hibridar com uma sonda de RNA.
g) No isolamento de um gene podem ser utilizadas a técnica de PCR, “Southern-blot” e librarias de DNA.
h) A capacidade de diferentes plasmídeos replicarem na mesma célula está controlada pelos genes *INC.
i) Para integrar um gene no genoma de um ser vivo podemos utilizar um plasmídeo replicativo como vector.
j) Numa libraria de DNA o processo de hibridação é diferente do de um “Southern-blot”.
a) As nucleases de cadeia simples são específicas das moléculas de RNA. F
b) Num “Southern-Blot” e numa libraria de DNA é necessário desnaturar o DNA que se fixou nas membranas. V
c) A polimerase do DNA polimeriza no sentido 3’–5’ no entanto os “primer’s” emparelham no sentido 5’-3’. F
d) A DNA ligase de coli é a enzima mais indicada para ligar moléculas de DNA com extremos cegos. F
e) Os vectores vaivém são plasmídeos naturais de coli. F
f) O DNA transferido para uma membrana num “Northern-blot” deve hibridar com uma sonda de RNA. F
g) No isolamento de um gene podem ser utilizadas a técnica de PCR, “Southern-blot” e librarias de DNA. V
h) A capacidade de diferentes plasmídeos replicarem na mesma célula está controlada pelos genes INC. V
i) Para integrar um gene no genoma de um ser vivo podemos utilizar um plasmídeo replicativo como vector. F
j) Numa libraria de DNA o processo de hibridação é diferente do de um “Southern-blot”. F
3) Indica um vector plasmídico e um vector derivado de um bactériofago utilizados em E.coli.
Plasmídeo pBR322:
O plasmídeo pBR322 é um vetor amplamente utilizado em pesquisas de biologia molecular, tem tamanho relativamente pequeno, tem sequencia totalmente conhecida, é fácil de introduzir e é estável. Ele possui uma origem de replicação de E. coli (ori) que permite sua replicação dentro das células bacterianas. Além disso, o pBR322 contém genes de resistência a antibióticos, como a ampicilina e a tetraciclina, o que facilita a seleção de células transformadas. Com sítios de restrição estrategicamente posicionados, o pBR322 oferece facilidade na clonagem de fragmentos de DNA, tornando-se uma ferramenta valiosa para a manipulação e estudo de genes em Escherichia coli.
Fago lambda de bacteriófago:
O fago lambda tem 48.502 pb, é linear com extremos coesivos. É um bacteriófago que infecta a Escherichia coli e seu DNA pode ser utilizado como um vetor plasmidial em pesquisas genéticas. O vetor fago lambda apresenta uma origem de replicação específica do fago, permitindo sua reprodução dentro da célula hospedeira. Com sítios de clonagem bem definidos, o vetor fago lambda é utilizado principalmente em estudos que envolvem a clonagem de grandes fragmentos de DNA, como construção de bibliotecas genômicas. Sua utilização facilita a manipulação e amplificação de genes, sendo uma ferramenta valiosa em experimentos de biologia molecular e genética.
4) Define vector integrativo, vector replicativo, vector de fusão, vector de expressão e vector vai-vém.
Vector integrativo → vector que pode existir sob a forma circular ou integrado no cromossoma. A integração depende do fator F, tem o número de cópias definido e conferem resistência à antibióticos.
Vector de fusão → vectores que possuem dois genes fundidos no qual um deles atua como marcador de seleção.
Vector de expressão → Vectores desenvolvidos para a expressão de proteínas recombinantes. Estes vectores possuem as sequências reguladoras necessárias para a manipulação experimental da expressão de um gene. Elevado nº de cópias, eficácia do promotor, estabilidade da proteína.
Vector vai-vém → Podem-se utilizar simultaneamente em duas espécies. Possuem muitas vantagens técnicas. Construidos pela T.D.R. Possuem duas origens de replicação. Sistemas de restrição inactivos
5) Indica os processos de introdução de DNA nas células de bactérias.
Os processos de introdução de DNA em células bacterianas incluem transformação, transdução, conjugação, electroporação e gene gun. Na transformação, as células bacterianas são tratadas com agentes físicos ou químicos para aumentar a permeabilidade da membrana, permitindo a entrada do DNA exógeno. Na transdução, o DNA é transferido de uma célula doadora para uma célula receptora por meio de um vírus bacteriófago. A conjugação envolve a transferência de DNA por meio de uma ponte citoplasmática entre células bacterianas. A electroporação envolve a aplicação de pulsos elétricos breves para criar poros temporários na membrana celular, permitindo a entrada do DNA exógeno. A gene gun ou bombardeamento é um método que usa partículas de ouro ou tungstênio revestidas com DNA, que são “disparadas” na célula por pressão de gás ou choque mecânico.
6) Indica os processos de introdução de DNA nas células vegetais.
Os processos de introdução de DNA em células vegetais incluem a transformação por Agrobacterium, eletroporação, microinjeção e biolística. A transformação por Agrobacterium envolve a transferência natural de DNA por meio dessa bactéria para as células vegetais. Na eletroporação, pulsos elétricos são aplicados para criar poros temporários na membrana celular. A microinjeção consiste na injeção direta de DNA nas células vegetais usando microagulhas. A gene gun ou bombardeamento envolve o disparo de partículas recobertas com DNA nas células vegetais.
8) Indica a vantagem da utilização do marcador LacZ em experiências de clonagem molecular.
O marcador de inserção, como o gene LacZ, produz uma enzima chamada beta-galactosidase que tem como indutor de atividade o IPTG e X-Gal. Ao observar colônias azuis, significa que a clonagem não foi eficiente, apenas possui o inserto. Ao observar colônias brancas ou creme, significa que LacZ foi eficiente na clonagem da E.Coli, possuindo o inserto + vector. Assim, a presença ou ausência da atividade enzimática do gene LacZ permite a identificação de clones recombinantes.
9) Indica os fundamentos, as etapas eas aplicações da técnica dos microarrays.
Permite fazer a comparação do comportamento molecular de diversos tipos de linhagens celulares e tecidos diferentes, quando expostos à uma determinada condição patológica ou experimental.
Etapas: Extração do mRNA → RT-PRC → cDNA → cDNA são coradas com cy3 (verde) e cy5 (vermelha) → Hibridização → Leitura da intensidade de fluorescência em scanner especial → análise das imagens com um software específico.
Aplicações: Descoberta de fármacos, diagnóstico e investigação, terapia génica, mapeamento genómico, utiização no tratamento de doenças.
10) A não ser que o contrário seja especificado, a cada resposta correta corresponde uma única palavra.
a) Mecanismo de transferência genética durante o qual o DNA é transferido da bactéria dadora para a receptora através de um vírus.
b) Mecanismo de transferência genética durante o qual o DNA é transferido de uma bactéria dadora para uma receptora través de uma ponte citoplasmática.
c) Estado que confere à bactéria a capacidade de absorver DNA do ambiente.
d) Tipo de transdução durante o qual, é normalmente transferido um grande número de genes com baixa frequência.
e) Durante este tipo de transdução, são normalmente transferidos um ou poucos genes com elevada frequência.
f) Mecanismo de replicação do DNA na célula dadora durante a conjugação.
g) Plasmídeos com função desconhecida.
h) Para preparar um bom hospedeiro procariótico devem inativar-se os genes (duas palavras)
i) Replicação com muitas cópias dos plasmídeos
j) Vector fágico com forma linear muito utilizado em experiências de clonagem.
a) Mecanismo de transferência genética durante o qual o DNA é transferido da bactéria dadora para a receptora através de um vírus. TRANSDUÇÃO
b) Mecanismo de transferência genética durante o qual o DNA é transferido de uma bactéria dadora para uma receptora través de uma ponte citoplasmática. CONJUGAÇÃO
c) Estado que confere à bactéria a capacidade de absorver DNA do ambiente. COMPETÊNCIA
d) Tipo de transdução durante o qual, é normalmente transferido um grande número de genes com baixa frequência. GENERALIZADA
e) Durante este tipo de transdução, são normalmente transferidos um ou poucos genes com elevada frequência. ESPECIALIZADA
f) Mecanismo de replicação do DNA na célula dadora durante a conjugação. INDEPENDENTE
g) Plasmídeos com função desconhecida. CRIPTICOS
h) Para preparar um bom hospedeiro procariótico devem inativar-se os genes (duas palavras). DAM e DEM
i) Replicação com muitas cópias dos plasmídeos. VECTORES
j) Vector fágico com forma linear muito utilizado em experiências de clonagem. FAGO LAMBDA
11) Indica as características da nuclease Desoxinucleotidiltransferase terminal.
É uma enzima que adiciona sequências de nucleotídeos aleatórios às extremidades do DNA, permitindo a formação de extremos coesivos. Requer a presença de um iniciador com extremo 3-hidróxilo.
12) Indica as etapas e enzimas necessárias à formação de uma livraria de cDNA.
A formação de uma biblioteca de cDNA envolve as seguintes etapas:
Isolamento do RNA total da amostra.
Transcrição reversa, usando a transcriptase reversa, para sintetizar cDNA complementar ao RNA molde.
Degradação do RNA molde usando a enzima RNase H.
Síntese da segunda fita de cDNA com a DNA polimerase I.
Adição de adaptadores às extremidades dos fragmentos de cDNA.
Amplificação por PCR dos fragmentos de cDNA.
Clonagem dos fragmentos de cDNA em um vetor de clonagem, como um plasmídeo bacteriano.
Transcriptase reversa (utiliza como molde o RNA, sintetiza DNA originando moléculas híbridas DNA/RNA)
RNAse H (converte o mRNA em cDNA)
DNA polimerase (faz cópias do DNA a partir de um iniciador)
DNA ligase (liga os fragmentos de cDNA ao fago)
12) Indica as etapas e enzimas necessárias à formação de uma livraria Genómica.
A formação de uma biblioteca genômica envolve as seguintes etapas principais:
Extração de DNA: O DNA é extraído do organismo de interesse.
Fragmentação do DNA: O DNA é quebrado em pedaços menores.
Adição de adaptadores: Sequências de oligonucleotídeos são adicionadas às extremidades dos fragmentos de DNA com enzimas como a fosfatase alcalina, cinase e DNA ligase.
Amplificação por PCR: Os fragmentos de DNA são amplificados usando a reação em cadeia da polimerase.
Clonagem: Os fragmentos de DNA amplificados são clonados em vetores de clonagem, como plasmídeos bacterianos.
Transformação bacteriana: Os vetores contendo os fragmentos de DNA são inseridos em bactérias através da transformação bacteriana.
Seleção de clones: Bactérias que contêm o vetor e os fragmentos de DNA de interesse são selecionadas.
Amplificação de clones: Os clones bacterianos selecionados são cultivados para amplificar o DNA clonado.
Enzimas de restrição
DNA ligase (junta os fragmentos de okasaki)
Fosfatase alcalina (remove os grupos fosfato das extremidades 5’ do DNA para evitar ligações indesejadas)
Cinase (screening)
13) Indica as vantagens e desvantagens entre uma livraria de DNA genómico e uma livraria de cDNA.
As bibliotecas de DNA genômico oferecem uma representação completa do genoma e preservam a estrutura genômica, permitindo a identificação de genes completos. No entanto, podem ser desafiadoras devido ao tamanho do DNA genômico e à presença de sequências repetitivas. Por outro lado, as bibliotecas de cDNA representam os genes expressos em um tecido ou condição específica, facilitando a análise da expressão gênica. A clonagem de genes específicos é mais fácil em cDNA devido à ausência de íntrons. No entanto, as bibliotecas de cDNA não incluem sequências não codificantes e podem ter uma representação limitada do genoma.
14) Indica as diferenças entre marcador de seleção e marcador de inserção num vector de clonagem e dê um exemplo de cada um destes marcadores.
Marcadores de seleção são genes que nos permitem selecionar os transformantes de forma rápida e segura. Os marcadores de inserção nos permitem verificar se os clones possuem o gene com o vector inserido.
O marcador de seleção, como o gene de resistência à ampicilina, confere resistência a antibióticos, permitindo a sobrevivência apenas das células transformadas com o vetor contendo o gene. Por outro lado, o marcador de inserção, como o gene LacZ, produz uma enzima chamada beta-galactosidase que produz X-Gal na presença do indutor PTG, conferindo coloração azul às colônias . Ao observar colônias azuis, significa que a clonagem não foi eficiente, apenas possui o inserto. Ao observar colônias brancas ou creme, significa que LacZ foi eficiente na clonagem da E.Coli, possuindo o inserto + vector. Assim, a presença ou ausência da atividade enzimática do gene LacZ permite a identificação de clones recombinantes.
15) Indica os principais métodos e técnicas de mutagénese dirigida.
Construção de mutantes:
Por deleção
Por inserção
Por substituição
Mutações pontuais
Com “cassetes”
Ferramentas:
PCR → alterações nos primers que usamos para polimerizar → em 3 ou 4 pb. Não pode alterar muito o primer pois ele se torna inespecífico.
Digestâo enzimática → mais utilizada para deleções, é possível para inserções e mais difícil para substituições.
16) Indica os processos de seleção de recombinantes.
Seleção por marcadores de resistência: Genes de resistência a antibióticos são inseridos com o DNA de interesse nos vetores de clonagem. Células transformadas com o vetor recombinante crescem em meio com antibiótico, eliminando as não transformadas.
Análise fenotípica de mutantes: podem ser selecionados através da observação do tamanho, cor, etc. A análise pode ser realizada através da microscopia, curvas de crescimento, análises bioquímicas e análises auxotróficas.
Análise genética de mutantes: Pode ser realizada por southern-blot, northern-blot, PCR e digestão enzimática.
