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Génétiquement Flashcards

1
Q

C’est quoi l’optogénétique?

A

active ou inhibe les neurones avec la lumières

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2
Q

d’ou viennet les prot fluo d’origine naturelle ? /

A

GFP des méduses et
RFP des corails

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3
Q

quelle structure est les prot fluo ?

A

forme de cylindre

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4
Q

C’est quoi des protéines de fusion?

A

gène GFP accroché à un gène alors quand ils est codé, ils se code ensemble et s’accroche sur la prot cible.

=ajout séquence codante GFP

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5
Q

Comment on apppel les prot de fusion

A

proteine chimérique

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6
Q

Désavantage prot de fusion?

A

l’une des prot, la fusionné ou l’autre est touché et peut avoir un moins bon fonctionnement

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7
Q

Type de protéine photosensible d’origine naturelle ?

A
  1. channelrhodopsin (active)
  2. halorhodopsine (inhibe)
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8
Q

C’est quoi qui peut être modifier par génie génétique

A

protéine photosensible d’origine naturelle

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9
Q

Les protéine photosensible d’origine naturelle sont fluo

A

faux. juste activable/inhibable par la lumière.

Ajout de GFP si on veut visualisé

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10
Q

quel prot utilisé pour former des canaux ionique ?

A

channelrhodopsin

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11
Q

c’est quoi des protéines luminescente ?

A

protéine sensible à la lumière qui génère de la lumière.

PAS FLUO pcq genere lumière visible.

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12
Q

ex. de proteine luminescente ?

A

Luciférase de la mouche à feu

-> enzyme oxidative catalyse la production de lumière de l’oxidation de la luciférase.

-> utilisé pour rapporteur de l’activité des gènesé

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13
Q

c’est quoi gCaMp ?

A

senseur encodés génétiquement
GFP+ prot modulé par le calcium

Ne sert pas. à quantifier mais indiquateur. = monitorer lumière

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14
Q

comment fonctionne les senseurs endodé génétiqueemnt dans les neurotransmetteurs

A

quand prot de se lie, ca change de conformation et active la GFP = lumière.

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15
Q

À quoi servent les outils fe lumière

A

visualiser les cellules,
les compartiments cellulaire,
les prot,
les phénomère (calcium, voltage…) et active/inhibe les cellules.

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16
Q

Pour et contre des outils encodés génétiquement %

A

Pour:
- proteine produite par la cellule
- expression prot peut etre ciblé spatialement ou temporellement
- expression des prot peut etre temporaire ou permanante (lignée)

Contre:
Prend du temps
beaucoup d’expertise
intensité signaux peut être faible.

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17
Q

Faire des plasmides est faciles

A

Faux

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18
Q

C’est quoi les grandes étapes de faire un plasmide

A
  1. PCR
  2. restriction enzyme de digestion
  3. DNA ligation
  4. TRansormation
  5. Purifier l’ADN
  6. Test de digestion
  7. séquencage
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19
Q

Quand l’ADN plasmide st prêt, on fait quoi?

A

transfert cellule ou animal

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20
Q

Comment on introduits l’ADN dans les cellules somtiques ?

A

-> introduit mais pas transféré à sa descendance.

  1. calcium phosphate (classique, fonctionne bien)
  2. lipofection (juste culture cellulaire)
  3. Électroporation (juste culture cellulaire)
  4. Vecteurs viraux
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21
Q

différence entre introduction ADN temporaire vs permanente ?

A

temporaire: ne s’intégre pas et n’est pas transmis division cellulaire

Permanate: opposé

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22
Q

but des vecteurs viraux ?

A

quils soient non réplicatifs et non pathogénitques (ou minimalement)

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23
Q

But des vecteurs viraux ?

A
  1. transfert leur matériel génétique
  2. utilisé sur organisme vivant et cellule in vitro
  3. recherche fondamentale
  4. but thérapeuthique
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24
Q

Comment batisson un vecteur viral ?

A
  1. enelever le plus de gène viral possible = garder origine replication et séquence empaquetage + inserer gne interet
  2. construire plasmide ayant prot replication + empaquetage MAIS PAS LES SÉQUENCE D’EMPAQUETAGE, CA EST MIS SUR UN AUTRE PLASMIDE
  3. inserer plasmides dans la meme cellule pour produire le virus
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25
pk on met sur deux plasmides ?
peut reverta et que le gène pathogene revienne = moins facile se refaire si séparer
26
la cellule sert a quoi dans les vecteur viraux ?
usine a virus
27
Quel caractéristique des virus ont un impact sur leur valeur comme vecteurs viraux ?
1. pathogene (toxicité) 2. cell target (ribise) 3. facilité manipulation 4. type génome (ARN ADN) 5. grosseur virus et gène interet 6. présence immunitaire 7. stabilité 8. enveloppe 9. intégration génome ou pas
28
ARN ou ADN plus simple à manipuler ?
ADN
29
C'est quoi un lentivirus (vecteur lentiviral)
Rétrovirus à ARN -> s'integre aléatoirement dans le génome -> enveloppé
30
c'est quoi les adénovirus-vecteur adenoviral (AD5)
génome ADN double btin PAS enveloppé utilisé récepteur CAR induit un peu de réponse immunitaire
31
C'est quoi le virus rabique recombinant
virus enveloppé formé de balle de fusil génome ARN simple brin négatif interfere avec les NEURONES (terminaison) et traverse la synapse = pas besoin sortir cellule
32
différence entre rabies virus wild vs lui quon utilise
Wild est recouverte de glycoproteine. La notre on enlève la glycoproteine pour y mettre gène d'interet (ex fluo, markeur, senseur...) la prot G (glycoprot) est essentielle alors sera mis dans un autre plasmide.
33
Quoi sert vecteur rabies sur neurones
déterminer si les cellules transplantée établissent connection synaptique avec d'autre neurones et lesquels
34
c'Est quoi les adeno-associer virus (AAV)
génome ADN simple brin et sa réplication dépend des autres virus )AD5 ou HSV) PAS AUTONOME ! pas de maladie connue,
35
Il y a beaucoup de controle de qualité ?
oui. 1. PCR 2. ELISA, 3. Cytrométrie = valider pureté, intégrité, vitro et vivo
36
Les AAV exsitent dans plusiuers sérotypes ?
1. selon variation molécule sur leurs capside 2. majorité AAV utilisée sont génome AAV2 mais empaqueté dans une capside d'autre sérotype 3. molécule capside se lient à différent récepteur cellulaire qui affecte le tropisme
37
Majorité virus ne dépasent pas....
la BBB
38
Selon quoi que le serotype sera différent et différent type cellulaire seront favorisés
le CAP utilisé
39
Pourquoi les AAV sont des vecteurs viraux presque parfait et les plus utilisé en neuroscience les contres ?
1. agis sur les cellule qui se divise ou celle qui ne se divise pas 2.pas pathologique (coninement 1) 3. génom eADN = facile 4. expression long terme, mais ne sintegre pas -> expression lente. injecte et 3 sem aprèes = mauvais si étudie développement -> limiter a 5kb
40
futur pour le design de vecteurs viraux ?
1. améliorer caractéristique existante 2. ajouter new truc cool 3. facilité production 4. diminuer pathogenecité
41
comment on fait pour faire passer AAV à travers BBB ?
on le mute dans CAP pour +7 peptide = traverse BBB -> marche certaine souris, mais pas efficace d'autres espece
42
Pouvons nous cibler la vasculature ?
Oui.
43
Comment choisir un vecteur viral ?
1. taille du transgene 2. ciblage d'un type de cellule ou d'un stade de developpement (division cellulaire / neurone) 3. vitesse, niveau et permanance de l'Edpression 4. TRansport dans les neurones.
44
rabies = quelle cellules qui affecte
neurones
45
caractéristique de AD5 RAbies AAV Lentivirus Retrovirus
AD5: infecte cell replique ou non, inflammation. gros gene, expresssion vite. retrograde Rabies: neurones, transitoire, toxique, gros gene, expression vite, pas de choix promoteur AAV: infecte cell replique ou non peu inflammation, pas toxique, expression lente et petit gene (NC1) retrograde lentivirus: infecte cell replique ou non, expression vite, permanente, integre aléatoire. retrograde retrovirus: juste cell qui se réplique, exprime rapidement et permatent. integre aleatoire
46
+ et - methode virale
- titrable - efficace même cell difficile - expression permanente possible - transport rétrograde ou trans synaptique - toxicité et sécurité
47
+ et - methode non-virale
- simple - possible d'inserer plus de copie par cellule - peu ou pas de toxicité - expression permanente possible - difficile chez certain espèce.
48
Comment on introduit de l'ADN dans les cellules germinales ?
directement dans embryon ou cellule embryonnaire -> aléatoire (transgenique) -> ciblé par recombinaison homologue (KO ou KI)
49
Comment on fait les animaux transgénique ?
ADN plasmidique contenant un promoteur et un gène d'interet est injecté dans l'embryon -> les copies (plusieurs) s'insere de facon aléatoire dans le génome -> plusiuers lignée d'animaux générée dépendemment du nombre de copie intégrés et du site d'intégraiton. = doit analyser toute les lignées
50
Promoteur = codant ?
non. choisit juste quand, combien est exprim.
51
c'Est quoi la méthode germline gene transfer ( KO, KI)
méthode classique qui insere un ADN paslmidique contenant le gène d'interet qu'on électropore dans des cellule ES (cell embryonnaire) -> s'insere spécifiquement au locus endog;ene par recombinaison homologue. -> sélectionne les cellule ES par l'integration du gene.
52
Les cellules positive au. KO se passe quoi
injecter dans un embryon pour obtenir une chimère
53
Il se passe quoi avec les chimere
ont les croise pour avoir une transmission à la descendance.
54
Est-ce que le targeting vector retrouve la région qui lui est homologue dans le génomes ?
La recombinaison est assez peu probable et plusieurs étapes de sélection sont nécessaire pour s'assurer quil y a intégration complèete un au bon locus.
55
que peut ont faire avec les outils de KO ?
remplacer un géne remplacer un promoteur avec celui d'un autre gene
56
+/- trangénique ?
+ : facile et rapide : expression transgene élevé - : inserer aléatoire = environnement peut influencer l'Expression : utilisé pour rajouter un gene, mais pas enlever ou remplacer
57
+/- KO/KI?
+ : expression proche de la réatlité endogène : peu d'effet reste genome : utilisable remplacer ou éliminer gène - : expression basse (Ex. fluo) : Gène rapporteur nécessite production d'une construction qui permet le maintient du gène endogene : plus de temps et d'effort à obtenir
58
a quoi sert CRISPR
inserer gene a une location specifique pour cibler des compartiment cellulaire ou des types de cellules
59
C'est quoi un type cellulaire ?
ddépend qui ont demande: - anatomie - fonction - génétique
60
+/- cellule spécifique à un promoteur
promoteur peuvent aire une faible expression = bad majorité des promoteur sont mal definie et trop large pour etre insérer dans un plasmide
61
comment fonctionne le systeme cre-lox
Cre catalyse la recombinaison entre site LoxP -> Systeme a besoin d'un tissus spéciique expression Cre et LoxP exons (KO) ou KI -> permet de cibler les recombinaisons à des sites spécifiques avec CRE
62
possible de mettre deux promoteur pour cibler cellules en culture mixte ?
Oui
63
comment on peut éliminer les neurones dopa d'une région?
en utilisant AAV
64
But excision et insertion?
éliminer un gène -----> + boucle
65
But inversion?
activer ou désactiver gene -> cre <----->
66
Possible retourner en arrière avec flip ?
non
67
c'est quoi brainbow mouse?
des paires Lox incompatible sont intercalé générant des patrons d'excisin ou inversion de facon aléatoire -> meme promoteur -> permet visualiser plusieurs cellule indépendanmment autres cllule et retracer les circuits

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