Génétique 6 (intro au diagnostic moléculaire) Flashcards
Définition du diagnostic moléculaire?
Diagnostic des pathologies causées par des variations pathologiques d’un gène, de plusieurs gènes (digénisme) ou de l’épigenome
~ ___ nouveaux tests cliniques disponibles par jour
10
Combien de tests disponibles en ce moment?
Plus de 60 k
Combien de gènes sont couverts par nos tests?
10%
Décrit l’ADN.
nb de liens H, charge et constitution
Acide nucléique = sucre + phosphate + base
Charge négative (phosphate)
Liens hydrogène
* G-C : 3
* A-T : 2
Importance du phosphate qui confère une charge négative à l’ADN.
Important pour isolation/extraction de l’ADN
Importance de connaitre le nombre de liens hydrogénés entre les bases de l’ADN.
Important pour PCR/hybridation
Pour dénaturer ADN, besoin de plus d’énergie pour briser ( + d’Énergie pour 3 liens H que juste 2 liens H)
Décrit la structure du gène, de gauche à droite.
Promoteur
5’ UTR
Codon d’initiation
Exon (GT)
Intron
3’ UTR
Codon STOP
Début d’intron?
GT
Début d’exon?
AG
Qu’est-ce qu’une variabilité du génome non pathologique?
Toute divergence de séquence d’ADN chez un individu en comparaison avec la séquence de référence n’étant pas associée à une pathologie génétique
Qu’est-ce qu’une variabilité du génome pathologique?
Un changement permanent et transmissible de la séquence d’ADN causant un phénotype pathologique
Est-ce qu’on possède beaucoup de variations sur notre génome?
Oui
plus de 5-6 M
Est-ce que nous possédons les même variations génétiques que nos parents?
NON
~70 surviennent de novo, i.e. sont absentes chez les parents
contribue à diversité génétique
Est-ce que la plupart de nos variations sont pathologique?
Non
Que peuvent être les variations non pathologiques?
1) Dans régions non codantes (régions intergénique, introns)
2) Polymorphisme
3) Touche un gène qui s’exprime seulement à l’état récessif et il n’y a pas une seconde variation
Endroit de prédilection pour la survenue de variations génétiques.
Ilots CpG
Décrit les mutations qui peuvent survenir au niveau des îlots CpG.
C →methyl-C (methylation)
Methyl-C →U (PAS de U dans ADN)
U→T
CG → TG (le + fréquent)
deux types de marqueurs génétiques utilisés en génétique moléculaire pour étudier la variabilité génétique au sein des populations
moyenne: microsattelittes
petite: SNP (polymorphismes nucléotidiques simples)
Que sont les microsatellites?
Répétition d’une petite séquence (ex: CA)
Pk les microsatellites sont des marqueur très puissants pour établir l’identité génétique?
À l’emplacement spécifique du microsatellite sur le chromosome, il y a environ dix variations différentes de la séquence génétique.
Dans une population donnée, les individus auront des versions légèrement différentes de cette séquence microsatellite à cet endroit précis sur leur ADN. Cette diversité au niveau des allèles est courante dans les populations et contribue à la variabilité génétique.
Que sont les SNP?
Changement d’un seul nucléotide / un seul nucléotide est remplacé par un autre
Par exemple, à un certain endroit, certains individus peuvent avoir un “A” à cet emplacement, tandis que d’autres auront un “G”.
Entre les microsatellittes et les SNP, quel type de marqueur est particulièrement utile pour étudier la diversité génétique?
LES MICROSATELLITES
Ils sont généralement plus polymorphes, ce qui signifie qu’ils ont tendance à avoir un plus grand nombre d’allèles différents au sein d’une population.
Quelle mutation est la plus fréquente?
Substitution
+ de la moitié des mutations
Nomme les 4 conséquences possibles des variations.
1) Homologue (silencieux)
2) Faux-sens (missense)
3) Non-sens (nonsense)
4) Altération du cadre de lecture (frameshift)
Homologue?
Change un codon pour un autre codant pour le même acide aminé
Faux-sens?
Change le codon pour celui codant pour un autre acide aminé
Non-sens?
Change le codon pour un codon stop
Frameshift?
Insertion/délétion qui n’est pas un multiple de 3, entraînant une modification du codon et de ceux en aval
5 éléments à considérer pour évaluer le degré de danger d’une mutation?
1) Fréquence population
2) Conservation
3) Impact ARNm
4) Impact sur la protéine
5) Fonction du gène
V ou F: une mutation homonyme est habituellement pathologique.
FAUX: habituellement bénin
pas de changement au niveau de la protéine
sont tolérées, pas à l’origine de pathologie patient
V ou F: une mutation non-sens ou frameshift est habituellement pathologique.
VRAI
V ou F: une mutation faux-sens est habituellement bénin.
FAUX: ambiguïté par rapport à cette mutation; variable
Gène récessif?
Le phénotype est exprimé seulement à l’état homozygote
Gène dominant?
Le phénotype est exprimé à l’état hétérozygote
Perte de fonction?
Une réduction dans la quantité de la protéine produite, ou une réduction de l’activité de la protéine
cause le phénotype
V ou F: la perte de fonction est la base de la majorité des maladies récessives (et certaines dominantes).
VRAI
Gain de fonction?
Une augmentation dans la quantité de la protéine produite, une augmentation de l’activité de la protéine ou une nouvelle fonction de la protéine entraîne le phénotype
Nomme les 5 mécanismes associés aux gains de fonction.
1) Augmentation du dosage génique
2) Altération de l’expression de l’ARNm
3) Activité accrue de la protéine
4) Nouvelle fonction de la protéine
5) Altérations toxiques à la protéine
3 exemples de maladie génétique causées par une expansion anormale de trinucléotides (mutations dynamiques)?
1) Steinert
2) X fragile
3) Huntington
But de l’isolation génétique?
Isoler l’ADN du reste du contenu cellulaire (majoritairement protéines)
Quelles cellules sont utilisées pour l’isolation de l’ADN?
Cellules nucléées (sang: leucocyte)
De quoi faut-il se servir pour isoler l’ADN?
Il faut se servir des caractéristiques spécifiques de l’ADN p/r au reste du contenu cellulaire
Nomme les deux produits utilisé pour isoler l’ADN.
1) Phénol-Chlorophorme
2) Sels chaotropiques
Que fait l’ADN en présence de sels chaotropiques?
à cause de sa charge négative, l’ADN se colle sur la colonne de verre/membrane
Que font les autres substances en présence de sels chaotropiques?
solubles dans l’eau (le reste ne se colle pas au verre/memnbrane)
on se débarrasse de tout ce qui est pas ADN
Avantages des sels chaotropiques?
Non-toxique
Automatisable
Nomme les deux technique qui permettent d’évaluer l’efficacité de l’isolation de l’ADN.
1) Densité optique
2) Teintures intercalantes (SYBR Green, Pico Green, bromure d’éthidium)
Quelle est l’absorbante maximale de l’ADN (nm)? Et celle des protéines?
λ 260nm = absorbance max ADN
λ 280mm = absorbance max pour protéines
Importance de la densité optique.
Estimation de la quantité de l’ADN (ratio 260/280 estime pureté)
À quoi servent les teintures intercalantes?
Composés qui se fixent à l’ADN double brin
Estimation de la quantité et de la taille de l’ADN
Principe de l’hybridation:
On construit une séquence de nucléotides complémentaire à une portion de l’ADN du patient (sonde)
Elle est marquée (fluorescence, radioactivité)
La détection du signal indique la présence de la séquence complémentaire
De quoi est formé la sonde?
Séquence d’ADN complémentaire
Marquage (fluo, radioactif)
La détection du signal indique la présence de la _____________________.
séquence complémentaire
Qu’est-ce que l’électrophorèse capillaire?
On sépare les molécules d’ADN selon leur taille en les faisant migrer à travers un gel (e.g. Agarose)
Lors de l’électrophorèse capillaire, qu’est-ce qui influence la distance parcourue par les molécules à travers le gel?
grosse molécules prennent + de temps à circuler donc migrent sur - longue distance
molécules qui ont migrer sur plus longue distance = plus petites
Nomme une technique sur l’ADN génomique.
Buvardage Southern
Explique les 5 étapes du buvardage Southern.
A. Digestion de l’ADN génomique
B. Électrophorèse capillaire
C. Transfert sur membrane
D. Hybridation
E. Détection par autoradiographie
Explique cette figure:
Gène normal mesure 250 pb
Si j’ai une délétion de 8pb, je me retrouve avec 242 pb (DÉLÉTION RÉCURRENTE)
Individu a un allèle avec nombre de pb normal et un avec pb mutées = hétérozygote
Lien entre PCR-migration et contamination foeto-maternelle
Mère a deux allèles pour un micro satellite
Le foetus normal va avoir le même allèle que sa mère et un allèle de son père (2e allèle maternel ne se retrouve pas chez ;le foetus)
Si il y a contamination avec sang de la mère; il y a aura un allèle de la mère, un allèle du père ET une portion de l’autre allèle de la mère (petit pic)
Principe de PCR-digestion
Digestion d’un produit de PCR par une enzyme de restriction qui reconnaît une séquence spécifique dans l’ADN
Si il reconnait sa séquence spécifique, il coupe l’ADN
ex: EcoR1 coupe à G_AATTC & Dra I coupe à TTT_AAA
Impact d’une mutation de l’ADN sur l’enzyme de restriction.
mutation peut créer ou abolir site de restriction d’une enzyme. Allèle n’ayant pas la mutation A le site de restriction, mais c’elle qui a la mutation n’a PAS le site de restriction
en utilisant l’enzyme de restriction sur produit de PCR, on obtient une bande de taille attendue suite à migration.
Si il y a changement d’une pb (exemple: on change un T pour un C) -> à D sur figure, l’enzyme de restriction ne reconnait plus et ne couple plus (on aura un plus gros fragment et pas ce a quoi on s’est attendu)
Comment se fait l’Allele Specific Primer Extension?
Amplification PCR avec amorces marquées à fluorescence dont certaines ont un mismatch en 3’
En somme, l’amorce est utilisée pour initier la synthèse d’une nouvelle chaîne d’ADN, et si la séquence d’ADN complémentaire est présente, une sonde spécifique peut se lier à cette séquence et émettre un signal fluorescent, permettant ainsi la détection et l’identification spécifique de la séquence cible.
Différentes sondes associées à différents allèles.
Impact de l’ajout de ddNTP sur la réaction de synthèse d’ADN.
L’ajout de ddNTPs arrête la réaction de synthèse d’ADN à des positions aléatoires, car ces nucléotides modifiés ne permettent pas la poursuite de la chaîne.
Ainsi, chaque brin en cours de synthèse s’arrête à des positions différentes.
Le résultat est une série de fragments d’ADN de longueurs variables, tous marqués avec une couleur spécifique associée au nucléotide modifié incorporé.
5 étapes de MLPA.
1) dénaturation
2) Hybridation des deux portions de la sonde
3) Ligation des deux portions de la sonde via la ligase
4) Amplification PCR de la sonde fusionnée
5) Électrophorèse capillaire
