Fundamentos de la PCR cuantitativa en tiempo real Flashcards
¿Qué es la PCR y quién la desarrolló?
La PCR (reacción en cadena de polimerasa) es una técnica de replicación in vitro de una molécula de ADN, desarrollada por Kary Mullis en 1983.
¿Qué delimita la longitud del fragmento que se desea replicar en una PCR?
Los primers (cebadores u oligonucleótidos).
¿Cuál es el objetivo de la PCR convencional y cómo se evalúa?
Amplificar una región genética específica, evaluándose mediante gel de agarosa o acrilamida.
¿Cuál es la diferencia entre PCR cualitativo, semicuantitativo y cuantitativo?
Cualitativo: Identifica la presencia o ausencia de un fragmento específico. -> enfermedades infecciosas
Semicuantitativo: Mide niveles de expresión génica (ARNm). -> biopsias
Cuantitativo: Mide la cantidad de microorganismos o ARNm específico, usando una curva de referencia.
¿Qué es la PCR múltiple?
Es una PCR que amplifica varias regiones génicas en una sola reacción, usando pares de oligonucleótidos específicos para cada región.
¿Cuáles son los principios básicos de la PCR?
Complementariedad de bases.
Dirección 5’ → 3’ (requiere un extremo 3’ libre).
¿Cuáles son las tres etapas principales de la PCR?
- Desnaturalización.
- Alineamiento.
- Elongación.
¿Qué componentes se requieren para una reacción de PCR?
ADN, primers, DNA polimerasa, dNTPs (en forma trifosfatada) y magnesio como cofactor.
Describe las temperaturas y tiempos típicos en el proceso de PCR.
- Inicio de desnaturalización: 95°C, 5 min.
- Ciclos de amplificación:
• Desnaturalización: 95°C, 30 s.
• Alineamiento: 50-60°C, 30-40 s.
• Extensión: 72°C. - Amplificación final: 72°C.
- Almacenamiento temporal: 4°C.
¿Qué es la PCR en tiempo real y quién la describió?
Higuchi et al. en 1992 describieron la PCR en tiempo real, una modificación que permite observar en tiempo real el crecimiento de la curva de amplificación.
¿Cómo se detecta la amplificación en PCR en tiempo real?
Mediante fluorescencia:
• SYBR Green: Se intercala en el ADN de doble cadena y emite fluorescencia al ser excitado con láser.
• TaqMan: Utiliza un fluoróforo y una sonda específica para detectar SNPs.
¿Cuáles son las etapas de la amplificación en PCR en tiempo real?
Desnaturalización, alineamiento y extensión.
¿Qué permite la detección en PCR en tiempo real?
La detección se realiza mediante fluorescencia.
¿Qué es el SYBR Green en PCR en tiempo real?
Un intercalante de DNA que emite fluorescencia cuando se incorpora en el DNA de doble cadena al ser excitado por un láser.
¿Para qué se usa SYBR Green en PCR en tiempo real?
Para cuantificar la expresión genética.
