flödescytometri Flashcards
Vad är flödescytometri?
Kvalitativ och kvantitativ mätning av enskilda celler i stor skala i ett vätskeflöde.
Mätningen är den av fysikaliska, kemiska och cellulära egenskaper hos den enskilda cellen samt cellkomponenter.
Vilka parametrar kan man mäta med flödescytometri?
Cellstorlek Cytoplasmatisk granularitet DNA-mängd RNA-mängd DNA-cellcykel - viktigt vid onkologi Cytoplasmatiskt immunoglobulin - Istället för mätning i blod. Gen expression Sortering av celltyper
=> Därav har flödescytometri många användningsområden.
Vad behövs i ett flödescytometriskt instrument?
- Ett flödessystem för hydrodynamisk fokusering.
- Optiska filter och detektorer.
- Laserstråle
Hur fungerar en flödescytometer?
- Celler passerar flödessystemet och hydrodynamisk fokusering sker => celler passerar mätningspunkten en och en.
- Då en enskild cell träffas av lasern exciteras och emigreras de fluorokromer man använts samtidigt som ljuset splittras på olika sätt.
- Ljuset fokuseras av en lins och selekteras genom optiska filter.
- Det selekterade ljuset detekteras med optiska detektorer.
Hur kan man mäta cellens storlek med en flödescytometer?
Genom att mäta magnituden av forward scatter då cellen passerar mätpunkten. Magnituden av forward scatter är proportionell med storleken på cellen. Det splittrade ljuset detekteras av detektorer som omvandlar ljusintensitet till volt som sedan bli ett numeriskt värde.
Hur kan man mäta cellers granularitet med en flödescytometer?
Genom att mäta mängden av side scatter då cellen passerar mätningspunkten. Magnituden av side scatter är proportionell med cellens granularitet.
Hur kan man analysera splittrat ljus?
Antingen i ett histogram eller i en s.k. dot - plot.
Vad menas med gating?
Då man boxar in den population man är intresserad av att analysera.
Storleksranka de vanligaste blodcellerna.
Erytrocyter(lyseras oftast bort innan mätning) och trombocyter
Lymfocyter
Granulocyter (komplexa)
monocyter
Vad är fluorescens?
Fluorescens bygger på principen att ett ämne (fluorokrom) som exciteras av fotoner emitterar ljus vid en viss våglängd beroende på fluorokrom.
Då en atom träffas av fotoner exciteras dess elektroner till högre energinivåer. När de sedan hoppar tillbaka emitteras ljus som kan detekteras.
Hur kan fluorescens användas vid flödescytometri?
Användningen av principen för fluorescens används tillsammans med monoklonala antikroppar för att exempelvis kunna skilja mellan olika lymfocyter beroende på dess ytmolekyler.
Monoklonala antikroppar är specifika för olika ytstrukturer som exempelvis olika CD. Om man märker en monoklonal antikropp med en fluorokrom kan man detektera när antikroppen binder till ytmolekylen.
Genom intensiteten av av fluorescensen kan man fastställa hur stor populationen är av en typ av lymfocyt.
Vad menas med överlappning?
Felkälla vid flödescytometrisk mätning.
En överlappning mellan olika fluorokromers emitterade ljus kan göra att resultat ser mer positivt ut än vad det egentligen är.
Vid överlappningen går kurvorna för det emitterande ljuset ihop. Vid analys utav ena av kurvorna finns då risken att fluoressens från en annan kurva tas med i resultatet som då kan bli falskt positivt.
Hur löser man problemet med överlappning?
Genom kompensation för överlappningen med exempelvis användning av standardiserade kulor med fluorokromer på.
Vilka CD-molekyler har: T-celler Th-celler Tc-celler B-celler NK-celler
T-celler - CD3 Th-celler - CD4 Tc-celler- CD8 B-celler - CD19 NK-celler - CD56
Hur kan man analysera data från en flödescytometri?
Genom en dot plit med FSC p X-axeln och SSC på y-axeln kan man fastställa storlek och granularitet. Genom erfarenhet kan då då fastställa typ av blodcell.
Genom ytterligare en dot plot där man har fluorokromer för olika CD- molekyler kan man fastställa merspecifikt typ av cell. Ex. CD3 och CD19 kan tala om huruvida det är en T-cell eller B-cell.
Sedan CD4 och CD8 kan tala om vilken typ av T-cell.
ect.
