Extraction et filtration Flashcards
Qu’est-ce que la purification?
Méthodes employées pour éliminer les contaminants selon les caractéristiques de la substance à purifier
Les méthodes varient selon la substance: veut-on conserver sa structure? Que veut-on analyser? (Activité, structure, taille, masse moléculaire)
Quelle est la première étape de la purification?
Lyse des cellules pour libérer leur contenu dans un tampon de lyse
À quoi devons-nous adapter les techniques d’extraction?
- Type de matériel (organe, tissus, cellules)
- Type de cellules
- Volume à extraire
- Nature de ce que l’on veut purifier
Vrai ou faux? On peut combiner plusieurs traitements d’extraction
Vrai!
Comment peut-on retirer le milieu de croissance des cellules?
Suspension: centrifugation basse vitesse
Adhérente: trypsination pour les décoller, puis centrifugation basse vitesse
Comment peut-on traiter les tissus?
Premier traitement grossier sans tampon pour briser le tissu en morceaux, puis traitements dans un tampon de lyse pour briser les cellules
Quels sont les avantages du mortier et pilon?
Pré-traitement très rudimentaire pour les tissus rigides (surtout végétaux)
Peu coûteux
Brise bien les tissus
Broyage à sec
Pas de chaleur
Quels sont les avantages du mélangeur (blender)
Pré-traitement grossier de tissus animaux ou de végétaux durs
Grands volumes
Peu coûteux
Attention à la chaleur
Quels sont les avantages du rotor-stator?
Grande variété de modèles
Rapide
Efficace
Homogénat uniforme
Tissus mous, grande étendue de volumes
Lyse cellules sans briser organelles
Attention chaleur
Quels sont les avantages du Dounce/Potter?
Appareil de prédilection pour la lyse douce
Cellules eucaryotes et tissus mous
Automatisé (Potter), faibles volumes
Ne brise pas organelles
PAS BACTÉRIES NI LEVURES À PAROI RIGIDE
Quels sont les avantages de l’homogénéisateur à bille?
Cellules en suspension
Faibles volumes
Briser cellules difficiles à lyser
Attention chaleur
Quels sont les avantages de l’homogénéisateur haute pression?
Briser cellules difficiles à lyser
Petits volumes
Suspensions de cellules
Quels sont les avantages de la sonification?
Attention chaleur
Très efficace pour briser cellules difficiles à lyser
Suspension cellules
Homogénat très uniforme
Brise organites
Fragmentation ADN
Quels sont les techniques d’extraction mécaniques?
- Mortier et pilon
- Blender mécanique
- Rotor-stator
- Dounce/Potter
- Bead beater
- Homogénéisateur haute pression
- Sonification
À quoi servent les traitements enzymatiques?
Briser la MEC des tissus
- Collagénase, trypsine, pectinase
- Isoler cellules intactes
- Pré-traitement dans tampon adapté
Quels sont les caractéristiques des traitements enzymatiques pour fragiliser les parois?
Cellules difficiles à lyser -> dégradation paroi
- Lysozyme, zymolyase, cellulase
Tampon adapté
Combinaison avec lyse douce
Quels sont les avantages du choc osmotique?
Lyse de cellules animales
Solution hypotonique: cytolyse, car l’eau entre en grande quantité dans la cellule pour équilibrer les concentration, la faisant ainsi exploser
Quelles sont les caractéristiques des détergents?
Composé amphiphile (queue hydrophobe et tête hydrophile)
Ionique ou non ionique
Incorporation dans la membrane
Qu’est-ce qu’un agent chaotropique?
Molécules ayant un fort pouvoir dénaturant
- Déstabilisation interactions hydrophobes
-Déstabilisation ponts H
Efficace contre protéines insolubles, dénaturation acides nucléiques
Ex: Urée, phénol, Guanidine + HCl
Qu’est-ce qu’un tampon de lyse?
Solution dans laquelle on met notre échantillon à extraire/purifier quand on veut PRÉSERVER la conformation/activité/structure
- Milieu physiologique avec système tampon
- Lyse douce
- Travail sur glace pour inhiber activité enzymes cellulaires
- Réactifs RNase/DNase-free si on purifie des acides nucléiques
- Inhibiteurs de protéases si on purifie des protéines
- Agents réducteurs, car l’air est un milieu très oxydant
À quoi sert la purification?
Tenter d’isoler la composante cellulaire d’intérêt le plus possible pour pouvoir l’étudier
Comment fonctionne la dialyse?
On met notre solution dans un sac avec une membrane semi-perméable. Ce sac est dans un tampon de contre-dialyse qui est dépourvu de contaminants que l’on cherche à retirer de notre solution initiale. En suivant leur gradient de concentration, les “contaminants” diffusent à travers la membrane et vont dans le tampon de contre-dialyse jusqu’à atteindre l’équilibre.
Quelles sont les caractéristiques de la filtration?
Filtre avec grande porosité
Basse pression
Retrait débris cellulaires, bactéries et résidus solides
Après extraction, avant purification
Qu’est-ce que l’ultrafiltration?
Filtre à très petite porosité
Concentration de macromolécules
Élimination petites molécules
Changement de tampon
Petits volumes
