Extração de DNA, PCR, eletroforese e Marcadores Moleculares Flashcards
Qual o marcador molecular baseado na variação de sequência de nucleotídeos em uma única posição do genoma?
SNP (Single Nucleotide Polymorphism)
Uma das principais vantagens dos marcadores SNP é:
A capacidade de detecção em larga escala e alta reprodutibilidade.
Qual é o principal objetivo do uso de detergentes no processo de extração de DNA
Dissolver a membrana celular e liberar o conteúdo intracelular.
Durante a extração de DNA, qual reagente é frequentemente utilizado para precipitar
o DNA?
Etanol ou isopropanol.
A migração dos fragmentos de DNA na eletroforese depende principalmente de:
O tamanho do fragmento e a carga elétrica do DNA
O que é necessário para a reação em cadeia da polimerase (PCR)?
DNA molde, primers, DNA polimerase e nucleotídeos livres.
Qual enzima é comumente usada na PCR por sua resistência ao calor?
DNA polimerase Taq.
Defina o que são marcadores morfológicos e o que são marcadores moleculares.
Aponte ao menos 2 pontos positivos e 2 ponto negativos de cada técnica.
Marcadores morfológicos: são características observáveis ou quantificáveis de um organismo.
Podem ser usadas para identificar diferenças genéticas entre indivíduos ou populações. Ex.
quantidade de leite produzido por uma vaca, resistência do animal a determinada doença.
Pontos positivos: Normalmente são visualmente identificáveis e normalmente tem custo baixo.
Pontos negativos: Sofrem influência ambiental e podemos observar um número limitado de
marcadores (aqueles que de fato são relacionados à características do animal).
Marcadores moleculares: São sequencias especificas de DNA, RNA ou proteínas que indicam
diferenças genéticas entre os organismos. Ex. RAPD, SSR, SNP, etc.
Pontos positivos: alta precisão (detectam diretamente as diferenças no material genético) e
abundância e diversidade (há um número muito maior de marcadores moleculares em relação
aos morfológicos, pois estes tem a possibilidade de cobrir todo o DNA)
Pontos negativos: custo elevado e necessidade de expertise técnica (requer equipamentos caros
e pessoal capacitado para realizar as análises)
Explique o que é e como ocorre a Reação em Cadeia da Polimerase para amplificação
de um DNA com um primer RAPD
Desnaturação do DNA (94º - 96º C) O DNA dupla hélice é separado em duas fitas simples;
Anelamento (40º - 50º C) O primer RAPD se liga a regiões complementares a ele no DNA
molde. A temperatura mais baixa que o normal por conta do tamanho do primer e da sua
característica de ser randômico, ou seja, se liga a regiões complementares a ele, mas que não
são conhecidas dentro do genoma.
Extensão (72º C) A DNA polimerase sintetiza uma nova fita de DNA a partir do primer.
O processo se repete por em média 30 a 40 vezes.
Vantagens da RAPD-PCR: Simplicidade (não requer conhecimento prévio do genoma a ser
amplificado); baixo custo (usa primers curtos e inespecíficos, reduzindo os custos com
sequenciamento, por exemplo)
Desvantagens: reprodutibilidade variável (pequenas mudanças na temperatura podem alterar os
padrões de bandas); inespecificidade (amplificação depende de regiões complementares ao
acaso, podendo gerar resultados inconsistentes).
De que forma a eletroforese em gel de agarose pode ser utilizada para verificar a
qualidade e o tamanho de fragmentos de DNA?
: a eletroforese é útil para verificar a qualidade e o tamanho de fragmentos de DNA
pois ela leva à separação do DNA por tamanho. O DNA após extraído, é misturado a um corante
que facilita sua visualização e aplicado no gel (de agarose ou poliacrilamid) submerso em
tampão; o campo elétrico é ativado e as amostras de DNA (com carga negativa) migram no gel,
do polo negativo até o polo positivo. Durante este deslocamento, os fragmentos maiores ficam
“presos” na malha do gel e migram mais lentamente, enquanto os fragmentos menores migram
mais rápido, separando assim, as amostras por tamanho. Um marcador de tamanho conhecido
é inserido para ser usado como base para a inferência dos tamanhos dos fragmentos do DNA
de interesse. Após a corrida, o gel é levado ao trans iluminador para visualização e fotografia
das bandas
Como a escolha do tipo de marcador molecular pode influenciar os resultados de
estudos de diversidade genética?
a escolha do tipo do marcador é crucial para estudos genéticos; estudos de
diversidade genética de populações, por exemplo, podem acontecer com marcadores mais
informativos, como ISSR, SSR, REMAP, IRAP e até RAPD, enquanto, estudos que buscam
diversidade genética em regiões específicas precisam de marcadores que amplificam a
sequencia alvo, como SNP por exemplo.
Em uma análise de diversidade geral, normalmente buscamos por polimorfismos, então,
analisamos as bandas e consideramos as bandas polimórficas informativas, anotando a
diferença entre os indivíduos para cada banda analisada. Enquanto, um marcador como o SNP,
por exemplo, nos da informação da presença ou ausência da sequência, podendo ser usado para
análises mais detalhadas, como de genes relacionados à tipagem sanguínea por exemplo
