examen finale Flashcards
quel enzyme est responsable de la bioluminescene
luciférase
quelle substrat produit la lumière (réaction)
oxidation de FMNH2 en FMN
quel type de méthodes de manipulation on utilise avec les bactérie
aseptiques
quel réactifs dans une réaction peuvent fluctuer un peu sans affecter
ADN et enzyme
quel réactif ne peut absolument pas changer la concentration sans affecter l’efficacité de la réaction
tampon (pH et sels…)
pourquoi travailler avec des bactéries est avantageux
temps de dédoublement faible –> grande population vite, plusieurs générations vite, peut avoir bcp d’ADN et de protéines à extraire en peu de temps
dans quel genres les bactéries fluorescentes se retrouvent
photobactérium
shewanella
vibrio
3 caractéristiques physique/morphologique de bactéries fluorescentes
gram -
motile rods
métabolisme fermenteur
qu’est-ce qu’est des endonucléases de restriction
enzymes qui reconnaissent une séquence spécifique d’ADN et clivent à un endroit spécifique dans cette séquence, qui produit des fragments de restriction
quel type de séquence les enzymes de restriction reconnaissent
palindromiques
quel 2 types de coupure on peut avoir avec enzyme de restriction
blunt et sticky
complémentarité des blunt et sticky ends
blunt avec n’importe quel blunt
sticky seulement avec même enzyme car complémentarité des bases
fonction du lysozyme
dégrade les peptidoglycanes
fonction de EDTA
inactive les DNases
disrups la membrane externe
fonction de détergent et exemple
SDS
lyse cellulaire
fonction de phénol ou chloroform
séparer l’ADN des autres macromolécules
fonction pronase ou protéinase K
enlever encore plus les protéines
comment on précipite les acides nucléiques
éthanol
6 précautions pour faire sur que les DNases sont inactivés
tampon avec pH un peu basique (<8) EDTA (chélate Mg2+) SDS (réduit activité par dénaturation) garde au froid protéinase K étape de chaleur qui dénature DNase mais pas ADN
méthode pour lyser les cellule quand on veut un petit (<10kb) plasmide
bouillir
méthode basique
on peut être plus dure sur les cellules
méthode pour lyser les cellules quand on veut un plus grand plasmide (>10kb)
lyse par détergent (SDS ou triton)
deux grandes différences dans l’isolation d’ADN chromosomique vs plasmidique
la taille (chromo>>plasmide) plasmide casse pas avec manipulation (circulaire)
PEG fonction
précipite l’ADN plasmidique
quel méthode on utilise pour doser l’ADN/ARN
spectrophotométrie à UV (260nm)
quel longueur d’onde les protéines absorbent
280nm
ratio de pureté A260/A280
1,8
ratio de pureté A260/230
2-2,2
comment construire une librairie d’un génome
digérer le plein génome d’ADN avec un enzyme de restriction
–> si on veut cloner un gène, s’assurer que l’enzyme ne coupe pas au milieu du gene!!!
problemes potentiel et solution de cloner un gène d’une librairie
enzymes de restriction sont hab 6pb (coupe chaque 4kb) donc tres possible que séquence sois dans gène
faire sur que %GC compatible, dilué enzyme pour moins de coupure, diminuer le temps de digestion
quel composante est nécessaire pour avoir la transcription du vecteur dans l’hote?
origine de réplication compatible avec l’hote qu’on insere le vecteur
5 types de vecteurs commun
plasmide bactériophage cosmide phagmides chromosome artificiel
comment on trie pour les vecteur dans hote
gène de résistance (souvent à ampiciline)
comment on visualise la transformation
habituellement le gène de lac Z et b-galactosidase, donc tourne bleu lorsque non transfecter (sites des enzymes de restriction sont dans le gène de l’enzyme)
DNA ligase catalyse quel réaction
la réaction de synthèse du lien ester entre le 3’-OH et 5’-P des 2 molécules d’ADN
combinaisons de produits possible après ligation
vecteur refermer circulariser le gène vecteur + gène vecteur + vecteur gène + gene etc....
comment on controle les produits
différents ratios d’ADN plasmide vs ADN d’intéret
ratio vecteur : insert habituellement plus efficace
1:3 (3x plus d’ADN insert que vecteur)
comment on induit la compétence dans nos bactérie
avec des cations comme la chlorure de calcium
si colonie bleu
pas d’insert dans vecteur mais bactérie transformer
si colonie blanche
transformer avec un vecteur qui contient un gène
le nombre de clone qu’on a besoin pour avoir notre gène d’intéret dépend de (3)
taille du génome
taille moyenne des insert
fréquence d’occurence du gène d’intéret dans le génome original (hab 1)
si on a des plus grand fragments du génomes on a besoin de _____ de colonies afin d’avoir probablement le vecteur qui le contient
moins
comment on détecte l’insert voulu si gène est exprimer dans hote (3)
complémentation d’un défaut génétique
Ac qui reconnait le produit
activité enzymatique (si gène est enzyme)
pourquoi pas exprimer gène n’est pas exprimer chez l’hote (6)
pas de promoteur mauvais cadre de lecture mauvaise orientation du gène promoteur non reconnu peptide mal replié toxique à l'hote
quel est la meilleur option pour détecter un gène et s’assurer que c’est le bon insert
hybridization des acides nucléiques (détection de la séquence)
quel méthode on utilise pour la purification des plasmides
mini-prep (utilise petits volumes)
2 méthodes pour isoler l’ADN plasmide de chromo
lyse basique
bouillage rapide
matériel qu’on a besoin pour une PCR
amorces
ADN polymérase
dNTP
Mg2+
étapes + températures de PCR
dénaturation 94
ligation des amorces environ 60
amplification 72
fonction controle colonie TE
ctl pour ampiciline
fonction ctl pGEM non digerer
ctl pour compétence
ctl pGEM digérer
ctl pour digestion du vecteur (pas de colonies)
pourquoi on utilise pas IPTG
plamide contien pas LacI qui inhibe la transcription et IPTG inhibe LacI…
