Examen final Flashcards
Quelles sont les 5 catégories de techniques de diagnostic de laboratoire?
- Méthode microscopique
- Méthode biologique
- Méthode biochimique
- Méthode immunologique
- Méthode moléculaire
De quoi est composé un nucléotide?
Il comprend:
* Désoxyribose (un sucre avec 5 carbones)
* Un groupement phosphate (attachée au C5)
* Une base azotée (attachée au C1)
Quels sont les 3 partie d’un nucléotide dans la photo suivante et quel est le nom de ces parties?
- À gauche il y a le groupement phosphate
- Au centre c’est le désoxyribose (sucre)
- À droite c’est une base azotée
Donne-moi une description de la structure de l’ADN
- La molécule d’ADN est composée de 2 brins
- Ils sont placés de façons à ce que les bases azotées soient l’une vis-à-vis l’autre. Les 2 brins sont antiparallèle
Comment fonctionne le mécanisme de réplication de l’ADN?
1) Une hélicase déroule la double hélice parentale.
2) Les molécules de protéines fixatrices d’ADN monocaténaire stabilisent les brins matrices qui ont été séparés.
3) Le brin directeur est synthétisé de façon continue dans le sens 5’ vers 3’ par l’ADN pol III.
4) La primase commence la synthèse de l’amorce d’ARN pour le cinquième fragment d’Ozaki.
5) L’ADN pol III termine la synthèse du quatrième fragment. Quand elle atteint l’amorce d’ARN sur le troisième fragment, elle se détache et commence à ajoute des nucléotides d’ADN à l’extrémité 3’ de l’amorce du cinquième fragment.
6) L’ADN pol I enlève l’amorce de l’extrémité 5’ du deuxième fragment et le remplace par des nucléotides d’ADN qu’elle ajoute un à un à l’extrémité 3’ du troisième fragment. Le remplacement du dernier nucléotide d’ARN par l’ADN laisse une extrémité 3’ libre au squelette désoxyribose phosphate.
7) L’ADN ligase joint l’extrémité 3’ du second fragment à l’extrémité5’ du premier fragment.
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Qu’est-ce qu’un fragment d’Okazaki?
C’est un petit brin d’ADN qui est synthétisé sur le brin d’ADN discontinu (brin d’ADN qui est synthétisé à l’inverse du brin directeur) lorsqu’ils sont mis bout à bout, les brins d’Okazaki forment le nouveau brin d’ADN.
Quel est le rôle de cette enzyme: ADN polymérase I et III?
- ADN polymérase III : Elle forme une nouvelle chaine d’ADN en ajoutant des nucléotides à partir d’un brin matrice existant
- ADN polymérase II: Elle enlève les nucléotides d’ARN de l’amorce et les remplace par des nucléotides d’ADN
Qu’est-ce que l’ARN?
Macromolécules constitué de nucleotides d’ARN.
Qu’est-ce qu’un nucléotide?
En résumé, l’assemblage de nucléotides d’une forme particulière forme les brins d’ADN et d’ARN.
Quel est le rôle de l’ADN ligase?
Elle sert à lier les fragments d’Okazaki sur le brin discontinu pendant la réplication. Elle assure donc la continuité de la nouvelle chaine d’ADN.
Quel est le rôle de l’enzyme ADN hélicase?
Elle sert à défaire la double hélice d’ADN en séparant les brins complémentaires.
Quel est le rôle de l’enzyme primase?
Elle synthétise une amorce d’ARN à l’extrémité 5’
Donne-moi une définition du terme “gène”
C’est comme une recette ou un ensemble d’instructions pour la production d’une protéine spécifique ou la régulation d’une fonction cellulaire particulière.
Explique la technique de la PCR:
C’est une technique qui permet de répliquer rapidement des portions d’une séquence sur un brin d’ADN.
Mettre en relation la technique de la PCR et le processus de réplication de l’ADN
- L’ADN hélicase dans le processus de réplication c’est comme chauffer pour briser les liaisons hydrogènes
- Les protéines fixatrices d’ADN c’est comme le surplus d’amorces
- L’amorce d’ARN c’est l’équivalent des 2 amorces synthétiques
- L’ADN polymérase équivaut à la TAQ
- Les nucléotides triphosphate c’est l’équivalent des dATP, dCTp, dTP et dGTP pour la technique de la PCR
Quelles sont les 3 étapes du cycle d’amplification?
- Dénaturation : on chauffe pour dénaturer l’ADN et séparer les 2 brins complémentaires
- Hybridation des amorces : on baisse la température à un degré spécifique. À cette température, les amorces d’ADN spécifiques à la séquence cible se lient à chaque brin simple d’ADN, en fournissant un point de départ pour l’amplification
- Prolongation des amorces : on augmente la température pour l’activité de la TAQ. Celle-ci utilise les amorces pour synthétiser des nouveaux brins d’ADN
Qu’est-ce qu’une amorce?
C’est une courte séquence d’ADN qui est utilisée comme point de départ pour la synthèse d’une nouvelle chaine d’ADN.
Qu’est-ce que les dntp’s
Ce sont des petits brins d’ADN (des nucléotides) qui flottent dans le microtube et qui seront pris pour faire le nouveau brin complémentaire d’ADN.
Qu’est-ce que la TAQ?
C’est l’ADN polymérase, mais en version synthétique. Elle sert à attacher les nucléotides à l’extrémité du brin en formation de 5’ vers 3’
Expliquer le processus du fonctionnement de l’électrophorèse sur gel
L’ADN porte des charges négatives. Si on la soumet à un courant électrique, elle sera attirée vers la borne positive. Plus le fragment d’ADN est court, moins il est ralenti par le réseau de fibres dans le gel; il parcourt donc une plus grande distance sur le gel.
Pourquoi il est nécessaire de colorer les échantillons avec du bleu de bromophénol avant la mise en puit?
Vérifier que l’échantillon est bien dans le puit et éviter qu’il ne dépasse le gel si on le met sous tension trop longtemps.
Quelles sont les différentes applications de la PCR?
- Taxonomie (différencier 2 espèces trop semblable pour l’identification avec des critères morphologiques)
- Médecine (recherche d’une pathologie)
- Phytopathologie (recherche d’une infection en particulier, avoir la certitude que c’est la bonne maladie qu’on a diagnostiqué)
- Santé publique (covid)
Comment fait-on pour extraire l’ADN d’une bactérie?
- On doit prendre un échantillon de la bactérie en question et la cultiver sur un milieu de culture.
- Préparer des broyats afin de pouvoir amplifier l’ADN
- On doit faire la lyse cellulaire. Ça veut dire qu’on doit briser les paroi des cellules pour libérer l’ADN qu’elles contiennent.
- Dégradation des protéines et solubilisation des lipides et des protéines: on doit dégrader les protéines et les lipides qui pourraient venir interférer avec l’isolement de l’ADN en les solubilisant dans l’eau.
- Précipitation de l’ADN: l’éthanol permet de faire descendre l’ADN dans le fond du tube, puisque l’ADN N’EST PAS SOLUBLE DANS L’ÉTHANOL.
- Séchage: l’ADN est mis dans un SpeedVac qui permet de sécher le restant d’éthanol afin qu’il ne reste que l’ADN.
- Réhydratation: il faut réhydrater l’ADN dans de l’eau pour pouvoir le déplacer dans divers contenants.
Comment fait-on pour colorier et photographier un gel?
Il faut mettre du bromure d’éthidium. Celui-ci s’insère entre les brins complémentaire de l’ADN et en présence de lumière UV, cette molécule devient fluorescente.
En quoi consiste l’échelle de poids moléculaire?
C’est plusieurs fragments d’ADN de taille différente. On peut donc avoir une idée du nombre de paires de bases qui correspond à chaque ligne sur l’échelle de poids moléculaire, puisque c’est une donnée connue lors de l’achat de celle-ci. Il est ensuite possible de comparer les résultats de l’électrophorèse avec ceux de l’échelle et ainsi de savoir combien de paires de bases comporte notre échantillon recherché.
Quels sont les différents problèmes de contamination rencontré lors de la PCR?
- Est-ce qu’on doit avoir un champ stérile? Non, car on utilise des amorces spécifiques. Cependant, on doit stériliser les instruments
- Il faut seulement faire attention à la contamination par de l’ADN que l’on recherche, puisqu’une microgoutte sera détectable et viendra fausser nos résultats.
Pas d’éclaboussures dans un tube adjacent. Attention bout de la pipette.
Quel est l’importance du témoin négatif d’amplification lors de la PCR?
Il sert à mettre en évidence une contamination des réactifs par de l’ADN recherché.
Puisqu’on ne met pas d’ADN dedans, mais juste des réactifs, en théorie il ne devrait pas réagir. Si c’est le cas, c’est signe qu’il y a une contamination dans notre mélange de réactifs.
Quelle est l’importance du témoin positif d’extraction?
C’est un échantillon connu qui va subir toutes les étapes d’extraction et qui servira à valider l’extraction.
Si tout est ok, il devrait fonctionner aussi, donc valider l’extraction.
Quelle est l’importance du témoin positif d’amplification?
C’est un reste d’une EXTRACTION précédante qui à déjà sorti positif. Si notre MasterMix fonctionne, le T+ d’amplification devrait sortir positif encore.
Il sert donc à valider le MasterMix.
Qu’est-ce que la spécificité antigènes-anticorps?
L’antigene présente des déterminants antigéniques différents chaque anticorps peut se fixer sur un seul déterminant antigénique spécifique.
Comment fonctionne le test ÉLISA?
- Les puits sont enduits d’un anticorps.
- L’antigène est introduit
- Un deuxième anticorps muni d’une enzyme est introduite dans le puit
- Un substrat est déposé dans le puit.
Si le substrat réagit avec l’enzyme et produit une coloration, c’est signe que l’antigène est présent.
Un rinçage est fait entre chaque étape. Il permet d’enlever tout les produits qui ont étés mis en surplus et qui n’ont pas été collés au fond du puit avec le premier anticorps.
Comment interpréter les résultats obtenus sur la figure suivante?
Les puits avec une coloration indiquent une réaction de l’anticorps et de l’antigène. Donc, si il y a une coloration, c’est que l’antigène recherché est présent.
Dans la figure ci-dessous, la deuxième série de coloration comporte uniquement 2 puits qui ont réagis. La raison est qu’il n’y a pas eu de PNP (substrat) dans le puit manquant. Le PNP c’est le substrat qui va provoquer une coloration.
Pourquoi utilise-t-on un blanc pour le test ELISA?
Pour connaître la couleur de fond (la couleur des tampons)
Pourquoi utilise-t-on des témoins lors du test ELISA?
- Témoin négatif: vérifier la spécificité et l’absence de couleur en l’absence de réaction
- Témoin positif: pour avoir une couleur de référence
Comment fonctionne la technique de la PCR en temps réel de la fluorescence avec le SYBR GREEN?
Le mélange de réactifs (MasterMix) comprend un marqueur fluorescent.
Le marqueur s’insère entre 2 brins d’ADN.
Durant l’étape d’élongation une augmentation de la fluorescence est notée et on peu la quantifier avec un spectro
Comment fonctionne la PCR en temps réel (qPCR) avec la sonde TAQMAN?
Le reporter émet une fluorescence qui est tout de suite captée par le QUENCHER. La TAQMAN vient se coller sur une certaine séquence du brin d’ADN. Lorsque le brin d’ADN est séparé en 2 pour l’élongation, la primase vient passer par-dessus la TAQMAN. Lorsqu’elle passe au-dessus, elle détache la molécule fluorescente. Puisque le REPORTER est séparée du QUENCHER, il se met à émettre de la fluorescence. Plus l’échantillon est fluorescent, plus il y a de TAQMAN qui à été utilisé, donc plus la quantité d’ADN est importante. Elle peut être mesurée avec un spectro.
Définir marqueur moléculaire et donnez des exemples:
Les marqueurs moléculaires c’est une séquence d’ADN qui est identique chez les individus de la même espèce, mais qui présente de la variabilité entre les espèces différentes.
Quels sont les 2 types de marqueurs fluorescents pour la PCR en temps réel?
Le SYBR GREEN et la sonde TAQMAN
Quelle est la différence entre les 2 type de marqueurs fluorescents de la PCR en temps réel (qPCR)?
- SYBR GREEN: Il n’émet pas de fluorescence au début. C’est juste quand il vient s’attacher entre 2 brins d’ADN complémentaire qu’il commence à émettre de la fluorescence.
- TAQMAN: 2 molécules, 1 qui émmet et l’autre qui absorbe. Quand elles sont séparées, la lumière est émise.
Définir ce qu’est une séquence flanquante?
Une séquence flanquante est une séquences d’ADN qui entoure une région spécifique d’intérêt sur une molécule d’ADN. Ces séquences se situent de part et d’autre de la région cible et peuvent être utilisées comme points de référence lors de diverses analyses génétiques ou moléculaires.
Quelles sont les phases de la réaction qPCR et que fait chaque phase?
- Phase d’amplification: la réplication de l’ADN est enclenchée, mais pas 100% productive
- Phase transitoire: c’est quand la courbe commence à plafonner (à cause qu’il manque de milieu réactionnel)
- Phase stationnaire : il n’y a plus d’amplification
Nommer les caractéristiques d’un marqueur moléculaire et les 3 différents séquences servant de marqueurs moléculaires?
Les marqueurs moléculaires c’est :
- Séquence différente entre les espèces
- Similaire à l’intérieur d’une même espèce
- Encadré de régions flanquantes conservés
- La longueur de la séquence doit permettre les étapes en laboratoire (pas trop longue)
Gène COI : utiliser pour les mammifères et les poissons
Gène 16s : utilisé pour les bactéries
Gène ITS : utilisé pour les champignons
Placer les différentes phases de la réaction de qPCR sur la graphique ci-dessous:
Phase d’amplification, phase transitoire, phase stationnaire.
Expliquez en quoi consiste l’analyse par code-barre génétique et classez en ordre ses différentes étapes.
L’analyse par code-barre génétique consiste à utiliser un marqueur moléculaire distinctif choisi en fonction du groupe étudié. C’est une méthode d’identification moléculaire fondée sur la comparaison de séquences des marqueurs moléculaires dans une base de données. La séquence est nécessaire pour l’identification de l’espèce.
1. Extraction de l’ADN
2. Amplification (peut faire une validation de l’amplification sur gel d’agarose)
3. Séquençage
4. Comparaison de la séquence avec les séquences de référence
5. Si une séquence est proche dans la base de données BOLD, l’identification de l’espèce est possible
Quelles sont les 2 méthodes de quantification de la qPCR?
- La quantitfication directe: on compare la droite obtenue avec la droite d’un échantillon connu.
- La quantification relative: on compare les Cq entre eux et avec le gène de référence
Expliquer en quoi consiste l’analyse par l’ADNe?
L’analyse par ADNe consiste à détecter une espèce cible dans l’environnement. C’est de l’ADN pouvant être extrait d’échantillons environnementaux (tels que l’eau, le sol ou l’air) sans avoir besoin d’isoler au préalable des individus cibles.
Nommez des sources d’ADNe
Des excréments, poils, peaux, mucus, salive, urine, par la pluie.
Quelle est la signification du Cq?
Cq = cycle de quantification
Plus le Cq est tôt (plus le nombre de cycle nécessaire pour l’atteindre est petit), plus l’échantillon est concentré
Cq + grand que 30= échantillon négatif donc pas de réaction.
Le Cq se calcule en nombre de cycle
Quelle est l’utilité du TM
TM = température de dénaturation
C’est la température à laquelle la moitié de l’ADN est double brin et l’autre est simple brin.
Comparez les deux principales approches basées sur l’ADNe
- Barcoding : Détecte la présence ou l’absence d’espèces à partir de l’analyse d’ADNe sans manipuler les organismes étudiés.
- Metabarcoding : Permet en une fois, une identification de toutes les espèces présentes dans un échantillon. Utilisé pour regarder la diversité d’une communauté.
Nommez dans l’ordre, les étapes préalables au séquençage par la méthode Sanger (méthode de première génération ou méthode de terminaison de chaîne par un didésoxyribonucléotide)
1- Création de commande (clients)
2- Transport
3- Réception de l’échantillon : vérification et transfert
4- Purification (Robot Janus #1) : Isoler l’ADN
5- Dosage au Pico Green avec courbe standard
6- Normalisation de la concentration du produit PCR (Robot Janus #2)
7- Réaction de séquençage
8- Précipitation avec EtOH-EDTA
9- Resuspendre la formamide HiDi + chauffer
- Migration dans le DNA Analyzer
Quels sont les avantages de la qPCR?
- C’est plus rapide que la PCR classique
- Pas de manipulations post-PCR
- C’est plus sensible que la PCR classique
- Facilite l’analyse d’échantillons en grand nombre
- Les résultats sont quantitatifs
