Examen de laboratoire

Question 1

Décrit les caractéristiques de physarum polycephalum

Answer 1

• organisme unicellulaire ayant plusieurs noyaux synchronisés(meme phase)
• mobile
• fuit la lumière (1cm/h)
• hétérotrophe

Question 2

Explique le cycle évolutif de physarum polycephalum

Answer 2

1. émergence
2. plasmogamie du zygote (2n)
3. fusion du noyau (caryogamie)
4. mitose pour devenir le jeune plasmodium
5. Division du noyau, mais pas du cytoplasme
6. En conditions favorables, croissance du plasmodium (2n)
7. étape non essentielle, mais il peut y avoir la sphérulation
8. le plasmodium devient le sporangium
9. Avec un cycle lumière-obscurité le sporangium devient sporangium noir= sporulation
10. il y a méiose production de sport 1n
11. les spores 1n germinent en conditions favorables
12. les spores libèrent des cellules soient flagellées ou amiboïdes
13. fusion des cellules pour former un nouveau plasmode

Question 3

Comment évalue-t-on la densité d’une culture de physarum ?

Answer 3

Pipetter 10 mL d’une culture, centrifuger 2 min à vitesse max (0,5ml de culot=5%)

Question 4

Explique comment préparer les solutions mères ?

Answer 4

Avec une fiole jaugée

c1v1=c2v2

Question 5

Explique comment préparer les milieux de culture ?

Answer 5

cylindre gradué- quantité de solutions mères à mettre

Question 6

Comment maintenir physarum vivant dans une culture solide et liquide ?

Answer 6

• solide: repiquer 2x avant que l’organisme se soit répandu sur toute la gélose
• liquide: repiquer environ 1ml+0,5ml hématine+50ml SDM 2x par semaine (il faut que physarum soit encore jaune)

Question 7

Comment provoques les différentes étapes du cycle vital de physarum polycephalum ?

Answer 7

1. Sphérulation (5-205%): A)Culture dans tube-centrifuger-enlever surnageant-ajout MSE- centrifuger-enlever surnageant-ajout MSE–agitation, 22degrés, obsc., 3/4jours
   B)Centrifuger, enlever surnageant, faire 3 trainée sur un filtre– t piece, obsc., 2 jours- couper les bandes
   2.Germination:
   A)éprouvette+SDM+hématine+bande–26 degrés, 7 jours
   B)Mettre matériel jaune dans SDM/hématine–2-4jours
   C)repiquage

Question 8

Caractéristiques de Fusarium oxysporum

Answer 8

• champignon filamenteux
• conidies/spores(paroi épaisse, terminales ou intercalaires)
• thalle : blanc, pêche, saumon, violet
• microphialides: isolés ou sur de courts conidiophores=microconidies 0
• macrophialides: éparses ou groupées=macroconidies < 0 >
• habitat: saprophyte, pathogène de culture

Question 9

Caractéristiques de clavibacter michiganensis subsp. michiganensis

Answer 9

• bactérie: chancre tomate/poivron
• croissance 24-27
• humidité++ pour induire maladie
• colonies rondes/jaunes

Question 10

Compare LPGA, SNA et PDA

Answer 10

LPGA: croissance de Cmm, car milieu riche et pH neutre
SNA: contient des antibiotiques, donc c’est un milieu sélectif pour induire les fructifications qui aideront à l’identification: macroconidies
PDA: Milieu riche en glucide ayant un pH de 5-6 ce qui est parfait pour la croissance des champignons: mycélium

Question 11

Comment faire LPGA, SNA et PDA

Answer 11

SNA: prod. chim. + antibio
LPGA: prod. chim.
PDA: poudre

Question 12

Comment isoler en culture pure un microorganisme d’une plante infectée (mycète)

Answer 12

1. Déposer les bouts(pour que le tissu vasculaire touche à la gélose SNA)
2. incuber sous blacklight
3. observer la présence de macroconidies

Question 13

Identifier les macroconidies de fusarium oxysporum

Answer 13

haricots

Question 14

Procédure pour infecter un hôte sensible en inoculant une culture d’un microorganisme

Answer 14

technique des postulats de Koch

• faire une culture pure
• faire une incision de 1cm sur le pétiole
• introduire avec la lame d’un scalpel le mycélium

Question 15

Importance d’un témoin négatif (pour la phytopathologie)

Answer 15

Être certains que les plants ne soient pas déjà contaminés avant le début de l’expérience avec un autre pathogène que celui que l’on veut inoculer

Question 16

Met en relation les différentes étapes du protocole d’isolement d’un agent pathogène et les étapes des postulats de Koch

Answer 16

Koch:
1.On peut tjrs trouver un microorganisme spécifique lié à une maladie donnée (infection)
2.Le microorganisme suspect doit être isolé pour l’identifier et cultivé en culture pure pour l’inoculer à un hôte sain
3.La maladie doit se développer quand le microorganisme est inoculé à un hôte sain
4.Le même microorganisme doit de nouveau être isolé de l’hôte sain, mais pas toujours
Isolement des pathogènes:
1. choix de l’éch+désinf
-Prendre tissu au niveau du front d’avancement des symptômes
désinfection: koch épiderme: élisa, PCR
2. Mise en culture
3. inoculation des plants hôtes

Question 17

Comment manipuler adéquatement la micropipette

Answer 17

position verticale
conditionner embout sauf si culot
hauteur des yeux

Question 18

Extraction ADN

Answer 18

• bout queue+tampon digestion+protéinaseK–55C, 24h
• C, mettre surnageant dans nouveau tube+RNaseA+vortex
• Lysis binding+éthanol100%+V entre chaque
• mettre dans colonne+10000RPM 1 min+nouveau tube
• T. lavage 1+10000RPM 1 min+nouveau tube
• T. lavage 2+vit. max. 3 min+ microtube
• T. élution+vit. max. 1 min

Question 19

Comment amplifier un gène par PCR

Answer 19

faire le mélange de réactifs dans un microtube, mettre ADN+réactif dans bande. thermocycleur: 30x(45s-94C, 1,45min-57C, 1,30 min-72C), 10 min 4C

Question 20

Comment faire un électrophorése sur gel d’agarose

Answer 20

gel + tampon
échantillon+bleu endo-R-stop
150 volts constant
400 mA
27 min

Question 21

Interpréter résultats du PCR

Answer 21

comparer position bande des échantillons avec celles de l’échelle de poids moléculaire et du positif d’extraction

Question 22

Contamination lors du PCR

Answer 22

Les microgouttes d’ADN sur le bout d’une micropipette ou qui éclaboussent et tombent dans le tube voisin (s’il y a pls échantillons différents)

Question 23

Expliquer importance des témoins dans le PCR

Answer 23

+ extraction: échantillons connus pour valider l’extraction
+ amplification: ADN connu et extrait de pCR antérieur
- amplification: contamination

Question 24

Calculs pour les tampons ÉLISA

Answer 24

ACE(anticorps lié à l'enzyme)
ACR(anticorps de recouvrement)
=200X
nb puits+3=x
x fois 100ul(vol/puits)=y(tampon de recouvrement à utiliser)
y/200x=z(ACR/ACE à diluer)

Question 25

Préparation des suspensions bactériennes ELISA

Answer 25

grosse colonie(3-4mm) dans 2ml de saline– 100ul dans puits, incubation 1h30 tpiece, laver 10x

Question 26

Préparation anticorps de recouvrement

Answer 26

9ul dans (1,8ml-9ul)–100ul dans puits, incubation 1 semaine 4C, laver 4x

Question 27

Préparation anticorps lié à l’enzyme

Answer 27

9ul dans (1,8ml-9ul)–100ul dans puits, incubation 1h30 tpiece, laver 8x

Question 28

inoculation avec le substrat de l’enzyme

Answer 28

100ul incuber tpiece 24h

Question 29

Résultats test ÉLISA

Answer 29

antigène-anticorps

enzyme-substrat= transformation en un produit coloré jaune

Question 30

blanc ÉLISA

Answer 30

déceller contaminations

Question 31

Témoin ÉLISA

Answer 31

pas de problèmes dans une des étapes qui auraient faussé les résultats ou être certain que les résultats sont valides