Examen de laboratoire Flashcards
Décrit les caractéristiques de physarum polycephalum
- organisme unicellulaire ayant plusieurs noyaux synchronisés(meme phase)
- mobile
- fuit la lumière (1cm/h)
- hétérotrophe
Explique le cycle évolutif de physarum polycephalum
- émergence
- plasmogamie du zygote (2n)
- fusion du noyau (caryogamie)
- mitose pour devenir le jeune plasmodium
- Division du noyau, mais pas du cytoplasme
- En conditions favorables, croissance du plasmodium (2n)
- étape non essentielle, mais il peut y avoir la sphérulation
- le plasmodium devient le sporangium
- Avec un cycle lumière-obscurité le sporangium devient sporangium noir= sporulation
- il y a méiose production de sport 1n
- les spores 1n germinent en conditions favorables
- les spores libèrent des cellules soient flagellées ou amiboïdes
- fusion des cellules pour former un nouveau plasmode
Comment évalue-t-on la densité d’une culture de physarum ?
Pipetter 10 mL d’une culture, centrifuger 2 min à vitesse max (0,5ml de culot=5%)
Explique comment préparer les solutions mères ?
Avec une fiole jaugée
c1v1=c2v2
Explique comment préparer les milieux de culture ?
cylindre gradué- quantité de solutions mères à mettre
Comment maintenir physarum vivant dans une culture solide et liquide ?
- solide: repiquer 2x avant que l’organisme se soit répandu sur toute la gélose
- liquide: repiquer environ 1ml+0,5ml hématine+50ml SDM 2x par semaine (il faut que physarum soit encore jaune)
Comment provoques les différentes étapes du cycle vital de physarum polycephalum ?
- Sphérulation (5-205%): A)Culture dans tube-centrifuger-enlever surnageant-ajout MSE- centrifuger-enlever surnageant-ajout MSE–agitation, 22degrés, obsc., 3/4jours
B)Centrifuger, enlever surnageant, faire 3 trainée sur un filtre– t piece, obsc., 2 jours- couper les bandes
2.Germination:
A)éprouvette+SDM+hématine+bande–26 degrés, 7 jours
B)Mettre matériel jaune dans SDM/hématine–2-4jours
C)repiquage
Caractéristiques de Fusarium oxysporum
- champignon filamenteux
- conidies/spores(paroi épaisse, terminales ou intercalaires)
- thalle : blanc, pêche, saumon, violet
- microphialides: isolés ou sur de courts conidiophores=microconidies 0
- macrophialides: éparses ou groupées=macroconidies < 0 >
- habitat: saprophyte, pathogène de culture
Caractéristiques de clavibacter michiganensis subsp. michiganensis
- bactérie: chancre tomate/poivron
- croissance 24-27
- humidité++ pour induire maladie
- colonies rondes/jaunes
Compare LPGA, SNA et PDA
LPGA: croissance de Cmm, car milieu riche et pH neutre
SNA: contient des antibiotiques, donc c’est un milieu sélectif pour induire les fructifications qui aideront à l’identification: macroconidies
PDA: Milieu riche en glucide ayant un pH de 5-6 ce qui est parfait pour la croissance des champignons: mycélium
Comment faire LPGA, SNA et PDA
SNA: prod. chim. + antibio
LPGA: prod. chim.
PDA: poudre
Comment isoler en culture pure un microorganisme d’une plante infectée (mycète)
- Déposer les bouts(pour que le tissu vasculaire touche à la gélose SNA)
- incuber sous blacklight
- observer la présence de macroconidies
Identifier les macroconidies de fusarium oxysporum
haricots
Procédure pour infecter un hôte sensible en inoculant une culture d’un microorganisme
technique des postulats de Koch
- faire une culture pure
- faire une incision de 1cm sur le pétiole
- introduire avec la lame d’un scalpel le mycélium
Importance d’un témoin négatif (pour la phytopathologie)
Être certains que les plants ne soient pas déjà contaminés avant le début de l’expérience avec un autre pathogène que celui que l’on veut inoculer
Met en relation les différentes étapes du protocole d’isolement d’un agent pathogène et les étapes des postulats de Koch
Koch:
1.On peut tjrs trouver un microorganisme spécifique lié à une maladie donnée (infection)
2.Le microorganisme suspect doit être isolé pour l’identifier et cultivé en culture pure pour l’inoculer à un hôte sain
3.La maladie doit se développer quand le microorganisme est inoculé à un hôte sain
4.Le même microorganisme doit de nouveau être isolé de l’hôte sain, mais pas toujours
Isolement des pathogènes:
1. choix de l’éch+désinf
-Prendre tissu au niveau du front d’avancement des symptômes
désinfection: koch épiderme: élisa, PCR
2. Mise en culture
3. inoculation des plants hôtes
Comment manipuler adéquatement la micropipette
position verticale
conditionner embout sauf si culot
hauteur des yeux
Extraction ADN
- bout queue+tampon digestion+protéinaseK–55C, 24h
- C, mettre surnageant dans nouveau tube+RNaseA+vortex
- Lysis binding+éthanol100%+V entre chaque
- mettre dans colonne+10000RPM 1 min+nouveau tube
- T. lavage 1+10000RPM 1 min+nouveau tube
- T. lavage 2+vit. max. 3 min+ microtube
- T. élution+vit. max. 1 min
Comment amplifier un gène par PCR
faire le mélange de réactifs dans un microtube, mettre ADN+réactif dans bande. thermocycleur: 30x(45s-94C, 1,45min-57C, 1,30 min-72C), 10 min 4C
Comment faire un électrophorése sur gel d’agarose
gel + tampon échantillon+bleu endo-R-stop 150 volts constant 400 mA 27 min
Interpréter résultats du PCR
comparer position bande des échantillons avec celles de l’échelle de poids moléculaire et du positif d’extraction
Contamination lors du PCR
Les microgouttes d’ADN sur le bout d’une micropipette ou qui éclaboussent et tombent dans le tube voisin (s’il y a pls échantillons différents)
Expliquer importance des témoins dans le PCR
+ extraction: échantillons connus pour valider l’extraction
+ amplification: ADN connu et extrait de pCR antérieur
- amplification: contamination
Calculs pour les tampons ÉLISA
ACE(anticorps lié à l'enzyme) ACR(anticorps de recouvrement) =200X nb puits+3=x x fois 100ul(vol/puits)=y(tampon de recouvrement à utiliser) y/200x=z(ACR/ACE à diluer)
Préparation des suspensions bactériennes ELISA
grosse colonie(3-4mm) dans 2ml de saline– 100ul dans puits, incubation 1h30 tpiece, laver 10x
Préparation anticorps de recouvrement
9ul dans (1,8ml-9ul)–100ul dans puits, incubation 1 semaine 4C, laver 4x
Préparation anticorps lié à l’enzyme
9ul dans (1,8ml-9ul)–100ul dans puits, incubation 1h30 tpiece, laver 8x
inoculation avec le substrat de l’enzyme
100ul incuber tpiece 24h
Résultats test ÉLISA
antigène-anticorps
enzyme-substrat= transformation en un produit coloré jaune
blanc ÉLISA
déceller contaminations
Témoin ÉLISA
pas de problèmes dans une des étapes qui auraient faussé les résultats ou être certain que les résultats sont valides
