Examen 2

Question 1

Quelles sont les différentes stratégies de clonage?

Answer 1

Clonage conventionnel
Clonage de produits PCR dans un vecteur TOPO
Clonage basé sur la méthode de Gibson
Clonage basé sur la complémentarité de queues d’homopolymères

Question 2

Avec quoi est effectuée la ligature?

Answer 2

L’ADN ligase du phage T4

Question 3

Quelles conditions on doit utiliser pour favoriser la ligature des bouts francs?

Answer 3

Une concentration d’ATP plus faible, une concentration d’enzyme et de substrat plus élevées et on ajoute du PEG pour accélérer la réaction

Question 4

Quels sont les principaux points à considérer pour la ligature avec le clonage conventionnel?

Answer 4

• Conditions différentes selon bouts francs ou bouts collants
• Influence de la concentration et de la longueur des fragments sur le type de produit formé dans les réactions avec les bouts collants
• Méthodes pour prévenir la circularisation du vecteur
• Stratégies de ligature de fragments avec bouts francs (linkers, adaptateurs)

Question 5

Pourquoi le graphique de Dugaiczyk est utile?

Answer 5

Pour prédire les événements initiaux de la réaction de ligature

Question 6

De quoi on se sert pour phosphoryler les linkers?

Answer 6

Polynucléotide kinase du phage T4 + ATP

Question 7

Quels sont les avantages des adapteurs par rapport aux linkers?

Answer 7

1. Polymérisation de l’adapteur évitée car on phosphoryle seulement une extrémité 5’
2. Un fragment généré par une enzyme peut être cloné dans un vecteur digéré par une autre enzyme, qui génère des extrémités incompatibles
3. Des sites de restriction internes peuvent être ajoutés
4. Peuvent aussi servir pour le séquençage en masse

Question 8

Pourquoi le clonage avec le vecteur TOPO permet d’utiliser des produits PCR?

Answer 8

À cause de l’extrémité 5’-OH générée. Sinon, il faut enlever le phosphate avec la phosphatase alcaline avant de procéder

Question 9

Pourquoi on doit intégrer des marqueurs dans les cellules?

Answer 9

Pour sélectionner le vecteur (cellules qui ont intégré un plasmide) et sélectionner le recombinant (cellules qui possèdent un plasmide avec un insert dedans)

Question 10

Quelles sont les deux méthodes pour rendre les cellules compétentes?

Answer 10

On peut utiliser du CaCl2 + chaleur ou on peut effectuer une électroporation

Question 11

Quelles sont les différentes méthodes pour sélectionner?

Answer 11

• antibiotique (PBR322)
• sélection avec lacZ (pUC)
• sélection directe avec ccdB (pKIL18/19)
• sélectrion par la taille avec sites cos (longueur - phage lambda)
• sélection hfl- avec gène cl (phage lambda)
• sélection du phénotype Spi

Question 12

Comment ça marche un phagemide?

Answer 12

Il y a un plasmide contenu dans le génome du phage. Quand le phage se réplique, le plasmide est produit. L’insertion est introduite dans le plasmide justement. Il faut faire une surinfection avec un phage M13 pour que ça marche. On peut récupérer de l’ADN db ou sb.

Question 13

Quelles sont les quatre étapes de l’hybridation moléculaire (criblage)?

Answer 13

1 - Pré-hybridation

2. Hybridation
3. Lavages
4. Autoradiographie

Question 14

Comment on peut rendre des conditions plus stringentes?

Answer 14

En diminuant la concentration de sels et en augmentant la température