Examen 1

Question 1

1- Rôle de TE

Answer 1

Tris → conserve l’intégrité et la stabilité de l’ADN

EDTA → inhibe les nucléases

Question 2

1- Rôle TBE

Answer 2

Tris-borate-Edta, dans cuve et gel
conductivité au milieu
charge l’ADN négativement (permet la migration)

Question 3

1- Rôle du tampon de chargement

Answer 3

visualiser la migration

augmenter la poussée d’Archimède (glycérol)

Question 4

2- Lyticase

Answer 4

hydrolyse paroi cellulaire de levure
rôle: zymolyase
isolée d’un actinomycète
contient de l’Endo β–1,3 glucanase et des protéases

Question 5

2- RNase

Answer 5

élimine l’ARN contaminant (par digestion)

Question 6

2- protéinase K

Answer 6

(en présence EDTA + détergent ex: SDS)

préparation de l’ADN total de la levure

Question 7

2- solution saline (dans le cas de la purification de l’ADN)

Answer 7

éliminer les protéines contaminants par précipitation sélective

Question 8

3- Les enzymes de restriction

Answer 8

endonucléases qui reconnaissent des sites particuliers sur l’ADN bicaténaire et coupent la molécule à ces sites

tirent leur nom de leur fonction dans les bactéries, où elles servent à digérer l’ADN étranger provenant d’une infection ou d’une transformation

incapables de couper leur propre ADN qui est protégé par des groupements méthyles aux sites de reconnaissance

Question 9

3- comment on sait si l’ADN est bien digéré?

Answer 9

une traînée de fragments, pas de bandes intenses

Question 10

3- Étape initiale de la PCR

Answer 10

Dénaturation à 94 ou 95 pendant 5 à 10 minutes

Question 11

3- Étape 1 PCR

Answer 11

95 pour 30 secondes (dénaturation)

Question 12

3- Étape 2 PCR

Answer 12

hybridation = les amorces sur l’ADN (oligonucléotides +dNTPs + tampon réactionnel + MgCl2**)*
entre 45-65 degrés pour 30 secondes

• parfois de l’albumine de sérum de bovin (BSA) pour augmenter le rendement de la PCR de l’ADN fossile, élimine les inhibiteurs de la PCR
• *les ions Mg+ sont des cofacteurs indispensables pour la réaction de polymérise avec la Taq

Question 13

3- Étape 3 PCR

Answer 13

élongation des fragments

72°C pendant 30-60 secondes (Taq)

Question 14

3- Étape finale PCR

Answer 14

élongation finale de 10 minutes (68-72 degrés) pour bien compléter tout les fragments d’ADN et retour à 4 degrés, l’étape infinie

Question 15

3- Qu’est-ce qu”on peut faire pour améliorer la PCR?

Answer 15

jouer avec les paramètres (temp, tampons, enzymes)

agents d’amélioration (effets inconnus, doivent être testés individuellement avant)

Question 16

4- à quoi sert la précipitation de l’ADN lors des manipulations?

Answer 16

isoler
nettoyer
concentrer
purifier

Question 17

4- à quoi sert la précipitations post-PCR?

Answer 17

à éliminer les réactifs de la PCR (MgCl2, nucléotides, tampon. enzymes Taq…)

Question 18

1- Question de compréhension

Comment peuvent survenir des pertes lors de la précipitation d’ADN (rendement

Answer 18

-

Question 19

1- Question de compréhension
Si le gel est trop intense pour bien évaluer la quantité d’ADN dans l’échantillon, comment faire pour remédier à la situation?

Answer 19

-

Question 20

2- Question de compréhension

Que faire pour éviter les contaminants lors de l’extraction de l’ADN?

Answer 20

-

Question 21

3- Question de compréhension

Si l’ADN de levure mesure environ 1,2 x 10^7, est-ce que le résultat obtenu en A2 paraît vraisemblable? Expliquer

Answer 21

-

Question 22

3- Question de compréhension
Comparer l’ADN de levure traité à la RNase et l’ADN non traité à la RNase. Est-ce que le traitement effectué sur l’échantillon a été efficace?

Answer 22

-

Question 23

3- Question de compréhension

Calculer la quantité d’AN génomique digéré par HindIII-HF (dans les 40uL et dans les 6uL déposés sur le gel)

Answer 23

-

Question 24

3- Question de compréhension

est-ce que l’ADN est bien digéré par l’enzyme HinIII-HF? Expliquer

Answer 24

-

Question 25

3- Question de compréhension
Le bleu de bromophénol contenu dans la solution tampon de chargement 6X migre à la même vitesse qu’un fragment dAADN contenu dans les marqueurs de taille moléculaire. De quelle longueur est-il?

Answer 25

-

Question 26

3- Question de compréhension
Pourquoi les différents fragments des marqueurs de taille moléculaire n’apparaissent pas avec la même intensité de coloration sur la photo?

Answer 26

-

Question 27

4- Question de compréhension
Suite à l’amplification par réaction PCR le rendement normal est de 1 ug et + d’ADN. Pourquoi le rendement serait inférieur?

Answer 27

Lors d’une réaction d’amplification par PCR, si vous n’obtenez pas d’ADN, il faut d’abord vérifier la présence de tous les éléments nécessaires à la réaction. Il faut ensuite vérifier la qualité et la qualité et quantité d’ADN de départ. Par exemple, si la quantité d’ADN est trop grande ou si l’ADN utilisé est dégradé, il n’y aura pas de réaction.

Normalement, vous devriez obtenir un seul fragment d’amplification après une réaction de PCR. Si vous avez plusieurs bandes, vous avez possiblement une réaction non spécifique. Pour éliminer ce problème vous pouvez utiliser les mêmes oligonucléotides mais en diminuant la concentration de MgCl2 dans la réaction. Vous pouvez également augmenter la température d’hybridation. Si ces mesures n’éliminent pas les bandes non-spécifiques, il faut changer la composition de vos oligonucléotides car ils s’hybrident probablement à plusieurs sites différents dans l’ADN.

Question 28

4- Question de compréhension

Pourquoi il faut précipiter la réaction d’ADN de la réaction PCR avant d’en faire la digestion?

Answer 28

éliminer les nucléotides non incorporés (dNTPs)

• enlever les enzymes et les sels (nettoyer)
• concentre votre échantillon
• nécessaire si vous souhaitez changer de tampon

Question 29

4- Question de compréhension

Pourquoi privilégier la solution tampon NEBuffer Cutsmart?

Answer 29

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Question 30

4- Question de compréhension

Pourquoi il est important d’effectuer une digestion du fragment PCR avec l’enzyme EcoRI ou EcoRI-HF?

Answer 30

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Question 31

4- Pourquoi les enzymes de restriction des manufacturiers sont souvent accompagnés de BSA?

Answer 31

empêcher l’adhérence de l’enzyme de tubes de réaction et des surfaces de pipette.
stabilise certaines protéines pendant l’incubation.

Question 32

4- C’est quoi un isoschizomer?

Answer 32

Une enzyme de restriction qui reconnaît le même site de coupure et le coupe de façon identique à une autre enzyme

Question 33

5- Question de compréhension

Après avoir utilisé une quantité équivaloir de plasmide et de fragment dans votre ligature? Expliquer

Answer 33

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Question 34

5- Question de compréhension

La plasmide pBluescript utilisé dans votre ligature est-il linéaire? Expliquer

Answer 34

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Question 35

5- Question de compréhension

Expliquer le patron de migration du plasmide non digéré

Answer 35

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Question 36

5- Question de compréhension
Calculer l’efficacité de la transformation (nombre de colonies/pg d’ADN) à partir du nombre de colonies obtenues avec le plasmide p Bluscript non digéré par EcoR1-HF (mélange 2)

Answer 36

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Question 37

5- Question de compréhension

Expliquer pourquoi on a utiliser les mélange 2 et 3 (étape 3.5)

Answer 37

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Question 38

5- Question de compréhension

Expliquer pourquoi on a utiliser l’antibiotique ampicilline dans cette expérience

Answer 38

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