Examen 1 Flashcards
1- Rôle de TE
Tris → conserve l’intégrité et la stabilité de l’ADN
EDTA → inhibe les nucléases
1- Rôle TBE
Tris-borate-Edta, dans cuve et gel
conductivité au milieu
charge l’ADN négativement (permet la migration)
1- Rôle du tampon de chargement
visualiser la migration
augmenter la poussée d’Archimède (glycérol)
2- Lyticase
hydrolyse paroi cellulaire de levure
rôle: zymolyase
isolée d’un actinomycète
contient de l’Endo β–1,3 glucanase et des protéases
2- RNase
élimine l’ARN contaminant (par digestion)
2- protéinase K
(en présence EDTA + détergent ex: SDS)
préparation de l’ADN total de la levure
2- solution saline (dans le cas de la purification de l’ADN)
éliminer les protéines contaminants par précipitation sélective
3- Les enzymes de restriction
endonucléases qui reconnaissent des sites particuliers sur l’ADN bicaténaire et coupent la molécule à ces sites
tirent leur nom de leur fonction dans les bactéries, où elles servent à digérer l’ADN étranger provenant d’une infection ou d’une transformation
incapables de couper leur propre ADN qui est protégé par des groupements méthyles aux sites de reconnaissance
3- comment on sait si l’ADN est bien digéré?
une traînée de fragments, pas de bandes intenses
3- Étape initiale de la PCR
Dénaturation à 94 ou 95 pendant 5 à 10 minutes
3- Étape 1 PCR
95 pour 30 secondes (dénaturation)
3- Étape 2 PCR
hybridation = les amorces sur l’ADN (oligonucléotides +dNTPs + tampon réactionnel + MgCl2**)*
entre 45-65 degrés pour 30 secondes
- parfois de l’albumine de sérum de bovin (BSA) pour augmenter le rendement de la PCR de l’ADN fossile, élimine les inhibiteurs de la PCR
- *les ions Mg+ sont des cofacteurs indispensables pour la réaction de polymérise avec la Taq
3- Étape 3 PCR
élongation des fragments
72°C pendant 30-60 secondes (Taq)
3- Étape finale PCR
élongation finale de 10 minutes (68-72 degrés) pour bien compléter tout les fragments d’ADN et retour à 4 degrés, l’étape infinie
3- Qu’est-ce qu”on peut faire pour améliorer la PCR?
jouer avec les paramètres (temp, tampons, enzymes)
agents d’amélioration (effets inconnus, doivent être testés individuellement avant)
4- à quoi sert la précipitation de l’ADN lors des manipulations?
isoler
nettoyer
concentrer
purifier
4- à quoi sert la précipitations post-PCR?
à éliminer les réactifs de la PCR (MgCl2, nucléotides, tampon. enzymes Taq…)
1- Question de compréhension
Comment peuvent survenir des pertes lors de la précipitation d’ADN (rendement
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1- Question de compréhension
Si le gel est trop intense pour bien évaluer la quantité d’ADN dans l’échantillon, comment faire pour remédier à la situation?
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2- Question de compréhension
Que faire pour éviter les contaminants lors de l’extraction de l’ADN?
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3- Question de compréhension
Si l’ADN de levure mesure environ 1,2 x 10^7, est-ce que le résultat obtenu en A2 paraît vraisemblable? Expliquer
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3- Question de compréhension
Comparer l’ADN de levure traité à la RNase et l’ADN non traité à la RNase. Est-ce que le traitement effectué sur l’échantillon a été efficace?
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3- Question de compréhension
Calculer la quantité d’AN génomique digéré par HindIII-HF (dans les 40uL et dans les 6uL déposés sur le gel)
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3- Question de compréhension
est-ce que l’ADN est bien digéré par l’enzyme HinIII-HF? Expliquer
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3- Question de compréhension
Le bleu de bromophénol contenu dans la solution tampon de chargement 6X migre à la même vitesse qu’un fragment dAADN contenu dans les marqueurs de taille moléculaire. De quelle longueur est-il?
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3- Question de compréhension
Pourquoi les différents fragments des marqueurs de taille moléculaire n’apparaissent pas avec la même intensité de coloration sur la photo?
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4- Question de compréhension
Suite à l’amplification par réaction PCR le rendement normal est de 1 ug et + d’ADN. Pourquoi le rendement serait inférieur?
Lors d’une réaction d’amplification par PCR, si vous n’obtenez pas d’ADN, il faut d’abord vérifier la présence de tous les éléments nécessaires à la réaction. Il faut ensuite vérifier la qualité et la qualité et quantité d’ADN de départ. Par exemple, si la quantité d’ADN est trop grande ou si l’ADN utilisé est dégradé, il n’y aura pas de réaction.
Normalement, vous devriez obtenir un seul fragment d’amplification après une réaction de PCR. Si vous avez plusieurs bandes, vous avez possiblement une réaction non spécifique. Pour éliminer ce problème vous pouvez utiliser les mêmes oligonucléotides mais en diminuant la concentration de MgCl2 dans la réaction. Vous pouvez également augmenter la température d’hybridation. Si ces mesures n’éliminent pas les bandes non-spécifiques, il faut changer la composition de vos oligonucléotides car ils s’hybrident probablement à plusieurs sites différents dans l’ADN.
4- Question de compréhension
Pourquoi il faut précipiter la réaction d’ADN de la réaction PCR avant d’en faire la digestion?
éliminer les nucléotides non incorporés (dNTPs)
- enlever les enzymes et les sels (nettoyer)
- concentre votre échantillon
- nécessaire si vous souhaitez changer de tampon
4- Question de compréhension
Pourquoi privilégier la solution tampon NEBuffer Cutsmart?
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4- Question de compréhension
Pourquoi il est important d’effectuer une digestion du fragment PCR avec l’enzyme EcoRI ou EcoRI-HF?
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4- Pourquoi les enzymes de restriction des manufacturiers sont souvent accompagnés de BSA?
empêcher l’adhérence de l’enzyme de tubes de réaction et des surfaces de pipette.
stabilise certaines protéines pendant l’incubation.
4- C’est quoi un isoschizomer?
Une enzyme de restriction qui reconnaît le même site de coupure et le coupe de façon identique à une autre enzyme
5- Question de compréhension
Après avoir utilisé une quantité équivaloir de plasmide et de fragment dans votre ligature? Expliquer
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5- Question de compréhension
La plasmide pBluescript utilisé dans votre ligature est-il linéaire? Expliquer
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5- Question de compréhension
Expliquer le patron de migration du plasmide non digéré
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5- Question de compréhension
Calculer l’efficacité de la transformation (nombre de colonies/pg d’ADN) à partir du nombre de colonies obtenues avec le plasmide p Bluscript non digéré par EcoR1-HF (mélange 2)
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5- Question de compréhension
Expliquer pourquoi on a utiliser les mélange 2 et 3 (étape 3.5)
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5- Question de compréhension
Expliquer pourquoi on a utiliser l’antibiotique ampicilline dans cette expérience
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