exam Flashcards
Gene
- Unidade de hereditariedade que contém as instruções que ditam as caraterísticas ou fenótipo de um organismo
- Um segmento de DNA responsável pela produção de uma proteína ou uma molécula de RNA funcional
Genoma
Conjunto de todo o DNA de uma célula:
- todos os cromossomas (46 somáticas e 23 germinativas)
- genes mitocondriais
Medicamentos recombinantes
Gene humano+genoma da bactéria
Prémio Nobel de 1978
Werner Arber + Daniel Nathans+ Hamilton Smith
Descoberta das enzimas de restrição e a sua aplicação a problemas de genética molecular
Passos da expressão genética (3)
1) Transcrição
2) Splicing
3) Tradução
Estrutura do DNA
- Polinucleótido formado por duas cadeias de desoxirribonucleótidos complementares e antiparalelas
- Unidas covalentemente por ligações fosfodiéster (mesma cadeia) e pontes de hidrogénio (entre as duas cadeias)
- É onde está a informação genética de uma célula que é transmitida de geração em geração
Estrutura de um nucleótido
- Pentose (desoxirribose ou ribose)
- Base azotada (A,C,G,T/U)
- Fosfato
Nucleases de restrição
- Enzimas que clivam o DNA (lig.fosfodiéster + pontes de hidrogénio) em locais específicos
- Formam “sticky ends” que permite a junção de outra moléculas de DNA
- Importantes na clonagem/ recombinação de DNA
DNA ligase
- Enzima que une dois fragmentos de DNA
- Mesmo que as pontes de hidrogénio se unam automaticamente é sempre precisa para Ligações fosfodiester (3’-OH; 5’-fosfato)
- Reação catalisada por ATP
DNA recombinante
DNA hibrido (humano+ bacteriano)
DNA plasmídeo
Muito usado como vetor de clonagem
Promotor
- Sequência de DNA que inicia a transcrição de um gene
- Inclui a sequência que é reconhecida pela RNA polimerase
Sequência Shine Delgarno (SD)
Para a ligação do mRNA ao ribossoma bacteriano
Como colocar o plasmídeo recombinante na bactéria?
Dar choque à membrana da bactéria
Como verificar se o plasmídeo entrou na bactéria?
Devemos escolher um plasmídeo com resistência a antibióticos (ex: ampicilina), depois adiciona-se as bactérias a um meio com antibiótico e só sobrevivem as que têm o plasmídeo recombinante
Métodos de separação de moléculas
Centrifugação
Eletroforese
Ori
Origem de replicação
Sequência de nucleótidos onde se inicia a replicação de DNA
Eletroforese
- Técnica que permite separar uma mistura de proteínas ou fragmentos de DNA
- Colocam-se as moléculas num gel sujeitas a uma campo elétrico
- As moléculas vão migrar ao longo do gel a velocidades diferentes dependendo do tamanho ou carga
- Moléculas do mesmo tamanho juntam-se
- São usados marcadores de tamanho
Para onde migra o DNA
DNA negativo por causa dos fosfatos
Migra para o polo positivo
Como se observa o resultado de uma eletroforese?
Graças a um corante fluorescente que depois é excitado com luz azul
O que ter em conta na escolha de enzimas de restrição?
Não pode interferir com:
- Ori
- Sequência de DNA humano
- Gene de resistência ao antibiótico
Transcrição
Processo em que a RNA polimerase usa uma cadeia de DNA como template para sintetizar uma cadeia de RNA complementar
Cadeia template
Cadeia molde
RNA polimerase
Catalisa a sintese de RNA
Adiciona ribonucleótidos
Move-se na direção 3’-5’ (cria RNA 5’-3’)
Caraterística da RNA polimerase bacteriana
Contém uma subunidade designada de fator sigma que reconhece o promotor de um gene
Ao iniciar a transcrição o fator sigma é libertado
Onde termina a transcrição?
Terminador
+1
Primeiro nucleótido a ser transcrito
Polaridade do promotor
Orienta a polimerase
Determina a DNA Template
Sequências transcritas de RNA
Contém o terminador mas não o promotor
Local de clonagem
Zona do plasmídeo que é reconhecida por várias enzimas
Quadro de Leitura
Hipóteses de agrupamento dos nucleótidos do mRNA
Há 3 hipóteses
Apenas uma é codificante
Transcriptase reversa
Enzima que cria um DNA (cDNA) de dupla cadeia de uma RNA template
Presente nos retrovirus
É parte da maquinaria de transposição dos retrotransposões
Repressor
Proteína que se liga a uma região reguladora específica do DNA e previne a transcrição de um determinado gene
Liga-se ao operador
Com lactose
Repressor inativo
Produção de proteína
Metabolismo da lactose
Decomposta por bactérias na ausência de glucose
É degradada pela enzima galactosidade produzindo galactose e glucose
Lac i
Gene que codifica o repressor inibindo a galactosidade
Aumenta a lactose no meio
A lactose liga-se ao repressor
O repressor fica inativo
Repressor da lactose
Bloqueia a transcrição:
- B-galatctosidade
- Permease
- Transacetilase
Exoma de um retrovirus
Molécula de RNA
Está dentro de uma cápsula proteica , rodeada por um envolto lipídico (com ptns codificadas plo RNA viral)
Sofre a atuação da transcriptase reversa que é codificada pelo genoma viral
Como se liga o mRNA de células eucariotas à subunidade ribossomal?
Pela 5’ 7-metilguanisina (cap)
O que modifica o pré-mRNA eucariota?
Capping e poliadenilação
Cap
5’
Cauda poli-A
3’
Operão
Conjunto de genes regulados pelo operador
Com triptofano
Liga-se ao repressor ativando-o
Repressor liga-se ao operador
Não há transcrição
Competição com a RNA polimerase
Prémio Nobel da Quimica 2016
Fraser Stoddart, Jean-Pierre Sauvage, Bernard Feringa
Maquinas moleculares - moléculas com movimentos controláveis quando lhes é fornecida energia
Prémio Nobel da Medicina 2016
Yoshinori Ohsumi
Autofagia
Degradação da própria células por lisossomas
Pode ser estimulada durante o Jejum prolongado
O que formam os reguladores da transcrição?
Pontos de hidrogénio
Ligações iónicas
Interações hidrofóbicas
Como fazer a purificação do cDNA?
Lisar a parede e membrana das células
Separar as proteinas através de técnicas como eletroforese
Sulfato de sódio dodecyl
Detergente que serve para uniformizar a carga das proteínas
Tem carga negativa
Gel de poliacrilamida
Para a separação de proteínas
kdal
Kilodalton
unidade usada para definir o tamanho de 2 proteínas
Colunas de cromatografia
Isolam as proteínas
1) Mistura de ptns colocadas no topo da coluna
2) Colocação de solvente
3) Recolha
O que muda a matriz da coluna de cromatografia?
Carga Hidrofobicidade Tamanho Capacidade de se ligar a certos grupos quimicos pH
Cromatografia por afinidade
Com um “isco” que atrai as proteínas que se querem isolar, saindo estas em último
Ligação isco- ptn é covalente
Exemplo de isco
Niquel tem carga que faz ligações com a histidina (antes adicionam-se 6 histidinas)
Como separar as proteínas do niquel?
Adição de imidazole que tem mais afinidade para o niquel do que as histidinas
Trombina
Protease que quebra as ligações entre o rótulo de histidina e a proteína
Exemplos de proteínas recombinantes em medicina
- Hormonas (insulina, somatostatina, …)
- Enzimas de substituição
- Fatores de crescimento e diferenciação celular (eritropoietina)
- Antigénios para vacinas (hepatite B)
Doença de Gaucher
Sinais: hepatoesplenomegália
Causa: Má digestão nos lisossomas devido a uma mutação na enzima glucocerebrosidade
Cromatina
massa homogénea de DNA associado a histonas
Heterocromatina
Mais condensada/densa
Junto ao invólucro
Eucromatina
Menos condensada
Nucléolo
Onde ocorre a síntese de RNA ribossomal (para as duas subunidades - splicing alternativo)
Numero de genes humanos
22 000 - 25 000
Cancro
Amplificação de determinados genes
Células imortais
Cariótipo
Conjunto de cromossomas
Como analisar o cariótipo
Tem de estar em divisão (metafase)
Fazer a lise celular
Colocar um corante que faz o bandeamento dos crms
Interfase
Duplicação dos crms
Fases da mitose
Profase, metafase, anafase e telofase
Mitose (explicada e por ordem)
1) Condensação dos crms duplicados
2) Quebra do envolto nuclear
3) fuso acromático é formado por microtubulos e proteínas
4) Os crms condensados são capturados pelo fuso acromático
5) Separação aleatória dos cromossomas
6) Formação do envolto nuclear ao redor de cada conjunto de cromossomas
7) Divisão do citoplasma da célula para produzir 2 células filhas
O que tem uma molécula de DNA com 2 cromatídeos
1 centromero que lligam os dois cromatideos
4 telómeros
Varias origens de replicação
Bivalente
2 moleculas de DNA
4 cromatídeos formados na profase I da meiose
FISH
Fluorescence in situ hybridization
Juntar uma sequência criada artificialmente fluorescente a uma cadeia que se quer estudar
Criação de um cromossoma hibrido
Formação de um cariótipo fluorescente organizado
Vantagens de FISH
Permite ver os cromossomas
Permite ver a cromatina de uma célula em fase S
Permite identificar translocações
Ataxia
- Doença genética do cérebro caraterizada por uma degradação progressiva das capacidades motoras
- Um dos cromossomas 12 tem um prolongamento do cromossoma 4
Anomalias cromossómicas
Alterações numéricas
Translocação
Deleção/Inserção
Fases da tradução
1) Subunidade mais pequena tem o tRNA correspondente à metionina e vai ligar-se e reconhecer o CAP
2) Desloca-se até encontrar AUG
2) Ligação da subunidade maior (desprende CAP)
3) Enlongação
4) Alcance de um codão STOP
6) Dissociação do complexo
Locais de monitorização do ribossoma
E P A
Mecanismos de importação de proteínas em organelos envoltos por membrana
Poros nucleares
Membrana (ptn tem de desenrolar)
Vesiculas
Importação de proteinas
Através de sinais
Destino de proteínas sintetizadas em ribossomas livres
Citosol Núcleo Cloroplastos Mitocondrias Peroxissomas
Proteínas sintetizadas em ribossomas associados a membrana
Translocados para RER
Translocados para aparelho de Golgi
Migração para retículo
1) Sinal de localização
2) Recetores do retículo
3) Formação da proteína no interior do retículo
4) Atuação de uma peptidase
SRP
Signal Recognition Particle
Reconhece o sinal da proteína permitindo a sua entrada para dentro do retículo
Proteína de membrana
Proteína que se forma em parte dentro e em parte fora da membrana
Glicoproteínas
Formadas no RER
Proteínas ligam-se a açucares
O número de açucares depende da sequencia de aa
Transporte de vesiculas pelo complexo de Golgi
Através de cisternas
São modificados os açucares que estão ligados às proteínas (maturação)
Destino final das vesiculas
Membrana
Lisossomas
Tipos de exocitose
Regulada (através de um sinal)
Constitutiva (constante)
Proteínas destinadas a serem nucleares
Importadas pelos poros nucleares
Contém um sinal que é reconhecido pelos recetores nucleares
Transporte da proteína para a mitôndria
- São descondensadas durante a importação
- Sequência com o sinal é reconhecida por um recetor de membrana
- O recetor está associado a uma proteína translocadora
- Difusão do complex até encontrar um segundo translocador na membrana interna
- Clivagem da sequência com o sinal por peptidases na matriz
Proteína chaperone
Ajuda a condensar a proteína novamente após o importe
Polirribossoma
Vários ribossomas ligados a cada molécula de mRNA
Terminal-N
Na sequencia sinalizadora
É clivado após a produção da ptn no organelo, ficando esta ancorada
O que acontece às asparginas ao entrarem no lumen do RE?
São glicosiladas pela adição de um lado de uma cadeia oligossacaridea ramificada
Sequências tripeptidicas
Aspargina - X - Serina
Aspargina - X - Trionina
Fagocitose
Elemento que fagocita: neutrófilos (no sangue) e macrófagos (tecidos) Particulas fagocitadas (ex:bactérias) -Particulas vão para uma vesicula (endossoma) -Digestão de particulas pelos lisossomas
Diferença entre endocitose e fagocitose
Tamanho
Exs de enzimas nos lisossomas
Proteases, nucleases, glicosidases, lipases, fosfatases, sulfatases, fosfolipases
O que pode fundir com os lisossomas?
Fagossomas
Endossomas
Autofagossomas
Manose-6-fosfato
Ligada as enzimas lisossomais
É o sinal para ir para o RE
Classificação dos lisossomas
Grandes heterogéneos: com processo de digestão
Pequenos e homogéneos: sem atividade no momento
Glucocerebrosidade
Enzima que catalisa a degradação da glucocerebrose em glicose e ceramida
Glóbulos vermelhos (Carmadas)
- Tempo médio de vida: 120 dias
- Por segundo são destruídos 2,5 milhões
- 90% são removidos por macrófagos no fígado,no baço e nos gânglios linfaticos
- 10% hemolisam em circulação
Resposta inflamatória
São chamadas defesas (inclui sangue)
Ex: edema, dor, aumento de volume, …
Mutações que provocam doenças lisossomais
- Em hidrolases
- Na fosfotransferase necessária para a manose-6-fosfato detetar a hidrolase
- No recetor manose-6-fosfato
- Bomba de H+
Que moléculas membranares estão do lado citosólico
Fosfatidilserina
Fosfatidiletanolamina
Fosfatidilinositol
Moléculas membranares no lado não citosólico
Fosfatidicolina
Esfingomielina
Glicolipidos
Hipercolesterolémia familiar
Doença genética autossómica dominante
Maior quantidade de colesterol no sangue
Formação de depósitos de colesterol
Doença coronária prematura
Colesterol
Sintetizado pelo organismo
Usado em membranas
Constitui hormonas sexuais e outras hormonas esterois
Constitui ácidos biliares
Transporte de colesterol no sangue
No interior de uma monocamada de fosfolípidos com proteínas (lipoproteínas)
Clatrina
Para que os recetores estejam todos concentrados de modo a haver uma invaginação
Após a formação da vesícula desprende a clatrina
Mutações que provocam aumento de LDL
Nos recetores da membrana (menos, sem nenhum ou não funcionais)
Nas proteínas das LDL
Transporte de LDL
1) Ligação a recetores
2) Internalização em vesiculas rodeadas por clatrina
3) Sai a clatrina
4) Fusão com endossoma (ácido)
5) Dissociação dos LDL
6) Origina-se colesterol
Recetores cargo
Capturados por adaptinas que ligam moléculas de clatrina
SnRNPs
Pequenas ribonucleoproteínas nucleares
Dirigem a quebra de mRNA na barreira intrão/exão
Catalisam ligações covalentes de sequências exónicas
Spliceossoma
RNAs e proteínas que retiram os intrões para fora do pré-mRNA no núcleo de uma célula eucariota
Splicing
1) Processamento - capping
2) Splicing - remoção de intrões
3) Adição da cadeia poli-A
Orgãos com maior diversidade de produção proteica
Cérebro e testiculos
Splicing alternativo
Produção de diferentes mRNAs (e proteínas) a partir do mesmo gene ao fazer o splicing dos RNA transcritos de forma diferente
Proteínas reguladoras dos splicing
Competem com a ligação do spliceossoma impedindo que ele reconheça o local de splicing
Mutações que alteram o splicing
No splice site
Nas sequencias reguladoras
Nas proteínas que se ligam aos locais de splicing
SNPs
Single nucleotide polimorfism
Pontos onde o genoma difere em 1 par de nucleótidos entre 2 porções da população
A maioria ocorre em porções que não afetam o gene
Anemia falciforme
Mutação da hemoglobina na subunidade B
Alteração de uma glutamina para uma valina
Recessiva
Traz um aumento à resistência à malária
Origem da variação genética
1) Erros durante a replicação do DNA e divisão celular
2) Alterações químicas espontaneas do DNA e transposições
3) Alterações quimicas do DNA induzidas por exposição ao ambiente
Depurinação
Eliminação de uma purina
Deaminação
Perda de um grupo amina que leva a alteração da base (ex: citosina - uracilo)
O que acontece a uma célula mutada?
Morre
Cancro (proliferação)
Consequência da radiação UV
Dimeros de timina
Transposição
Porção de DNA que salta
Pelo método cut and paste ou por replicação
Retrotransposão
Igual mas com o intermediário de RNA
Elementos genéticos moveis
Podem mover um gene para o outro
Forquilhas de replicação
Junções onde ocorre a síntese de DNA
São formados 2 em cada ori
Movem-se em direções diferentes
Fragmentos de Okazaki
Pequenas sequências de DNA produzidas na lagging strand durante a replicação
Fragmentos adjacentes são rapidamente unidos pela DNA ligase para formar uma cadeia de DNA continua
Primase
Tipo de RNA polimerase que usa o DNA como template para produzir um fragmento de RNA que serve de primer para a síntese de RNA(5’ - 3’)
Telómeros
Sequência de nucleótidos repetitiva que protege as pontas dos cromossomas lineares
Permite que não haja perda de informação
Diminuem na replicação
Telomerase
Enzima que faz a elongação dos telómeros
Sintetiza a sequencia repetitiva encontrada no final dos cromossomas eucarióticos
Funcional durante a fase embrionária e em cancro
Senescência celular
A celula tem crms curtos e não se encontra em condições de se replicar
DNA polimerase
Faz a síntese de DNA
Realiza correções
Mecanismo de reparação do DNA
- Excisão (por nucleases)
- Resintese (por DNA polimerase)
- Ligação (por DNA ligase)
Taxa de erro de DNA polimerase sem proofreading
1 em cada 10^5
Taxa de erro de DNA polimerase com proofreading
1 em cada 10^7
Taxa de erro de DNA polimerase com proofreading e com reparação de não complementares
1 em cada 10^9
Metilação do DNA nas ilhas CpG dos promotores
Impede a transcrição
Ocorre em citocinas de nucleótidos CpG
Regulação epigenética
Expressão bialélica
Expressão monoalélica
Expressão bialélica
De ambos os alelos (normalidade)
Expressão monoalélica
Metilação do promotor de um dos alelos
- Imprintig
- Inibição do cromossoma X
Imprinting genómico
Expressão monoalélica Não aleatório Durante a gametogénese Metilação em regiões de controlo de imprinting que regula a expressão de vários genes) Mantém-se no individuo adulto
Sindrome de Prader Willi
Alelo materno do gene SNURF/SNRPN está silenciado por imprintig
Alelo paterno sofreu uma deleção
Sindromo de Angelman
Alelo paterno do gene UBEA3 está silenciado por imprinting
Alelo materno sofreu uma deleção
Inativação do cromossoma X
Aleatório
Durante o desenvolvimento embrionário
Expressão do gene XIST que se liga ao cromossoma X inativando-o
Crm condensa muito formando o corpo Barr
Como reparar uma quebra na cadeia dupla?
Ligação não homologa na ponta
Recombinação homóloga
Ligação não homologa na ponta
1) Quebra limpa por uma nuclease
2) Perdem-se alguns nucleótidos no processo
Recombinação homologa
1) Quando a quebra ocorre em 1 das duas hélices da cadeia filha depois da replicação mas antes da anafase
2) A hélice não danificada pode servir de template
3) Restauração da sequência de DNA original no sitio da quebra
- Reparação sem falhas nem perdas
Nucleossomas
DNA associado a histonas
Alterações pós-traducionais em histonas (modificação covalente)
Metilação
Glicosidação
Fosforilação
Funções da cromatina
Estrutural
Regulador da expressão genética
Epigenética
Processos moleculares capazes de regular a expressão genética sem que haja alteração na sequência do DNA
TATA
Local onde se liga a RNA polimerase
Metilação do DNA
Gene não é transcrito
Ocorre na citosina
Muda a densidade de CpG
Pode ser afetada por fatores ambientais
Síndrome de Rett
Desenvolvimento neuronal anormal Inativavação do X Inviavel nos rapazes Anomalias no tecido muscular e neuronal Perda de capacidades motoras e intelectuais 1:15 000 Mutação no gene MeCP2 do crm X
Genoma mitocondrial
DNA circular
Codifica para 37 genes (ptns da cadeia respiratória, rRNAs, tRNAs)
93% coding region
7% control region
Nucleoide
Várias moléculas de mtDNA muito enroladas
Proteoma mitocondrial
- ptns codificadas mtDNA e sintetizadas na mitocondria
- ptns codificadas por genes nucleares sintetizadas no citosol e importadas para a mitocondria
Taxa de mutação mtDNA
Muito mais alta que o nDNA
Erros na replicação
Dano oxidativo
Mecanismo de reparação menos eficaz
Homoplasmia
Todas as cópias de mtDNA são identicas
Heteroplasmia
Podem coexistir 2 ou mais genotipos mitocondriais
Doenças mitocondriais hereditárias
Mutações em mtDNA (SNPs)
Herança materna
Cadeia respiratória, tRNA, rRNA
Mutações em nDNA
Herança mendeliana
Carga mutacional
Proporção mitocondrias mutadas/mitocondrias normais
Segregação replicativa
Ao longo do tempo aumenta a carga mutacional
Pode vir a aparecer doença em idade mais avançada
Como evitar que mãe com problemas nas mitocondrias passe ao filho?
Injeção intracitoplasmática
Coloca-se o nucleo haploide da mãe no citoplasma dador
Fatores externos que provocam uma mutação
Radioatividade
Radiação UV
Tabaco
Evolução
- Mutações espontaneas ao longo do tempo (na linha germinativa
- As mutações tem de persistir e sobreviver a seleção natural
Intolerância à lactose
Apenas os recem nascidos eram tolerantes
Pressão seletiva levou a que uma mutação que conferia tolerancia persistisse
A variante que dá a lactose aos africanos é a mesma que a de uma pessoa do norte da europa?
Não!
A tolerância veio de uma mutação persistente
No Norte da Europa a maioria das pessoas é tolerante e em África não
Está relacionado com o local onde os nativos começaram usar leite não humano
Fatores de transcrição
Proteínas que regulam a transcrição
1) Fatores gerais: ligam-se à região promotora e facilitam a ligação da RNA polimerase
2) Ativadores (pode ligar-se ao enhancer)
3) Repressores
Variante genética
Patogénica
Não patogénica
Causas para uma proteínas truncada (codão stop prematuro)
Mutação no spliceossoma
Erro no splicing
Mutação pontual
…
Gene BRKA
Associado ao cancro da mama hereditário
Heterozigotia composta
2 mutações em zonas diferentes do locus
Padrões hereditariedade
Autossomica dominante Autossomica recessiva Ligada ao sexo Genes imprinted DNA mitocondrial
1º animal clonado
Rã (1962)
1º mamifero clonado
Ovelha Dolly (1996)
Procedimento de uma clonagem de um mamifero
1) Retirar celulas somáticas de um adulto
2) Extrair o nucleo
3) Usar óvulos não fecundados de um dador sem genoma
4) Introdução do nucleo somático e estimula-se o óvulo eletricamente
5) Zigoto forma embrião e é colocado em “barriga de aluguer”
TATA BOX
Região codificante precedida por promotor
Reconhece o 1ºfator geral de transcrição que se liga ao promotor
DIP
Regiões reguladoras podem encontrar-se a milhares de pares de bases antes do promotor
Mediador
Interface entre polimerase e proteínareguladora
Proteínas ativadores
Podem alterar os genes
Liga-se uma sequência reguladora no DNA e interage com a RNA polimerase
Inicio da transcrição
Como ocorre a ativação do gene em eucariotas?
À distância
Uma proteína ativadora liga-se ao enhancer distante que atrai a RNA polimerase e fatores gerais de transcrição para o promotor
Um dobra permite o contacto entre o ativador e o complexo iniciador
Lisina
Carregada positivamente
Atrai DNA
Provoca a compactação dos cromossomas
Acetilação da Lisina
Perde carga positiva
Perde tendência a ligar ao DNA
Descompactação de cromossomas
A histona H3 pode receber que grupos?
Acetili
Metilo
Fosfato
Que enzima provoca a descondensação da cromatina?
Histona acetiltransferase
Dominios da RNA polimerase
- DNA binding domain
- Activation domain
Funções do activation domain
- Interação com mediador e fatores gerais de transcrição
- Modificação da estrutura da cromatina
Fatores gerais de transcrição
Os mesmos para todos os genes transcritos pela RNA polimerase
Reguladores da transcrição e DNA binding stie
São diferentes para genes diferentes
Célula embrionária
Blastocisto
Indiferenciada
Com possibilidade de originar várias células tendo em conta os reguladores de transcrição
Exemplos de células em que se pode diferenciar a célula embrionária
Célula adiposa Neurónio Macrófago Célula do músculo cardíaco Células gliais
Tipos de clonagem
Reprodutiva: todo o individuo
Terapêutica: apenas células
Nobel da Fisiologia e da Medicina em 2012
Shiny Yamanaka e Sir Jonh B.Gurdon
Reprogramação de células diferenciadas e maturas em células pluripotentes graças a 4 fatores de transcrição
Como se faz a regulação de uma proteína?
- Modificações pós-traducionais
- Ligação de pequenas moléculas
“Locais” do Dogma onde realiza o controlo
Transcrição Processamento Transporte de mRNA e controlo da localização Controlo da degradação do mRNA Tradução Controlo da degradação da proteína Atividade da proteína
Micro RNA
Transcrito no nucleo
Clivado no citoplasma em pequenas sequências
Complementar ao mRNA regulando a sua estabilidade e tradução
Constitui, com uma série de ptns, o RISK (degrada)
Pouco miRNA
RNA mais estável
Maior produção proteica
Anti-miRNA
Oligonucleotido complementar ao miRNA que inibe a sua ligação ao mRNA permitindo a produção proteica
pp6r
Platelet derived growth factor
Plaquetas
Frangmentos de megacariócitos (da medula)
Anucleadas
Intervem na coagulação (libertam ptns que formam o coagulo)
Algumas moléculas sinalizadoras
Esterois (ex:estradiol e testosterona)
Proteinas
Causa para o cancro na mama e na próstata?
Desregulação do estradiol e testosterona (proliferação em demasia)
Como resolver tratar o cancro causado pela proliferação da testosterona?
Administração de um fármaco análogo à testosterona, que se liga ao recetor da célula alvo desta hormona mas que não induz a proliferação
A que se ligam os sinais extracelulares?
Recetores de membrana
Recetores intracelulares
Enzimas
Sinais grandes e hidrofilicos
- Ligam-se ao recetor da membrana
- O recetor cria um sinal intracelular para as moléculas sinalizadoras
Sinais pequenos e hidrofóbicos
- Atravessam a membrana plasmática
- Ativam diretamente as enzimas celulares OU ligam-se a recetores intracelulares
Exemplos de esterois (derivados do colesterol)
Cortisol (para o stress)
Estradiol
Testosterona
Tiroxina
Cortisol
- Atravessa a membrana plasmática
- Liga-se a uma proteína recetora nuclear (citosol)
- Altera a conformação dessa proteína
- Complexo é transportado para o nucleo pelos poros
- Proteína ativa consegue ligar-se a uma sequência reguladora
- Ativação/Repressão da transcrição das células alvo
Tirosina cinase
- Fosforila tirosina dos recetores tornando-a ativa
- Estas tirosinas formam um sitio de acoplação para a ptn sinalizadora intracelular
RTK
Proteína sinalizadora intracelular
Estimula o complexo sinalizador intracelular
Ativa o RAS
RAS
Familia de ptns GTP que permitem que os sinais passem da superficie da celula para o nucleo
Muitos cancros têm uma RAS mutante demasiado ativa
Ativa a MAP-cinase
Células que se dividem mais
Células estaminais do embrião
Tipos de ciclina
M-ciclina (em mitose)
S-ciclina (final de G1) - desencadeia replicação
CDK
Proteína cinase
Ativado pela ciclina (regulação)
Proteossomas
Maquinaria que degrada proteínas danificadas (proteases)
As ptns alvo estão marcadas pela ubiquitina
MAP-cinase ativada
Mudança na atividade da proteína
Mudança na expressão do gene
Elevada concentração de m-ciclina
Formação do complexo ciclina-CDK ativo
Entrada na fase M
Complexo ciclina-CDK
Fosforila proteínas chave para iniciar etapas do ciclo
Ciclina ajuda a encontrar células alvo para CDK fosforilar
Regulação da replicação
Origens de replicação
DNA polimerase
Helicases
ORC
Complexo que reconhece a ori
Fica ligado a CDC6 atraindo helicases
S-CDK
- Atrai DNA polimerases e outras ptns que iniciam a replicação na forquilha de replicação
- Fosforila a CDC6 marcando-a para degradação
- Impede a re-replicação
Centrossoma
Nucleo de crescimento de microtubulos
Na divisão celular duplica-se para formar os dois polos do fuso acromático
Duplicação do centrossoma
Inicio: inicio da fase S
Fim: Fim de G2
Degradação de proteínas
Proteossomas
Lisossomas
Proteínas que regulam a transcrição de vários genes
myc, fos, jun
Proteína-Rb
Do retinoblastoma
Tapa fatores reguladores de transcrição de genes necessários à divisão celular
Tem de estar inativa para a divisão celular
Inativação de ptn-Rb
Fosforilação do complexo ciclina-CDK
p53
Regulador da transcrição que controla a resposta das células ao dano em DNA
Previne a entrada em fase S até estar o dano reparado pela ativação da transcrição de p21
OU
Induz apoptose
Mutações no gene desta proteína são causas de cancro
p21
Proteína que inibe o complexo ciclina CDK
Impede a progressão da fase S
Célula presa em G1
Fosforilação das proteínas do envolto nuclear e laminas
Desmembração do envolto nuclear em profase
Desfosforilação de laminas nucleares e de proteínas do envolto nuclear
Reorganização do envolto nuclear
Em telofase
Perda de ciclina
CDK inativa
Sem mitogenes
Proteína-Rb desfosforilada (está ativa)
Reguladores de transcrição essenciais inativos
Não há divisão celular
Sem danos no DNA
Inativação de p53
Pólipo
Proliferação de células confinadas
Tumor benigno
Torna-se maligno se formarem metastases -> Cancro
Evolução de tumores
Mutações repetitivas
Proliferação
Seleção natural
Grupos de genes em que uma mutação pode evoluir para cancro
- Genes que regulam o ciclo celular (crescimento/proliferação)
- Genes reparadores de DNA
Classificação de genes que quando alterados podem gerar cancro
Oncogene
Gene supressor de tumor
Oncogenes
Dominantes
Originam-se de mutações em proto-oncogenes
-Gene RAS sempre ativo
-Genes myc, fos, jun
Gene supressor de tumor
Em condições normais inibem comportamento canceroso
Inativação ou perda de função de cópias deste gene formam um célula que se comporta como cancerosa
Recessivo (normalmente)
-Gene Rb
-Gene p53
Como tornar um proto-oncogene me oncogene?
1) Mutação pontual, ex:RAS
2) Amplificação do gene. ex:myc ou jun
3) Alteração da região reguladora ou miRNA
Como inativar um alelo?
- Perder um crm que contem gene da divisão celular
- Deleções, translocações,…
- Mutações pontuais com perda de função
- Mecanismo epigenético (histonas, miRNA, imprinting)
BRCA1 e BRCA2
Genes com função reparadora de uma quebra de uma dupla cadeia de DNA no percurso da recombinação homóloga
Xeroderma Pigmentasum
Mutação em qualquer um dos 8 genes que codificam proteínas de reparação
Risco de desenvolver cancros da pele está 1000x aumentado
Morte não programada
Necrose
Ex: enfarte de miocardio
Numero de apoptoses por dia
50/70 milhões
Exemplos de apoptose
Destruição do endométrio
Destruição de células do sistema imunitário
Destruição de células infetadas por virus
Destruição de células com DNA alterado
Durante o desenvolvimento embrionário
Quem executa apoptose?
Proteases de :
- lisossomas
- proteossomas
- caspases
Pro-caspases
Caspases inativas
Cascata proteolitica
Inicia-se quando a pro-caspase iniciadora é ativada
Ativação da apoptose - Via intrinseca
Lesão de DNA Ativação de p53 Canal BAX+BAK abre Sai citocromo da mitocondria Ativa-se caspases Apoptose
Formação do apoptossoma
Citocromo liga-se a uma ptn adaptativa
Complexo de 7 braços que recruta 7 moleculas de uma procaspase iniciadora (procaspase-9)
Procaspase-9 ativa
Ativa a procaspase executora
Ativa cascata de caspases
Apoptose
Ativação da apoptose - Via extrinseca
Há um sinal Liga-se ao recetor FAS Desencadeia ptns intracelulares que formam DISC Ativa caspases Apoptose
DISC
Death inducing signaling complex
Ativa procaspases iniciadores
Dá-se a cascata proteolítica
Apoptose durante o desenvolvimento embrionário
Ajusta o número de neurónios para o número de células alvo
Proteína BCL
Fecha o canal BAX/BAK
Impede a saida do citocromo
Impede apoptose
Apoptose e cancro
Mutação de genes pro-apoptópicos induz cancro
Medicamentos inibem o BCL2 para que ocorra apoptose (defesa do cancro)
Importância do citoesqueleto
Transporte intracelular Variedade das formas celulares Organização de componentes celulares Movimentos intracelulares Movimentos celulares Dita o tipo de contração
Constituição do citosqueleto
Microtubulos (~25nm)
Microfilamentos (~7nm)
Filamentos intermédios (~10nm)
Microtubulos
Filamentos de tubulina ocos Rigidos Filamentos longos e lineares Dispersos no citosol Uma extremidade está ligada ao mMTOC Com 13 profilamentos
Função de microtubulos
Transporte intracelular
Polaridade da célula
Geração de força (mitose)
Movimento celular
Base dos microtubulos
2 centriolos (centrossoma) Nascem de - para +
Microtubulos: instabilidade dinamica, qual a importância?
Durante a divisão
Para a ascensão polar dos crms
Cria uma oportunidade de tratamento (quimioterapia)
Como realizar a estabilização dos microtubulos (criação de polaridade)?
Através de proteínas estabilizadoras
Alterações pós-traducionais nas tubulinas
Proteínas motoras
Deslocam-se ao longo dos microtubulos
Quiresinas (para +)
Dinainas (para -)
Estabilização de microtubulos permite a formação de:
Cilios
Flagelos
Batimento ciliar
Ocorre ao realizar um ciclo repetitivo de batimentos Power stroke (rápido, extensão) -> Recovery stroke (lento)
Sindrome de Kartagener
Infeções respiratórias crónicas
Infertilidade (flagelos imóveis)
Situs Inversus
Ultra-estrutura dos cilios
Moveis 9+2
Moveis 9+0
Imoveis 9+0
Microfilamentos
Filamentos de actina Helicoidais Flexiveis Feixe linear ou em rede Dispersos no citosol Mais abundamentes no cortex celular
Função dos microfilamentos
Gera força Forma da célula Transporte intracelular Fagocitose Movimento celular
Onde estão presentes os microfilamentos
Microvilosidades
Bandas contrateis no citoplasma
Filopodia fingerlike do edge de uma cél. em mov
Anel contratil na divisão celular
Monómeros de actina
Ligados a molécula de ATP
Lamelipodio
Polimerização de actina que forma novas regiões do cortex de actina estabilizando a proteína
Miosina I
Proteína motora que se associa a filamentos de actina
Movimentam para +
Movimentos pequenas vesiculas
1 cauda e 1 cabeça
Miosina II
2 caudas e cabeças
Capacidade contratil
Formam sarcomero
Filamentos intermédios
Tipo corda Força de tensão Dispersos no citosol Familia grande e heterogénea Lamina nuclear Formam tetramero antiparalelo (resistência)
Função dos filamentos intermédios
Resistência estrutural
Elasticidade
Categorias de filamentos intermédios
Citoplasmáticos
Nucleares
Filamentos intermédios citoplasmáticos
Keratina (epitélio)
Vitamina e vimetina relacionada
Neurofilamentos
Filamentos intermédios nucleares
Lâminas nucleares (A, B, C)
Laminopatias
Defeitos em genes codificantes para lâminas
Hutchinson-Gilfor progeria syndrome
Envelhecimento 7x mais rápido
Mutação na posição 1824 do gene LMNA (88%)
Interação genes ambiente
Ambiente altera genes e expressão genética
Genes condicionam a resposta a ambiente
Ambiente “externo” e “interno” (microbioma)
Mudanças fisiológicas
Não cria mutações mas altera a expressão genética
Ativação/Inativação de genes relacionados com doenças pode resultar de :
Anormalidades em cromossomas Amplificação genética Mutações Mecanismos epigenéticos Alterações no splicing e RNA não codificante
Causas das mutações
Ambiente
Erros na replicação
Erros na divisão celular
Alterações quimicas espontaneas
Causas de cancro
Tabaco Obesidade Infeção Sedentarismo Dieta ....
Microbioma
Conjunto de micro-organismos que coabitam no nosso corpo
Bebés que nascem por parto vaginal
Têm maior exposição a micro-organismos
Ajuda na 1ª digestão
Microbioma e doença
Mudanças na população microbiana podem causar doenças
Transplantes de microbiomas alteram o funcionamento do organismo
Sensação de saciedade
Obtida por um sinal lipídico
SCID
Severe Immunodeficiency Disease
Aparecimento de um codão stop que leva ao desaparecimento da ptn codificada por foxn1
Ausência de linfócitos T e B
Solução: Transplante de timo
Gémeos
Haplocompatibilidade
Histocompatibilidade
Células hematopoiéticas
Dão origem às células do nosso sangue
Recetores de linfócitos T e de linfócitos B
TCR e BCR
Moléculas de região variável
Região variável dos linfócitos (VRMs)
Produz vários anticorpos diferentes
Local de ligação do antigénio
Heterodimero
Linfócitos B
Produção de anticorpos
Imunidade humoral, mediada por humores e fluidos de circulação
Interação ptn-ptn
Linfócitos T
Reconhecimento de células e moléculas que expressam
Imunidade celular
Interação cél-cél
Paradoxo de Landsteiner
Como é que o organismo finito, limitado consegue reconhecer qualquer molécula
Tempo somático
Temos a capacidade de gerar variação e seleção
Maior diversidade leva a maior resistência
Diversidade aleatória
Processos moleculares pelos quais se consegue a especificidade
Inconvenientes da variabilidade
Doenças auto-imunes
Onde se armazenam as células diferentes?
Plamócito
Linfócito B após diferenciação que produz cercca de 10 000 moléculas por segundo
Associação das cadeias na heterodimerização
Por ligações dissulfito
Cadeias de BCR
Leves (2 dominios) e pesadas (4 dominios)
Homodimerizam formando Y
CDRs
Complementary determining regions
Zonas especiais de ligação
Genoma da linha germinativa
Não há genes funcionais para BCR e TCR
Herdamos o mecanismo que vai permitir 10^12 anticorpos diferentes
Southern Blot
Digestão do DNA com enzimas de restrição
Eletroforese com migração dependente de carga
Hibridação com sonda com diferentes fragmentos de DNA
Recombinação somática/Rearranjo VDJ
Células B e T tem a capacidade de juntar 2 regiões de DNA
Organização dos fragmentos de DNA em 3 zonas essenciais
V: variavel
D: diversidade
J: Junção
RAG
Recombination activated gene
Gene que codifica um enzima que corta o DNA
RAG 1 e RAG2: Funcionam como um complexo
Específicas dos linfócitos B e T ou dos seus precursores
Cliva apenas nos locais VDJ
RSS
Recombinational signal sequences
Sequências para a RAG atuar
Em BCR e TCR
Sindrome de Omenn
Mutação nos genes RAG
Solução: Transplante de medula óssea
Mecanismos de geração de diversidade
Recombinação somática
Inserção aleatória de nucleótidos
Tdt
Terminal deoxynucleotide transfersa
Inserção de nucleótidos aleatoriamente entre os fragmentos recombinados no rearranjo VDJ
Expresso em adulto
Diferenciação celular
Alterações na expressão génica
Alteração no repertório de proteínas
Alteração no fenotipo
Niveis de regulação da diferenciação
Recetores e transdução do sinal
Fatores de transcrição
Remodelação da cromatina
Origem das células B
células hematopoieticas estaminais que se diferenciam na medula óssea
Desenvolvimento células B
Expressa um recetor cel B especifico
Tem origem no rearranjo de locus para as 2 cadeias
Exerce a função em todo o organismo
Poe ser ativada, tornando-se num plasmócito
Produz anticorpos
Imunglobulina
Recetor B com anticorpo
Rearranjos VDJ
Cadeias pesadas (V, D, J)
Cadeias leves (V e J)
Assíncronos
Primeiro cadeia pesada
Pro-B
Começou o rearranjo do DNA
Não tem proteína derivada
Não há gene funcional
Pre-B
Terminou o rearranjo da cadeia pesada
Há gene, mRNA e proteína
Importância da cadeia leve para celB
Ativação da funcionalidade dos recetores
Permite a cel formar BCR e sair da medula
Homodimeros de cadeia pesada
Não são estáveis
Pre-BCR
Recetor intermédio
Tipo BCR mas com substituição das cadeias leves por 2 ptns VpreB e alfa5 que estabilizam (derivam de genes estruturados)
Permite a passagem de PreB para cel B
Proteínas que derivam de rearranjos
BCR
TCR
Importância de haver uma fase onde só existe a cadeia pesada e a leve não rearranjou
Poupar energia (checkpoint) As que estão mal rearranjadas sofrem apoptose
Recetor da IL-7
Expresso nas fases mais prematuras da diferenciação de cel B e T
Cel pro e pre B altamente dependentes dele até ao checkpoint
Na sua ausencia cel-T não recebem sinais de sobrevivencia
C-kit
Recetor de células estaminais
Fator soluvel que promove o crescimento de células estaminais
Células mãe de cel B dependem deste fator
Agammaglobulinémia
Ausencia de anticorpos na circulação
Mutação que origina o bloqueio do sinal do checkpoinnt
BTK não está funcional -> bloqueio da diferenciação da celB
Ligada ao crmX (mulheres portadoras e homens doentes)
Tratamento: Transplante de medula e controlo da imunossupressão e cel T reguladora
Alteração de DNA à periferia
Hipermutação somática
Mudança de classe
Hipermutação somática
Processo de mudança de afinidade do recetor das cel B para o antigénio
Mutação de nucleótidos isolados na VRM
AID
Enzima responsável por realizar mutações e acumula-las
Muda a sequência do anticorpo
Local de acumulação de cel B
Nodulos linfáticos
Baço
Cel B com menor afinidade para antigénio
Desvantagem competitiva
Estabelecimento de pontes de H com o antigénio eficaz
Vantagem competitiva
Mutação de afinidade
O que muda é a afinidade e não a especificidade
Porção constante do BCR
Função efetora dos anticorpos
Classes em que são produzidos anticorpos na medula
IgD
IgM
IgE
Alergias
IgA
Mucosas
IgG
Infeções
Onde ocorre a diferenciação das células T?
Timo
Funções das cel T
Matam alvos (cel. citotoxicas) Ajudam outras cels do sistema imunitário
Principais categorias de cél auxiliares
Cel TH1 e TH2
Complexo TCR
TCR (recetor) + subunidade Cd3 (elementos de transdução)
ITAM
Imunoreceptor tyrosine-base activation motif
Relacionado com as tirosinas contidas nas CD3
Tirosinas fosforilaveis + ptns da transdução do sinal -> Levam a informação ao núcleo
Porque no timo?
Tem células epiteliais diferentes no cortex e na medula Composto por células: -de origem hematopoiética -do esqueleto -dendriticas
Sindrome diGeorge
Mutação no crm22
Não tem timo nem célT
Ratos nude
Mutação no gene foxn1: fator de transcrição essencial para que as células epiteliais se diferenciem
Timo amorfo
Faces de diferenciação de cel T
Pro T
Pre T
T madura
Desenvolvimento de celulas T (relacionado com CD4 e CD8)
1) Duplamente negativo
2) Duplamente positivo
3) Positivo/negativo dependendo de ser cél auxiliar (CD4+) ou citotoxica (CD8+)
SCID ligada ao X
Mutação no recetor il-7
Tratamento: Transplante de medula óssea
2º recetir naus importante no desenvolvimento de cel T
Pré recetor de cet T
Cél T com 2 cadeias
Alfa, que vem primeiro
Beta, surge no fim do desenvolvimento nas cél CD4+ e CD8+
Pré-TCR-alfa
Ptn que forma o recetor pre-TCR
1º checkpoint
Presença do pré-TCR (só está no timo)
MHC
Complexo de maior histocompatibilidade
Após TCR maduro interage com TCR
Diferentes em cada individuo (problema de transplantação)
MHC-1 a unica classe expressa pelo nosso organismo excepto nos eritrocitos
Seleção negativa
Interação de MHC com TCR muito intensa
Potencialidade autoimune
Célula morre por apoptose
Clonagem molecular
1) Inserção de fragmento de DNA num vetor orginando uma molécula de DNA recombinante
2) Transformação de bactérias
3) Divisão da célula hospedeira
4) Amplificação -> colonia/clone
Vetores de clonagem
Plasmídeos
Genomas bacteriófagos
Carateristicas de um vetor de clonagem
Ori
Marca de seleção (resistência a antibiótico)
Local de policlonagem
Promotor
Gel
Agarose em solução tampão
Corantes fluorescentes que permitem a visualização de uma eletrofores
Ex: Brometo de etídio
Pista/Lane
Área do gel perpendicular ao poço
IPTG
Mais estável Dura mais Não é degradável Liga-se ao repressor Há transcrição
Aplicações terapeuticas de hGH recombinante
Recém nascidos prematuros Insuficiencia renal Nanismo Deficiencia ou mutação do gene Recuperação de fraturas
OD600
Grau de turvação de uma cultura
Quanto maior, mais turva-> há mais bactérias
Biorreator
Local de amplificação da colónia
Porque crescer primeiro e depois formar ptn?
IPTG é tóxico
Ptns não são favorecidas com a produção exógena
SDS-PAGE
Cadeias polipeptidicas formamum complexo negativo de sódio dodecyl (SDS) e portanto migram como moléculas negativas
Mercaptoetanol
Agente redutor
Quebra ligações S-S dentro das proteínas
Citogenética clássica
1) Interrupção da mitose
2) Adição de solução hipotónica
3) Fixação mais espalhamento cromossómico
4) Coloração
5) Montagem do cariótipo
Citogenética molecular
FISH
Hibridação genómica comparativa (CGH)
Cariotipagem espetral (SKY)
Teste de diagnóstico pre-natal
Cariótipo convencional São usadas cels do liquido amniótico Critérios: -Tamanho -Posição do centrómero -Bandeamento
Teste citogenética convencional
Processo demorado Mais barato Identifica: -Anomalias numéricas -Anomalias estruturais mais visiveis
Vantagens do FISH
Mais fácil Mais rápido Não implica bloqueio em metafase Mais especifica Permite verificar translocações
Cariótipo humano permite detetar anomalias:
- cancerigenas
- hereditárias
PCR
Permite a obtenção de inumeras cópias de uma determinada sequencia de DNA
Usa-se polimerase in vitro
RT-PCR
Amplifica um segmento nucleotídico a partir de RNA
Etapa prévia: Transcriptase reversa
Fases de PCR
1) Aumento exponencial do produto amplificao
2) Diminuição da velocidade da reação
PCR quantitativo
Produto da reação está marcado com fluorescência Permite quantificar os produtos Mais rápido que PCR convencional Não pode ser analisado no plateau Mais caro
Componentes de PCR
Primers DNA polimerase DNA molde Nucleótidos livres Tampão onde a atividade da enzima é máxima Água
Tipos de primers
Forward: liga-se a 3’-5’
Reverse
Controlo negativo
Não há DNA molde mas sim água
Polimorfismos (exemplos)
SNPs
VNTRs
Inserção de transposões
Polimorfismo (o que é)
Variante alelica comum a mais de 1% da população
Testes preditivos
Suscetivel
Pré-sintomático
Tipos de testes
Preditivos Diagnóstico De potador De suscetibilidade De farmacogenética
STRs
Nos VNTRs
2-7 nucleótidos repetidos em bloco
Tem multiplo alelos
Index System (Codis)
13 STRs
Para o teste ter validade
Varfarina
Anticoagulante
Interfere no ciclo de reciclagem hepática da vitamina K
Inibe vitamina K redutase
Trava a ação do fármaco (tem antagonista)
Metodologia para analisar polimorfismo de itneresse
Isolar DNA de céls sanguineas Usar como molde para 3 regiões diferentes PCR dessas 3 regiões Digerir produtos de PCR pelas enzimas Eletroforese
Pressupostos para ivestigação biológica de paternidade
Par pai-filho verdadeiro
Relação biológica mãe-criança é segura
Pai não tem irmão gémeo monozigótico
Mãe e pai pertencem à mesma população
IP
Indice de paternidade
Calculado para cada STR
PCR multiplex
Permite amplificação de vários fragmentos ao mesmo tempo com vários primers ao mesmo tempo
Custo adicional ao desenhar primers
Doença autossómica recessiva é causada por:
Homozigotia
Heterozigotia composta
Tipos de mutações
Frame shift: deleção, inserção,…
Silenciosa
Missense (difere a.a)
Non-sense (codão stop)
OMIM
Doenças genéticas mendelianas
HIV - células alvo
Linfócitos T CD4+
Terapêutica contra HIV
Anti-retrovirais (ex:AZT)
Inibidores de transcriptase reversa
Inibidores de protease viral
HAART
Terapia anti-retroviral combinada
Diminui a carga viral
Aumenta CD4+
Motivo para a terapia deixar de funcionar
Resistência aos medicamentos
Sequenciação de nova geração
Permite determinar a ordem dos nucleótidos
Resposta rápida
Maior número de genes analisados
Permite sequenciar estirpes raras
Retrovirus
Derivados de um retrotransposão
O DNA é sintetizado usando um RNA template
Ciclo de vida de um retrovirus
1) Molécula de RNA coberta por duas camadas ( p120 e p17)
2) Atuação da transcriptase reversa -> cadeia de cDNA
3) DNA dupla-hélice
4) Integração num crm (enzima integrante)
5) Sintese de RNA viral + transcrição + tradução
HIV
Virus latente (escondido)
Integrase
Tem um sequencia de a.a que mimetiza o sinal nuclear e entra no núcleo
Quando aparecem os sintomas de HIV?
Quando o linfócito sofre apoptose
Filhos de 3 progenitores
Possibilita a prevenção de doenças herdadas do genoma mitocondrial (vem da mãe)
Diagnóstico pré-implantatório
Análise de embriões antes de se realizar a implantação ou de oocitos antes da fecundação
Evita abortos espontaneos
Congelamento de células do cordão umbilical
O cordão umbilical é uma fonte rica em células estaminais
Usadas para regenerar sangue e sistema imunitário
Blastómeros
Totipotentes
Falsos positivos na clonagem em vetores
Vetores não digeridos
Mega plasmídeo
Lisozima
Enzima que hidrolisa a parede bacteriana
PCR-RFLP
Vai permitir a extração de células e determinação do seu genótipo para um polimorfismo funcional
1) PCR
2) Digestão por enzimas de restrição
3) Separação por eletroforese
SNPs
Mais frequente
Possuem 2 alelos
VNTRs
Variavel inclui minissatélites e micro-satélites (STRs)
Sequência com um número variável de nucleótidos repetidos em tandem num determinado locus
Polimorfismo funcional
Expansão de função em exões de genes codificantes
ex: sistema AB0
RFLP
Permite a identificação de diferentes alelos com base na presença ou ausência de sequências reconhecidas por enzimas de restrição
Individuo Homozigótico
Uma banda
PCR não digerido
Grupos sanguineos
Associados à presença de antigénios na superficie dos eritrócitos
