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Wie funktioniert eine Golden Gate Klonierung?
Golden Gate Klonierung (seamless cloning)
- ohne Hinterlassen von Erkennungssequenzen: Typ IIs Restrikrionsenzyme schneiden außerhalb der Erkennungssequenzen und generieren nicht-palindromische Überhänge, die nach Ligation mit DNA-Ligase (T4) keine Schnittstelle aufweisen
- Hochdurchsatz: gleichzeitige Zusammenbau mehrerer DNA-Fragmente
Wie beeinflusst die Phosphorylierung die Pol-Aktivität?
RNAPII hat CTD, deren Serine 2 und 5 phosphoryliert werden können.
- S2P beeinflusst die Initiation der Transkription
- S5P stoppt die Polymerase am Ende des Exons für co-transkriptionalen Splicing
Welches Gen wird am wahrscheinlichsten über Translation reguliert?
a. Gen mit stabiler mRNA, stabilem Protein
b. Gen mit stabiler mRNA, instabilem Protein
c. Gen mit instabiler mRNA, stabilem Protein
d. Gen mit instabiler mRNA, instabilem Protein
Welches Gen wird am wahrscheinlichsten über Translation reguliert?
a. Gen mit stabiler mRNA, stabilem Protein
b. Gen mit stabiler mRNA, instabilem Protein
c. Gen mit instabiler mRNA, stabilem Protein
d. Gen mit instabiler mRNA, instabilem Protein
je stabiler, desto länger dauert es, Proteinmenge zu verdoppeln
Wie funktioniert Southern-Blot? Für welche Substanz wird die Methode angewendet?
Southern-Blot
Für Detektierung von dsDNA
- ZielDNA + RE
- Gelelektrophorese
- Denaturieren in alkali
- Auf Membran übertragen (Kapillarblot)
- Markierung (labelling)
- Denaturation mit Temperatur
- Hybridisierung zur ZielDNA
Welches Reaktionsprodukt der Kettenverlängerung wird für die Visualisierung der Pyrosequenzierung genutzt?
Pyrophosphat PPi als Nebenprodukt der Kettenverlängerung
- DNAn + dNTP → DNAn+1 + PPi
- PPi + APS (Adenosinphosphosulfat) → ATP
- Luciferase + ATP → Oxoluciferase (leuchtet)
Welchen Zelltyp brauchen Sie für die Durchführung eines ChIP-Seq Experiments?
a. Muskelzelle
b. Nervenzelle
c. B-Zelle
d. Epidermizelle
Welchen Zelltyp brauchen Sie für die Durchführung eines ChIP-Seq Experiments?
a. Muskelzelle
b. Nervenzelle
c. B-Zelle
(immer B-Zellen + AK)
d. Epidermizelle
Was ist Kreuzhybridisierung? Wann tritt sie auf?
Kreuzhybridisierung
Unerwünschte Fehlpaarungen zwischen ssDNA und Sonde bei der Hybridisierung
Tritt bei niedrigeren Stingenz auf.
Welche Klonierung würden Sie nutzen, wenn Sie das ganze Genom klonieren möchten? Wie funktioniert diese Art der Klonierung?
Shotgun-Klonierung
- Die gewünschte Sequenz wird in kleine Abschnitte mit Restriktionsenzymen geschnitten
- Genauso werden die Vektoren von gleichen RE geschnitten
- Vektoren und Sequenzen haben sticky ends
- Inkubation mit Ligasen
- Ergebnis: Kollektion aus rekombinanten Plasmiden mit veschiedenen DNA-Fragmenten
Ein PCR-Zyklus besteht aus:
a. drei Schritten: Denaturierung, Primer Annealing, Elongation
b. drei Schrtitten: Denaturierung, Initiation, Elongation
c. drei Schritten: Primer Annealing, Elongation, Termination
d. drei Schritten: Initiation, Elongation, Termination
Ein PCR-Zyklus besteht aus:
a. drei Schritten: Denaturierung, Primer Annealing, Elongation
b. drei Schrtitten: Denaturierung, Initiation, Elongation
c. drei Schritten: Primer Annealing, Elongation, Termination
d. drei Schritten: Initiation, Elongation, Termination
Plasmide, die multy-copy vorliegen, nennt man ______
Relaxierte Plasmide
Welche enzymatische Aktivitäten brauchen Sie für Golden Gate Klonierungen?
Typ IIs Restriktionsenzyme (Endonucleasen) und Ligasen
Welche Methoden der Genome Editing gibt es?
Genome Editing
Sequenzspezifische Nucleasen
- Zink-Finger Nucleasen
- TALENs
- CRISPR-Cas9
Welche der folgenden DNA-Bindeproteine interagiert sequenzspezifisch mit DNA?
a. Histon H3
b. DNA Polymerase
c. NF-kB
d. RNA Polymerase
Welche der folgenden DNA-Bindeproteine interagiert sequenzspezifisch mit DNA?
a. Histon H3
b. DNA Polymerase
c. NF-kB
ein TF
d. RNA Polymerase
Dasselbe PCR-Produkt wurde mit der Illumina-Platform sequenziert. In den einzelnen Sequenzier-reads gibt es keine Ambiguität mehr. Warum? Welche informatische Analyse machen Sie, um Ihre Hypothese zu testen?
Illumina: Einzelmolekülsequenzierung, in den Clustern wird nur 1 DNA-Stück amplifiziert, z.B. nur ATC und getrennt nur ACC.
Sänger: in einer Lösung alle DNA-Stücke
Bioinformatik → Mapping, müsste dann 50/50 sein.
Welche Probleme können bei der ChIP-Seq auftreten, wenn mehrere Transkriptionsfaktoren an DNA gebunden sind und wie lässt sich das verbessern?
Probleme bei der ChIP-Detektion
- Normalerweise wenn TF gebunden, gibt es keine Reads → Bindestelle bestimmt
- Wenn mehrere TFs: Überlappung der Reads, Bindestelle nicht zu bestimmen
- Fehlende Strandsymmetrie (glatte Enden falsch erzeugt)
Lösungen
- Tag-Verschiebung: Länge des Fragments bestimmen und auf Länge/2 die Reads verschieben
- Fragment-Verlängerung: Sequenz-Tag wird in 3´-Richtung auf vorige Länge verlängert
Wie können Sie ohne Restriktionsenzyme klonieren?
Gibson assembly
overlapping ends über PCR → Exonucleasen schneiden am 5´-Ende → sticky ends → DNA-Polymerase + Ligase füllen die Lücken auf
Welche Vorteile und Nachteile hat CRISPR-Cas9?
CRISPR-Cas9
+ sehr einfaches Design: nur sgRNA, ZNF und TALEN - Proteindesign
- Spezifität begrenzt: nur 20 nt (die Länge der crRNA), viele off-Targets
In einer Northern-Hybridisierung mit einer Ribosonde erhalten Sie zu viele unspezifische Banden — Kreuzhybridisierungen. Wie können Sie diese vermindern?
Höhere Stringenz anzuwenden: hohe Temperatur, niedrigere Salzkonzentration und hohe Konzentration der denaturierenden Detergenzien
Was ist Ion Torrent Sequencing? Wie funktioniert die Methode?
Ion Torrent Sequencing
pH-Änderung durch H+, der durch Kettenverlängerung entsteht
Was ist der Unterschied zwischen dye terminator und dye primer sequencing?
Dye terminator
- Fluorophore kovalent an ddNTPs gebunden (am 3´-Ende)
Dye primer
- Primer mit Fluorophor-Nukleotiden (am 5´-Ende)
Kann derzeit CRISPR-Cas9 in der Therapie verwendet werden und wie?
Nein, wegen off-Targets.
- SNPs, jeder Patient muss sehr gründlich untersucht werden
- Identifikation der off-Targets ist ineffizient (Frequenz muss 0,1 % sein)
Wie funktioniert eine Gateway-Klonierung?
Gateway-Klonierung
- Erzeugung eines attB-PCR-Produkts: mit spezifischen Primern, die am 5’-Ende die attB-Stellen tragen
- Erzeugung eines Entry Clones: (BP-Reaktion). ccdB-Gen (im Donor-Vektor mit Resistenz) gegen das PCR-Produkt, nur erfolgreiche Transformanten überleben, weil ccdB Selbstmord auslöst.
- Erzeugung des Expressions-Vektors: Reaktion zwischen Entry Clone und Ziel-Vektor (LR-Reaktion). Ziel-Vektor hat eine andere Antibiotika-Resistenz als der Entry Clone. Bei-Produkt - ccdB tragendes Plasmid.
Enzyme: Clonasen (Integrase + IHF + Exzisionase)
Wie funktioniert eine Gilbert-Maxam-Sequenzierung?
Gilbert-Maxam-Sequenzierung
- Chemischer Abbau der DNA in der Probe (basenspezifische Spaltung)
- bestimmte Chemikalien induzieren den Bruch
- 4 Proben: schneidet hinter G, hinter A+G, hinter C+T, hinter C
- geschnittene DNA wird an den Enden markiert
- Gel: kleine kürzere Fragmente unten, größere – oben
Während die PCR läüft, steigt die Fluoreszenz ab einem bestimmten Zeitpunkt in beiden Ansätzen. Welcher Prozess erklärt dies?
a. TaqMan-Sonden werden zu Nukleotiden abgebaut
b. TaqMan-Sonden werden zu kleinen Oligonukleotiden abgebaut
c. TaqMan-Sonden werden als intakte Oligos vom Template gelöst
d. TaqMan-Sonden dienen als Primer für Taq-Polymerase
e. TaqMan-Sonden werden in den neu synthetisierten DNA-Strang eingebaut
Während die PCR läüft, steigt die Fluoreszenz ab einem bestimmten Zeitpunkt in beiden Ansätzen. Welcher Prozess erklärt dies?
a. TaqMan-Sonden werden zu Nukleotiden abgebaut
b. TaqMan-Sonden werden zu kleinen Oligonukleotiden abgebaut
c. TaqMan-Sonden werden als intakte Oligos vom Template gelöst
d. TaqMan-Sonden dienen als Primer für Taq-Polymerase
e. TaqMan-Sonden werden in den neu synthetisierten DNA-Strang eingebaut
Welche zwei Erfindungen machen es möglich, dass die PCR kostengünstig und effektiv in jedem Labor eingesetzt werden kann?
- Taq-Polymerase
- Synthese von Oligos
Welche dieser Schritte ist wichtig für die Erstellung eines Templates für NGS?
- DNA-Isolierung
- Zerkleinern der DNA in kleinere Fragmente
- Überprüfen der Qualität und Quantität der DNA-Fragmente
- Alles oben genannte
Welche dieser Schritte ist wichtig für die Erstellung eines Templates für NGS?
- DNA-Isolierung
- Zerkleinern der DNA in kleinere Fragmente
- Überprüfen der Qualität und Quantität der DNA-Fragmente
4. Alles oben genannte
Was bedeuten hier die Zahlen von Absorption an den Stellen?
- 230 nm
- 260 nm
- 280 nm
Welche Substanz ist dargestellt?
230 nm — andere Substanzen (Ethanol, Lösungsmittel usw.)
260 nm — DNA-Absorptionspeak
280 nm — andere Proteine
DNA-UV-Vis
Welche dieser Methoden detektiert DNA-Protein-Interaktionen in vivo?
a. ChIP und ChIP-Seq
b. Footprinting
c. EMSA
Welche dieser Methoden detektiert DNA-Protein-Interaktionen in vivo?
a. ChIP und ChIP-Seq
b. Footprinting
c. EMSA
Welche enzymatische Aktivität/en hat DNA-abhängige DNA Polymerase?
DNA-abhängige DNA Polymerase
Sie wird oft bei der PCR eingesetzt und hat 3 enzymatische Aktivitäten:
- 5’-3’ DNA Polymerase (Kettenverlängerung)
- 5’-3’ Exonuclease (Primer-Entfernung auf dem Weg)
- 3’-5’ Exonuclease (proof reading)
Was ist das Besondere in C.elegans und wie kann eine Genomanalyse beim Wurm gemacht werden?
C.elegans
- RNAi ist leicht anzuwenden durch Verfütterung von E.coli-Stämmen, die RNAi-Gene exprimieren → knock-down
- Knock-down Untersuchung vom Genom: das RNAi-Signal kann verstärkt werden
- dsRNA einbringen
- Dicer schneidet dsRNA in kleine siRNA (small interfering)
- Ago + siRNA = RISC, Ago hybridisiert mit der DNA
- Ago schneidet nicht, sondern rekrutiert RdRP (RNA-abhängige RNA-Polymerase), die siRNA als Primer nutzt
- Dabei wird noch mehr dsRNA produziert → mehr siRNA usw.
Was bedeutet die Abkürzung CRISPR-Cas9?
CRISPR-Cas9
Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPRs) and CRISPR-associated (Cas) proteins
Wovon ist die Transkriptionsrate abhängig? Nennen Sie 3 Hauptfaktoren.
Transkriptionsrate ist abhängig von
- Geschwindigkeit von RNA Polymerase
- Initiationsrate (Häufigkeit, mit der RNAP anfangen)
- Chromatin-Dichte
Mit welcher Methode können Sie die Genklasse identifizieren?
Gro-seq: Beobachtung der Reads-Änderung (z.B. Stress-gene haben rasche Einschaltung nach dem Reiz)
Was ist das Problem von Oligos/RNA-Sonden gegenüber der DNA-Sonde, wenn es um eine DNA-Selektion geht?
Mit Oligos/RNA-Sonden wird nur eine der beiden DNA-Strände hybridisiert.
CRISPR-Cas Loci sind auch in Phagengenomen gefunden worden. Welchen Vorteil könnte der Phage davon haben?
Bei der Doppelinfektion die Konkurrenz anderer Phagen zu vermeiden
Was bedeuten die Peaks bei der ChIP-Analyse? Wie können sie verwendet werden?
Die Peaks sind Anzahl der Reads, befinden sich in der Nähe von Promotoren/Enhancer.
Gene ontology vom Peak-Region bestimmen → Funktion
Mit welchem Protein erfolgt eine Zirkularisierung von mRNAs und wie beeinflusst sie die Translation?
Zirkularisierung erfolgt über PABP (polyadenylate binding protein), die an das Poly-A-Schwanz und an eIF4G an der Cappe bindet. Das erhöht die Translationsrate um 30-100 mal.
Wie wird CRISPR-Cas für genomweite Screening angewendet?
Genomweite Screening
- Design von 3-4 sgRNAs für 18k Gene
- sgRNAs werden in den viralen Vektor aus Lentiviren eingebracht (oligo assay synthesis)
- Trasfektion
- Selektion
- Analyse vom gebliebenen sgRNA-Pol
- Zuerst von jeder sgRNA gleich viel (grün)
- Wenn essentielle Gene zerstört → Zelle stirbt und wenig sgRNA (Verschiebung)
- Gene rank ausbilden: wie häufig sind sgRNAs im Vergleich zur Durchschnitt → Gengruppen funktionell definieren
A. Wenn A größer als B ist
B. Wenn B größer als A ist
C. Wenn die beiden gleich groß sind
A. Die Zahl der freien Primer in Probe A nach 4 Zyklen
B. Die Zahl der freien Primer in Probe A nach 10 Zyklen
A. Wenn A größer als B ist
B. Wenn B größer als A ist
C. Wenn die beiden gleich groß sind
A. Die Zahl der freien Primer in Probe A nach 4 Zyklen
B. Die Zahl der freien Primer in Probe A nach 10 Zyklen
Nennen Sie einen technischen Nachteil von Gro-Seq gegenüber Net-Seq.
Gro-seq
- Kernstress bei der Isolation
Welche zwei Mechanismen werden verwendet, um DNA-Doppelstrangbrüche zu reparieren?
DNA-Doppelstrangbrüche (DSB)
- Non-homologous end joining (NHEJ): direkte Ligation von freien Enden, zufällig und fehleranfällig
- Homology directed repair (HDR): die Stränge werden nach dem Template repariert (Donor-DNA) über homologe Rekombination
Wie können dsRNA erzeugt werden? Nennen Sie 2 Möglichkeiten.
Doppelsträngige RNA
- Reverse Komplementarität: Gene auf einem Genom/Stelle, jedoch unterschiedliche Richtungen → dsRNA
- 2 Transkripte: Gene auf unterschiedlichen Genomen/Stellen → ssRNA, die miteinander hybridisieren
Wie wird die guideRNA für die Genomeditierung hergestellt und welche Rolle spielt sie für den Prozess?
sgRNA
crRNA + tracrRNA zusammengeklebt;
- dadurch ist keine Maturation mehr nötig
- sehr einfach herzustellen
- vereinfachter Prozess: stöchiometrischen Mengen (Konzentration) von cr/tracrRNA müssen nicht mehr gemessen werden um das Ergebnis zu bekommen
Ordnen Sie die Aussagen zu.
A. 5´ nach 3´ Elongationsaktivität der Taq-Pol
B. 5´ nach 3´ Exonucleaseaktivität der Taq-Pol
C. beide
D. keine von beiden
- erzeugt Phosphodiesterbindungen
- schneidet
- schneidet Wasserstoffbindungen
- ist Primer-abhängig
- baut die Primer zu Mononukleotiden
- baut TaqMan-Sonden zu Mononukleotiden ab
- hat Proofreading-Aktivität
- 5´ nach 3´ Elongationsaktivität der Taq-Pol erzeugt Phosphodiesterbindungen
- 5´ nach 3´ Exonucleaseaktivität der Taq-Pol schneidet
- keine von beiden schneidet Wasserstoffbindungen
- 5´ nach 3´ Elongationsaktivität der Taq-Pol ist Primer-abhängig
- keine von beiden baut die Primer zu Mononukleotiden
- 5´ nach 3´ Exonucleaseaktivität der Taq-Pol baut TaqMan-Sonden zu Mononukleotiden ab (Quencher enfernt → Signal vom Sonde)
- keine von beiden hat Proofreading-Aktivität
Wovon ist der DNA-Schmelzpunkt abhängig?
DNA-Schmelzpunkt ist abhängig von:
- pH — wenn hoch, sind die Basen geladen und DNA ionisch → schlechte Hybridisierung wegen Abstößung
- Ionenstärke — Hydrathülle um DNA
- Basenzusammensetzung — GC-Gehalt (nicht wegen WBB, sondern größere Stapelkräfte)
- Länge
- Viskosität — macromolecular crowding: höhe Viskosität → Basen werden verdrängt und hybridisieren besser
- Mismatches — perfekte Passung erhöht den Schmelzpunkt
- Probenkomplexität
- Hybride RNA-RNA sind stabiler als RNA-DNA
- Destabilisierende Agenzien
Welche Kontrollen gibt es bei der ChIP?
ChIP-Kontrollen
- Input DNA: Chromatin ohne IP, direkt nach dem Ultraschall
- Keine AK (lgG): IP ohne/mit unspezifischen AK
- Kein Tag: IP von der Probe ohne getaggtes Protein
Welche Ereignisse passieren co-transkriptionell bei den Eukaryoten?
Co-transkriptionelle Ereignisse
- Splicing
- RNA-Editierung
- Capping
- DNA-Reparatur
Welches dieser Enzyme spielt keine essentielle Rolle bei der RNAi?
a. Endonuclease
b. Dicer
c. Argonaute (Ago)
d. Topoisomerase
e. RNA-abhängige RNA Polymerase
f. RNA Polymerase II
Welches dieser Enzyme spielt keine essentielle Rolle bei der RNAi?
a. Endonuclease
b. Dicer
c. Argonaute (Ago)
d. Topoisomerase
e. RNA-abhängige RNA Polymerase
f. RNA Polymerase II
Warum ist CRISPR/Cas9 so viel besser als TALENs / ZFNs?
CRISPR-Cas9
Sehr einfaches Design: nur sgRNA (tracr+cr), bei anderen - Proteine designen.
Sie haben einen im Wasser gelösten DNA-Einzelstrang. Was müssen Sie hinzufügen, um einen komplementären Strang zu synthetisieren?
dNTPs, DNA-Polymerase, Primer, Puffer
Hat eine DNA-abhängige DNA Polymerase proof reading?
Proof reading bei der DNA-abhängigen DNA Polymerase
- 3’-5’ Exonuclease-Aktivität
Beim Fehler merkt das DNAP, kehrt zurück, entfernt die Fehlpaarung und verbindet weiter.
Mit welcher Methode können Sie die Pausierungsstellen von
a. RNAP
b. Ribosomen
analysieren?
Pausierungstellen-Detektion
- Net-seq: alle 20 nt Pause wegen Histonen
- Ribo-Seq: zwischen Peaks auch
Was macht Alpha-Amanitin mit den RNA Polymerasen und wozu kann der Stoff angewendet werden?
Alpha-Amanitin
- Stoppt die RNAP
- Hat verlangsamte Wirkung, sodass transkriptionale Regulatoren simuliert werden können!
Was bedeutet 3C (mit Skizze) und welche Frage beantwortet dieses Experiment?
3C: Chromatin Conformation Capture
Gibt es die Interaktionen zwischen Abschnitten im Genom in 3D-Struktur? (über Kontaktstellen)
Wie wird RNAi in C.Elegans oder Arabidopsis verstärkt?
RNA-abhängige RNA Polymerase sieht siRNA als Primer und verlängert RNA zu dsRNA
Welche Arten der Sequenzierung gibt es?
Sequenzierung
- Gilbert-Maxam: basenspezifische chemische Spaltung (nach dem bestimmten Nukleotid wird gespalten und markiert; je nach Länge das Gel ablesen)
- Sänger: ddNTPs mit DNAP und radioaktiven Primern, nach dem Einbau ist Abbruch → sequencing ladder im Gel
- Dye terminator sequencing: Fluorophore binden an ddNTPs am 3´-Ende → Gel/Kapillare
- Dye primer sequencing: Primer mit Fluorophor, am 5´-Ende → Gel/Kapillare
- Pyrosequenzierung (454): PPi + APS → ATP + Lux → Blitze
- Solexa/Illumina: Oberflächensequenzierung (DNA-Adapter auf Oberfläche + Primer → Brückenamplifikation → Cluster → Einzelbasenverlängerung)
- Ion-Torrent: pH-Änderung durch H+, der durch Kettenverlängerung entsteht
- SMRT (single molecule real time sequencing)
- Nanopore: DNA als ssDNA über Nanopore, Basen interagieren mit Porenelementer und erzeugen Strom → Sequenzierung
Was ist eine Pro-Seq? Welche Vor- und Nachteile hat die Methode?
Pro-seq (precision nuclear run-on and sequencing)
+ Transkriptionsrate-Messung
+ nukleotidgenaue Auflösung von Pol-Position → Endpunkt der Transkription
- nur in Zellkultur möglich
- markierte Nukleotide und Kernisolation
- neue Initiationen während “run-on“-Stufe
- Letzte Base wird stark geändert → Nach dem Einbau keine Transkription mehr
- Endpunkt dadurch bestimmen: Isolieren über AK, qRT-PCR, 3´-Ende-Sequenzierung
Welche Möglichkeiten nutzen eukaryotische Zellen, um die Initiation der Translation zu regulieren?
Regulation der Translation
- Aktivierung von Translationsfaktoren wie eIF4F
- miRNAs
- Zirkularisierung
Welche Methode würden Sie nutzen, um die Introns/Poly-A-Stellen zu lokalisieren?
Net-seq erlaubt eine Detektion von Introns/Poly-A-Stellen: naszierende RNA mit der reifen RNA vergleichen (RNA Seq) und die Stellen, die ausgeschnitten werden, finden.
Wie kann man ausschließen, dass Dolly durch eine nicht erkannte Befruchtung entstanden ist?
Es wurden bei der Klonierung 2 unterschiedliche Rassen verwendet, die sich phänotypisch unterscheiden. DNA kann auch untersucht werden.
Wie funktioniert ein ChIP-Seq? Beschreiben Sie kurz die Schritte.
ChIP-Seq
Chromatin-Immunopräzipitation
- Cross-linking mit Formaldehyd: DNA wird über Formaldehyd mit Proteinen vernetzt
- Zellyse und Ultraschall (Sonication): DNA-Protein-Hybride werden zerkleinert
- Immunopräzipitation: spezifische “Beads” mit primären Antikörper gegen bestimmtes Chromatin/Modifikation oder Epitop-Tag (vorher Proteine genetisch modifiziert)
- Antibody-Bead-Complex: Gewünschte DNA-Protein-Hybride an Beads gekoppelt → Eluation → Purification
- Sequenzierung und Library-Erstellung: glatte Enden erzeugen, Adapter mit Barcode ankleben, PCR, dann Illumina und Gene mapping
Welche Arten der Genklonierung gibt es?
- TA-Klonierung: nach dem Schneiden sticky ends, der Vektor hat auch passende Enden
- TOPO-Klonierung: am Vektorende Topoisomerasen für DNA-Entwindung → bessere Ligation nach dem Schneiden, Primer bestimmen Richtung
- Shotgun-Klonierung: Genom wird in kleinen Abschnitten geschnitten, in Vektoren eingebracht → Kollektion aus Plasmiden mit DNA-Fragmenten
- Gateway-Klonierung: ortspezifische Rekombination (Integration ins Genom) mit Enzymen Clonasen (Integrasen, IHF, Excisionasen), Vektoren müssen att-Sequenzen (attachment) haben.
- Golden Gate: Restriktionsenzymen Typ IIs, die in der Nähe von Erkennungssequenzen schneiden und nach der Ligation keine Schnittstellen hinerlassen
- Gibson assembly: overlapping ends über Primer in PCR, dann mit Exonucleasen sticky ends erzeugen → Hybridisierung → DNA-Pol und Ligase füllen die Lücken auf
Homozygote Mausmutanten von Dicer sterben bereits als Embryo, obwohl kein Virenbefall und damit auch keine siRNA-Abwehr nötig war. Warum?
miRNAs spielen auch dabei große Rolle
Über Dicer-Schneiderei werden nicht nur siRNA, sondern auch miRNAs produziert, die für Embryogenese wichtig sind, weil sie eine regulatorische Funktion haben.
Was gilt für das dem Amplifikat in A zugrunde liegende Template?
A. Seine Kopienzahl ist ungefähr 30 mal häufiger als in B
B. Seine Kopienzahl ist ungefähr 5 mal häufiger als in B
C. Seine Kopienzahl nahm ungefähr 30 mal ab relativ zu B
D. Seine Kopienzahl nahm ungefähr 5 mal ab relativ zu B
E. Seine Expression nahm um den Faktor 5 ab
Was gilt für das dem Amplifikat in A zugrunde liegende Template?
A. Seine Kopienzahl ist ungefähr 30 mal häufiger als in B
- ΔCt = Ct(B) - Ct(A) = 18 - 13
- Ct(B) ist um 5 Zyklen verschoben im Vergleich zu A
- Auf dem Skala ist ein logarithmisches Verhältnis dargestellt → 25 = 30
- Die Kopienzahl von A ist ca. 30 mal häufiger als in B
Die ideale Temperatur für Taq-Polymerase ist:
a. 37°
b. 42°
c. 72°
e. 95°
Die ideale Temperatur für Taq-Polymerase ist:
a. 37°
b. 42°
c. 72°
e. 95°
* Taq-Polymerase überlebt zwar bei 95°, ist aber nicht in ihrem t-Optimum.
Was ist eine Blau/Weiß-Selektion?
Blau/Weiß-Selektion
- Falls die Insertion fehlerhaft/nicht stattgefunden:
- LacZ*-Gen intakt, von RE nicht geschnitten → β-Galactosidase
Gal-X → Gal + X (Blau)
- Falls die Insertion erfolgreich:
- LacZ*-Gen nicht funktioniert, weil RE geschnitten → keine β-Galactosidase → weiß
Was isr der primäre Zweck der Ultraschallbehandlung in einem ChIP-Experiment?
a. Verkürzung der Chromatinfragmente
b. Aufschmelzen von dsDNA zu ssDNA
c. Die Viskosität in der Probe zu erniedrigen
d. Proteine von DNA zu entfernen
Was isr der primäre Zweck der Ultraschallbehandlung in einem ChIP-Experiment?
a. Verkürzung der Chromatinfragmente
b. Aufschmelzen von dsDNA zu ssDNA
c. Die Viskosität in der Probe zu erniedrigen
d. Proteine von DNA zu entfernen
A. Wenn A größer als B ist
B. Wenn B größer als A ist
C. Wenn die beiden gleich groß sind
A. Die Zahl der Amplifikate in Probe A nach 20 Zyklen
B. Die Zahl der Amplifikate in Probe B nach 20 Zyklen
A. Wenn A größer als B ist
B. Wenn B größer als A ist
C. Wenn die beiden gleich groß sind
A. Die Zahl der Amplifikate in Probe A nach 20 Zyklen
B. Die Zahl der Amplifikate in Probe B nach 20 Zyklen
Weniger Zeit für größere Fluoreszenz → mehr Amplifikate gemacht, mehrere Sonden geschnitten
Wie kann Cas9 in der Gentherapie eingesetzt werden, um Erbkrankheiten, wie z.B. cystische Fibrose zu heilen?
Cystische Fibrose entsteht durch eine Punktmutation. Durch CRISPR-Cas könnte diesen Abschnitt ausgeschnitten werden und durch Donor-DNA ersetzt werden (HDR). Das Problem ist aber die Anlieferung von Komponenten (Donor-DNA) und off-Targets.
Woraus entsteht Noise in der ChIP-Seq?
Noise in der ChIP-Seq
- Chromatinkonformation
- Sequenzbias
- Mappability
Wie kann man nach der ChIP eine DNA-Library erstellen? Angenommen, Sie verwenden Illumina-Sequenzierung.
DNA-Library mit Illumina
- Glatte Enden (blunt ends) von DNA-Fragmenten erzeugen
- Am 3´-Ende ein A-Nukleotid anbringen (links und rechts)
- Adapter mit Barcode ligieren (PCR)
- Die Libraries mixen, auf Oberfläche (flowcell-lane) auftragen
- Sequenzieren
- Je nach dem Barcode einordnen und gene mapping (Bestimmung der Stelle)
Sie wollen genomweit untersuchen, welche Sequenzen von Ihrem Transkriptionfaktor Bollocks1 gebunden werden. Leider haben Sie momentan keinen Zugang zu einer Sequenziermaschine, sondern müssen präzipitierte DNA mit einem Microarray analysieren. Welchen Nachteil hat das?
Microarray
- Keine Information über genomische Sequenzen, die nicht am Array sind
- Kreuzhybridisierungen: Verminderte Spezifität
- Fehlhybridisierungen: geringer Signal-Rausch-Abstand
- Viel Startmaterial benötigt und hoher Chemikalienverbrauch
- Keine Kontrolle
Welche nicht-radioaktive DNA-Markierungen gibt es?
Nicht-radioaktive DNA-Markierungen
- Direkte: Fluorophore in Nukleotiden (Fluoroscein, Rhodamin)
- Indirekte: Biotin-Streptavidin System
Was ist eine Run-On-Technik? Welche Vor- und Nachteile gibt es bei der Methode?
Run-On
+ Transkriptionsrate-Messung
- veränderte Nukleotide
- veränderte Transkripton nach der Kernisolation
- Kernisolation
- Markierte Nukleotide reinbringen
- Pol verlängert weiter ohne Kern
- RNA-Extraktion (run-on Transkripte)
- Dot-blot (Hybridisierung mit Sonden auf der Vorlage)
Was bedeutet Stringenz? Welche Bedingungen können Sie bei der Hybridisierung von DNA berücksichtigen?
Stringenz
Grad der Exaktheit von bestimmten Bedingungen
hohe Stringenz: hohe Temperatur, niedrige Salzkonzentration, hohe Konzentration von denaturierenden Reagenzien → nur sehr gut passende Abschnitte hybridisieren
niedrige Stringenz: niedrige Temperatur, hohe Salzkonzentration, niedrige Konzentration von denaturierenden Reagenzien → schlecht passende Abschnitte hybridisieren auch (Mismatches)
Nachdem Sequenzen eines NGS-Experiments erhalten wurden – was tun Sie zuerst?
a. Bioinformatische Analyse der Daten
b. Validierung der Daten mit einer unterschiedlichen Methode
c. Publizieren der Resultate
d. Weitere Analysen einzelner Sequenzen
Nachdem Sequenzen eines NGS-Experiments erhalten wurden – was tun Sie zuerst?
a. Bioinformatische Analyse der Daten
→ Genkartierung: wo gehört die Sequenz hin
b. Validierung der Daten mit einer unterschiedlichen Methode
c. Publizieren der Resultate
d. Weitere Analysen einzelner Sequenzen
Wie funktioniert Solexa/Illunina-Sequencing? Welche Vorteile/Nachteile hat die Methode?
Solexa/Illumina
- Oberflächensequenzierung
- ssDNA-Abschnitte + Linker für die Fixierung auf der Glasoberfläche
- Nach der Fixierung dNTPs + Enzyme → Brückenamplifikation mit auf der Oberfläche fixierten Primern über Linker (dsDNA)
- dsDNA denaturiert, ssDNA bleibt kleben
- Clusters-Formation
- Primer, markierte Nukleotide und reversible Terminatoren → Einbau der einzigen Base → → Fluorescence-Signal von jedem Cluster je nach der Base.
- Die Nukleotide sind durch Schutzgruppe bedeckt und keine weitere Verlängerung findet statt
- Alignment, Referenzvergleich
+ 67 Gbp/Tag
+ Keine Klonierung und Klonendatenbanken
- 20-300 bp Leselänge
- repetitive Sequenzen werden nicht abgelesen (evtl. paired-end sequencing)
Wie kann DNA-Menge bestimmt werden mithilfe von RT-PCR?
DNA-Menge über RT-PCR
- Anzahl der Zyklen (Cq) steht mit [DNA] im Zusammenhang: [DNA]~2Cq
- Dazu eine Standard-Probe mit bekannter Konzentration
- Verschiebung der Kurven messen und bestimmen
Welche Methoden würden Sie für die Bestimmung der Translationsregulation nutzen?
Translationsregulation bestimmt über
- Polysomanalyse
- Ribosome profiling
Wie kann die Aktivität von RNA Polymerase II beeinflusst werden?
RNA Polymerase II hat CTD (c-terminale Domäne), wo an 2 Serine (2/5) phosphoryliert werden kann und dadurch wird die Aktivität beeinflusst.
Sind Adapter und Primer bei Illumina-Sequenzierung gleich?
Wie unterscheiden sich “454” und “Illumina”?
Illumina ist um vielfaches schneller, unterschiedliche Miniaturisierung
454
+ 400-500 bp Leselänge
+ Pyrosequenzierung: PPi über APS zum ATP, ATP mit Luciferase, Nukleotide einzeln
+ DNA an Kugeln befestigt
- 400-600 Mbp/7 Stunden
Illumina
+ 67 Gbp/Tag
+ keine Klonierung
+ Oberflächensequenzierung: DNA über Adapter an der Oberfläche befestigt, Basenamplifizierung, Sequencing by Synthesis (Fluorophor-Nucleotide)
- 20-300 bp Leselänge
Sie möchten Transkriptionsrate messen. Welche Methoden stehen Ihnen zur Auswahl?
Transkriptionsrate-Messung
- Run-on: Kernisolation + markierte Nukleotide → Pol verlängert ohne Kern, dann RNA extrahieren und analysieren
- Gro-sec (global run-on and sequencing): run-on mit vielen Kernen + Biotin-markierte Nukleotide → Transkription mit Gift stoppen → Isolieren über AK → Illumina
- Net-sec (native elongation transcript sequencing): Pol aufreinigen, hängende RNA-Transkripte analysieren mit NGS
Nennen Sie ein wichtiges Problem des Gibson-Klonierungs.
Gibson assembly
- Punktmutation durch Fehler vom DNA-Polymerase (Punktmutationen)
- ssDNA können mit sich selbst hybridisieren und falten → Loops entstehen
Der “cycle threshold” ist:
a. Die Gesamtzahl an Zyklen einer real-time PCR
b. Der Zyklus, an dem eine Probe (Sonde) einen bestimmten Punkt in der real-time PCR Reaktion erreicht
c. Die Zyklenzahl, an der die Probe die Plateauphase der PCR erreicht
d. Keine Antwort ist richtig
Der “cycle threshold” ist:
a. Die Gesamtzahl an Zyklen einer real-time PCR
b. Der Zyklus, an dem eine Sonde einen bestimmten Punkt in der real-time PCR Reaktion erreicht
c. Die Zyklenzahl, an der die Probe die Plateauphase der PCR erreicht
d. Keine Antwort ist richtig
A. Wenn A größer als B ist
B. Wenn B größer als A ist
C. Wenn die beiden gleich groß sind
A. Die Zahl der Farbstoffmoleküle in Probe A nach 18 Zyklen
B. Die Zahl der Farbstoffmoleküle in Probe B nach 18 Zyklen
A. Wenn A größer als B ist
B. Wenn B größer als A ist
C. Wenn die beiden gleich groß sind
A. Die Zahl der Farbstoffmoleküle in Probe A nach 18 Zyklen
B. Die Zahl der Farbstoffmoleküle in Probe B nach 18 Zyklen
Beide Anzahlen sind gleich hoch, sind aber in unterschiedlichen Zuständen: bei A wurden sie schon “verbraucht” und von der DNA abgelöst und bei B in Form von TaqMan-Sonden, sie nach dem Abbau Fluorophore freisetzen
Welche Hybridisierungstechniken kennen Sie?
Hybridisierungstechniken
- Blot
- RNAi
- PCR
- CRISPR
Ein uORF wird während Stickstoffmangel in Hefe deutlich reduziert translatiert. Welche Auswirkungen hat dies wahrscheinlich auf die Translation des stromab gelegenen HauptORFs?
uORF liegt vor dem HauptORF und wird vom Ribosom früher erkannt, weil sie von der Cappe anfangen zu translatieren.
- Wenn uORF Translation startet, wird kein Start-Kodon von Polymerase erkannt → keine Translation vom HauptORF
- Wenn uORF nicht abgelesen wird → mehr Translation vom HauptORF
Was wird bei ChIP-Seq untersucht?
ChIP-Seq
- Transkriptionsfaktoren, Histone und Modifikationen, RNAP, DNAP, DNA-Reparaturenzyme
- Methylierte DNA-Fragmente
RNAP – Transkriptionsaktivität-Messung
DNAP – Analyse der DNA-Replikation
Was ist eine Pyrosequenzierung? Wie wird dafür ein Sample vorbereitet?
Pyrosequenzierung
- Nebenprodukt der Verlängerung wird sichtbar gemacht: DNAn + dNTP → DNAn+1 + PPi
- PPi + APS (Adenosinphosphosulfat) → ATP
- Hinzugefügte Luciferase produziert Licht durch Reaktion mit ATP
- Nukleotide werden einzeln zugegeben, damit eine Lichtreaktion der bestimmten Base zugeordnet werden kann
454 Sequencing: 400-500 bp
Sample
- DNA durch Ultraschall zerhackt
- Linker wird angebracht
- 1 DNA-Fragment bindet an 1 Kügelchen, im Öl-Wassertropfen sind ein paar
- Kügelchen in Glasfasern zentrifugiert
- Glasfaser wird angespannt, pro Loch ist ein Kügelchen
- Dann werden mit Basen beschossen → Lichtblitze
Ein Forscher hat den ORF von GFP amplifiziert und neben einen Promoter von E.coli in einen Vektor kloniert. Er kann jedoch keine Fluoreszenz in mit diesem Konstrukt transformierten Bakterien entdecken. Welche verschiedenen Typen von Mutationen können in der PCR passiert sein?
Welche ist die warscheinlichste und warum?
Mögliche Mutationen in der PCR
- Fluorophor falsch eingebaut, weil Taq-Pol keine proof reading hat
- Frame shift (eine Base zu viel/zu wenig)
- Nonsense (Stopp-Codon anstatt Aminosäure)
Nummer 2 und 3 sind Punktmutationen, sie sind am wahrscheinlichsten, weil Taq-Pol keine proof reading hat.
Welche Sonden gibt es?
Sonden
- DNA (über PCR)
- Oligos (chemisch)
- RNA (Vektor-Transkription)
RNAi kann für funktionelle Genomik genutzt werden. Dies wurde besonders erfolgreich für C.elegans eingesetzt. Warum?
C.Elegans in funktioneller Genomik
- Vorteil
* RNA-abhängige RNA Polymerase (nutzt siRNA als Primer und verlängert ssRNA zu dsRNA → Verstärkung) - Vorteil
* shRNA können einfach über E.coli-Stämme durch Verfütterung eingeliefert werden
DNA wird aus menschlichem Blut extrahiert und 10 Gene vom Chromosom 22 werden amplifiziert. Die PCR-Produkte werden aufgereinigt und mit der Sänger-Methode sequenziert. An bestimmten Positionen in der Sequenz treten Ambiguitäten auf. Wieso?
single nucleotide polymorphism
SNPs: man hat Chromosom von Mutter/Vater, die kleine Unterschiede haben können
Sie wollen die Transkription in Mitochondrien von HeLa Zellen mittels Gro-Seq messen. Welches Problem müssen Sie lösen?
Mitochondrien in HeLa Zellen haben doppelte Plasmamembran → die veränderten Nukleotide reinzubringen ist sehr schwierig.
Welches dieser Projekte wäre am besten für NGS geeignet?
- Zu bestimmen, ob ein Tumor eine bestimmte Missence-Mutation auweist
- Das Transkriptom eines Tumors zu bestimmen
- Eine genomische DNA-Probe nach einigen bekannten SNPs zu untersuchen
- Alle Varianten
Welches dieser Projekte wäre am besten für NGS geeignet?
- Zu bestimmen, ob ein Tumor eine bestimmte Missence-Mutation auweist
das kann man auch funktionell bestimmen (missence = keine Funktion)
2. Das Transkriptom eines Tumors zu bestimmen
- Eine genomische DNA-Probe nach einigen bekannten SNPs zu untersuchen
- Alle Varianten
Was macht RNA-abhängige RNA Polymerase und wo ist sie zu finden?
RNA-abhängige RNA Polymerase
- Nur bei C.Elegans
Bei der RNAi wird dsRNA mithilfe Dicer in siRNA geschnitten, siRNAs hybridisieren sich mit DNA (als RISC, Ago+siRNA). Ago schneidet aber nicht, sondern rekrutiert RdRP, die siRNA als Primer nutzt und dsRNA vermehrt. Dann entstehen sekundäre siRNAs.
Warum spielen Mitochondrien eine Rolle für den Erfolg des Klonierens beim Kerntransfer, aber nicht beim Embryo Splitting?
Der Kern und Mitochondrien müssen miteinander kompatibel sein, da sie zusammenarbeiten müssen (z.B. Atmungskette, Biosynthesen). Beim Klonieren über Kerntransfer müssen sie kompatibel sein, bzw. Mitochondrien werden mitübertragen.
Bei welcher Klonierung werden Restriktionsenzyme nicht verwendet und warum?
Gateway-Klonierung
Durch ortspezifische Rekombination über att-Stellen und Clonasen wird der Ziel-Vektor verändert und das Ziel-Gen gegen unspezifische Sequenz umgetauscht und integriert. Das Zielgen wird nicht geschnitten, sondern nur flanktierte Phagen-Sequenzen (att).
A. Wenn A größer als B ist
B. Wenn B größer als A ist
C. Wenn die beiden gleich groß sind
A. Die Zahl der TaqMan-Sonden in Probe A nach 18 Zyklen
B. Die Zahl der TaqMan-Sonden in Probe B nach 18 Zyklen
A. Wenn A größer als B ist
B. Wenn B größer als A ist
C. Wenn die beiden gleich groß sind
A. Die Zahl der TaqMan-Sonden in Probe A nach 18 Zyklen
B. Die Zahl der TaqMan-Sonden in Probe B nach 18 Zyklen
Wenn verlängert, ist die TaqMan-Sonde in die Nukleotiden abgebaut → mehr Fluoreszenz!
Verbinden Sie die Vektorattribute und die Funktion. Nicht alle Antworten müssen genutzt werden.
__ Restriktionsstelle
__ Replikationsursprung
__ Promotor
__ Antibiotikaresistenz
a) wird für die Expression des Inserts gebraucht
b) erlaubt die Insertion von DNA in den Vektor
c) kodiert ein Enzym, dass DNA schneidet
d) erlaubt Selektion von Bakterien, die den Vektor aufgenommen haben
e) wird zur Duplikation des Vektors benötigt
f) wird für die Bindung von SRP benötigt
g) Ribosomenbindestelle
B. Restriktionsstelle (erlaubt die Insertion von DNA in den Vektor)
E. Replikationsursprung (wird zur Duplikation des Vektors benötigt)
A. Promotor (wird für die Expression des Inserts gebraucht)
D. Antibiotikaresistenz (erlaubt Selektion von Bakterien, die den Vektor aufgenommen haben)
Wie können Phagen der CRISPR-Abwehr ausweichen? Nennen Sie 2 Alternativen.
CRISPR-Abwehr
- Lysogene Integration ins CRISRP-Cas-Gen
- anti-CRISPR
- Protospacer-Mutation
Wie können off-Targets beim CRISPR-Cas9 identifiziert werden?
off-Targets Identifikation
- IDVL Capture (Integrase-defective lentiviral vector)
IDVL mit eigener DNA integrieren sich in die Lücke nach dem DSB, danach werden die DNAs mit LAM-PCR (linear amplification mediated) amplifiziert und mit NGS analysiert.
- GUIDE-Seq (genome-wide unbiased identification of DSBs enabled by sequencing)
- blunt-ended* dsODN (kleine markierte Oligonucleotide) werden transfiziert, die sich ins Genom integrieren. Danach markierungsspezifische PCR und NGS.
Wie erfolgt eine Translationregulation mittels Transktiptionsfaktors eIF4F?
Translationregulation
- mTOR/FRAP-Kinasen bekommen Reiz aus dem Umwelt (Wachstumsfaktoren, Mitogene, Cytokine…)
- mTOR phosphoryliert ein Bindeprotein eIF4E-BP, die eIF4E bedeckt (dann noch weitere Phosphorylierung) → eIF4E wird freigesetzt und aktiviert
- eIF4E binden an eIF4G, das ganze Komplex bindet an die Cap von mRNA
- Translation
Welche Markierung kann für RNA-Sonde verwendet werden?
RNA-Markierung
Ribosonden
- DNA-Insert in den MCS (multiple cloning site) gebracht
- Vektor wird mit RE linearisiert
- DNA-abhängige RNA-Polymerase transkribiert den Region
MCS hat direkt hintereinander RE-Schnittstellen
Wie kann qRT-PCR relativ quantifiziert werden?
Relative Quatifizierung (RT-PCR)
ΔΔCt-Methode
- Amplifikationseffizienz muss für Ziel und Referenz gleich sein
- Referenz hat fast unveränderliche Genexpression
- 4 PCRs nötig
Fold Change = 2-ΔΔCt
ΔΔCt = ΔCt Experiment - ΔCt Kontrolle
ΔCt Experiment = Ct Zielgen - Ct Referenz
ΔCt Kontrolle = Ct Zielgen - Ct Referenz
Welche Art von Enzymen brauchen Sie, um mittels Gateway-Technologie zu klonieren?
Clonasen (Integrase + IHF + Excisionase) mit Nuclease-Aktivität
Was ist die Kapillarblot? Wie funktioniert die?
Kapillarblot
Beim Kapillarblotting werden die Nucleinsäuren durch Kapillarkräfte auf die Membran transportiert. Dabei wird der Blot-Puffer durch das Auflegen einer dicken Schicht Filterpapier durch das Gel und die daraufliegende Membran gesaugt. Die mittransportierten Nucleinsäuren gelangen so auf die Membran und werden dort adsorbiert bzw. fest gebunden.
Gibt es RNAi-Antwort bei Säugern?
dsRNA-Antwort bei Säugern
dsRNA wird von der Proteinkinase R (auch interferon-induced, dsRNA-activated protein kinase) erkantt und zwei Antworten sind je nachdem möglich:
- Rekrutierung von eiF2α (eukaryotic translation initiation factor 2-α-kinase 2) → Block der Proteinbiosynthese
- Interferon-Produktion → Apoptose
Was ist “random priming”? Wie funktioniert die Methode?
random priming
Methode der DNA-Markierung (body labelling)
- kurze Oligos (6 bp), zufälliges Gemisch
- DNAP + markierte dNTPs
- Ganze DNA markiert
Was für eine Grafik ist das und was können Sie dazu sagen?
qRT-PCR
- Schmelzkurve: dRFU/dT (relative fluorescence units)
- 2 Peaks = 2 Produkte
Welche Arten von Plasmiden gibt es?
Plasmide
- relaxierte - multy-copy Plasmide, die mehrfach in der Zelle vorliegen und vielmal feuern je nach OriR
- stringente - low-copy Plasmide, Kopienzahl weniger als 20 pro Zelle
Wie funktioniert ein CRISPR-Cas9-System?
CRISPR-Cas9
- Fremde DNA vom Bakteriophagen injiziert
- Transkription von CRISPR- und Cas-Genen → pre-crRNA
- Prozessierung von pre-crRNA → crRNA
- trans-Aktivierung von crRNA mit tracrRNA → Komplexbildung mit Cas9
- PAM (protospacer adjacent motif) vom Komplex erkannt und DSB
- DSB über NHEJ (non-homologous end joining) oder HDR (homology directed repair) repariert
Was ist eine Microarray-Hybridisierung? Wie funktioniert sie?
Microarray
- Die sgDNA-Sonde auf der Platte fixiert, eine Platte = ein Gen
- cDNA aus den Zellem markiert mit unterschiedlichen Fluorophoren
- Wenn Hybridisierung, Änderung der Farbe
Was sind CUTs und welche Methode kann sie detektieren?
CUTs (cryptic unstable transcripts)
- Net-Seq, Gro-Seq
- unstabile Transkripte wie antisense-RNA
CRISPR repeats befinden sich in:
a. bakterieller DNA
b. viraler DNA
c. Pilz-DNA
d. viraler RNA
CRISPR repeats befinden sich in:
a. bakterieller DNA
Welche Bedingung muss erfüllt sein, damit Sie nach einem Ribo-Seq Experiment eine Kodon-aufgelöste Translationsaktivität bestimmen können?
Kodon-aufgelöste Translation erfordert
- Footprintslänge ~28 nt = erfolgreiche Verdauung
- so können Reads zum ORF zugeordnet werden → P/A-Stellen dann identifiziert
- Auch vom Extrakt abhängig ist die Aktivität von Exonucleasen
Wie funktioniert “random priming”, wenn anstatt DNA mRNA hinzugegeben wird?
Random priming mit mRNA
- Anstatt DNAP ist reverse Transkriptase
- Oligos (zufällige) hybridisieren sich an mRNA, RT verlängert
- Markierung ist nicht gleichmäßig: Verlängerung bin 5’-Ende, 3’-Ende wenig transkribiert!
- Einzelsträngige DNA
Welche Rolle spielen miRNAs bei der Translation?
miRNAs sind negative Regulatoren von der Translation
— Deadenylierung vom Poly-A-Schwanz
— Interaktion mit TFs (v.a. eIF4F)
Wieso gibt es die Erkennungssequenzen nach dem Golden-Gate Klonierung nicht?
Golden-Gate Klonierung
Dabei werden die Restriktionsenzyme Typ IIs verwendet, die in der Nähe von Erkennungssequenzen schneiden. Sie generieren nachfolgend nicht-palindromische Überhänge, die nach Ligation keine Schnittstelle aufweisen.
Was könnte das Problem in der ChIP-Normalisierung sein?
Normalisierung in ChIP
- Über Input-Analyse wird eine Normalisierung durchgeführt: Peaks entfernt und auf Hintergrund normalisiert.
- Jedoch je höher das Signal, desto mehr Noise gibt es → artificial noise over-estimation
Wie kann DNA-Sonde markiert werden?
DNA-Markierung
Endmarkierung
- 5’: Polynucleotidekinase ändert das Phosphat gegen 32P
- fill-in: 5´-Überhänge mit RE schaffen → Klenow-DNAP baut an Enden radiomarkierte Nukleotide ein
Body labelling
- nick translation: DNase macht ESB, die mit DNAP aufgefüllt werden (mit 32P dNTP), (3-5) Polymeraseaktivität + (5-3) Exonucleaseaktivität
- random priming: Gemisch mit zufälligen Primern + RNA + reverse Transkriptase
Sie wollen eine 22,345 bp Region des Mausgenoms mit PCR amplifizieren. Sie erstellen Primer mit 20, bzw. 22 Basen, die identische Schmelztemperaturen haben. Es gibt nach der Reaktion leider kein Amplifikat. Warum?
a. Primer haben nicht dieselbe Länge
b. Zielregion ist zu groß
c. Primer sind zu kurz
d. Hier wird versucht, Maus-DNA zu amplifizieren. Das geht aber nur mit menschlicher DNA
e. Sie haben mehr als einen Primer in Ihrer Reaktion benutzt
Sie wollen eine 22,345 bp Region des Mausgenoms mit PCR amplifizieren. Sie erstellen Primer mit 20, bzw. 22 Basen, die identische Schmelztemperaturen haben. Es gibt nach der Reaktion leider kein Amplifikat. Warum?
a. Primer haben nicht dieselbe Länge
b. Zielregion ist zu groß
c. Primer sind zu kurz
d. Hier wird versucht, Maus-DNA zu amplifizieren. Das geht aber nur mit menschlicher DNA
e. Sie haben mehr als einen Primer in Ihrer Reaktion benutzt
* PCR hat eine Limitierung 10 kbp
Welche der Methoden kann unterscheiden, ob ein Protein direkt oder über eine Proteinbrücke an DNA bindet?
a. EMSA und ChIP
b. EMSA
c. ChIP
d. 3C
Welche der Methoden kann unterscheiden, ob ein Protein direkt oder über eine Proteinbrücke an DNA bindet?
a. EMSA und ChIP
b. EMSA
ChIP hat AK gegen Protein, die an DNA bindet (nicht klar, ob eine direkte Interaktion oder nicht)
EMSA: Protein und DNA reinwerfen, gibt es Interaktion oder nicht?
c. ChIP
d. 3C
Sie sehen nach dem Selektion weiße Kolonien, aber kein längeres Insert nach Restriktionsverdau. Wieso?
Weiß-Blau-Selektion
LacZ-Gene mit dem blauen Farbstoff
- Insert erfolgreich → weiße Kolonien mit rekombinanter DNA, Lac-Operon zerstört und produziert keine Beta-Galactosidase
- Insert fehlerhaft → blaue Kolonien ohne DNA, LacZ intakt und produziert Beta-Galactosidase, die das Gal-X spaltet (X = blau)
Warum weiße Kolonien, aber kein längeres Insert:
Leserahmenverschiebung (z.B. nur eine Base wurde eingebaut), was das LacZ-Gen zerstört hat.
A. Wenn A größer als B ist
B. Wenn B größer als A ist
C. Wenn die beiden gleich groß sind
A. Die Zahl der Amplifikate in Probe A nach 30 Zyklen
B. Die Zahl der Amplifikate in Probe B nach 30 Zyklen
A. Wenn A größer als B ist
B. Wenn B größer als A ist
C. Wenn die beiden gleich groß sind
A. Die Zahl der Amplifikate in Probe A nach 30 Zyklen
B. Die Zahl der Amplifikate in Probe B nach 30 Zyklen
A. Wenn A größer als B ist
B. Wenn B größer als A ist
C. Wenn die beiden gleich groß sind
A. Die Zahl der TaqMan-Sonden in Probe A nach 10 Zyklen
B. Die Zahl der TaqMan-Sonden in Probe B nach 10 Zyklen
A. Wenn A größer als B ist
B. Wenn B größer als A ist
C. Wenn die beiden gleich groß sind
A. Die Zahl der TaqMan-Sonden in Probe A nach 10 Zyklen
B. Die Zahl der TaqMan-Sonden in Probe B nach 10 Zyklen
(weniger Polymerisation → weniger Sonden)
Warum werden für einen Run-on erst Kerne aus Zellen isoliert?
Run-On: Kernisolation
Um die markierten Nukleotide in den Kern hereinzubringen → Cytoplasmamembran weg, dann können die Nukleotide über die Pore reindiffundieren.
Was ist der Unterschied zwischen CRISPR-Cas9 und RNAi?
CRISPR-Cas9: knock-out (kompletter Verlust der Genfunktion)
RNAi: knock-down (RNA-Menge reduziert → hypomorphe Allele mit Teilfunktion)
Inwiefern stellt Pro-Seq eine technische Verbesserung gegenüber Gro-Seq dar?
Pro-seq (precision nuclear run-on and sequencing) ist nukleotidgenau und dadurch kann der Endpunkt der Transkription bestimmt werden.
- Gro-seq: global
- Pro-seq: präzis
- Letzte stark geänderte Base stoppt die Transkription → qRT-PCR → NGS
Was ist der wesentliche Unterschied zwischen Gro-seq und Net-seq?
Gro-seq (global run-on and sequencing) hat Kernisolation → viel Stress und Artefakte, Net-seq (native elongating transcript sequencing) hat Einfrieren und RNA-IP → viel besser.
Welche Entdeckungen waren vor der Gro-Seq nicht zu sehen?
Gro-Seq zeigte:
- antisense-RNA werden transkribiert! aber sofort abgebaut
- Polymerase produziert Transkripte nach der Poly-A-Cleavage! die auch sofort abgebaut werden
= PROMPTs (promotor upstream transcripts)
Welche Vorteile und Nachteile hat Pyrosequenzierung?
Pyrosequenzierung
+ keine Klonierung der DNA nötig, keine Klonierungsbanken
+ 400-600 Mbp/7 Stunden
- nur 500-600 bp Leselänge
Wie funktioniert eine Gibson assembly? Wofür wird sie verwendet?
Gibson assembly
- Bei 2 DNA überlappende Enden durch Primern in PCR erzeugen
- T5-Exonuclease verdaut 5´-Enden von DNA → sticky ends
- sticky ends von beiden DNA hybridisieren
- DNA-Polymerase füllt entstandene Lücken auf
- Ligase verbindet
Verwendet für: Vervielfältigung von DNA, Klonierung
Was bedeutet “Brückenamplifikation”?
Brückenamplifikation
Die Amplifikation eines ssDNAs, welcher mit Adaptern und Primern an eine feste Oberfläche befestigt wurde
(Illumina)
Was kann mit dem Material nach der Chromatinimmunopräzipitation gemacht werden?
Nach dem ChIP:
— Sequenzierung
— Hybridisierung auf Array (ChIP-Chip)
— PCR/qPCR
Warum ist die Translationsebene der Regulation so wichtig?
Translationsregulation
- Kürzere Reaktionszeit: produzierte Proteine werden schneller ausgeliefert als nach der Transkriptionsänderung
- Lokale Proteinproduktion: z.B. SRP und Rezeptoren auf dem ER → Translation ins Lumen
Was sind uORFs und wie wirken sie auf die Translation aus? Wie können sie identifiziert werden?
uORF (upstream reading frame)
- Regulieren die Translation
- Unterdrucken die reale Translation am stromab HauptORF
in Ribo-seq große Peaks alle 3 nt: mehrere Ribosomen vorhanden
Sie wissen, dass die neg RNA negativ über die Termination der Translation reguliert wird. Wie sähe die Read Coverage für diese mRNA in einem Ribo-Seq Experiment aus?
Das Gen wird normalerweise über Initiation reguliert. Hier wird ds Gen negativ über Termination reguliert (Ribosomen bleiben stecken),
→ Stau aus den Ribosomen am Ende
Welche dieser Reagentien sind typischerweise nicht Teil einer PCR-Reaktion?
a. NTPs
b. MgCl2
c. Ethidiumbromid
d. DNA-Primer
e. E.coli DNA-Polymerase
Welche dieser Reagentien sind typischerweise nicht Teil einer PCR-Reaktion?
a. NTPs
b. MgCl2
c. Ethidiumbromid
d. DNA-Primer
e. E.coli DNA-Polymerase
Wie funktioniert “nick translation”, eine Methode der DNA-Markierung?
Nick translation
- DNase I mit Mg2+ → an zufälliger Position in ds DNA entstehen Einzelstrangbrüche („nicks“)
- 3´OH-Enden der „nicks“ als Primer für DNA-Polymerase → 5´> 3´ Polymeraseaktivität, Einbau von α 32P dATP
- 5´>3´-Exonukleaseaktivität der DNA-Pol entfernt gleichzeitig Nukleotide → nick „wandert“ Richtung 3´Ende
Was ist eine Net-Seq? Welche Vor- und Nachteile hat die Methode?
Net-seq (native elongating transcript sequencing)
- Extrakt aus den Zellen schock-einfrieren, Lysieren
- Isolierung von RNAP über IP
- NGS
+ Tranksriptionsrate-Messung
+ viel weniger Stress wegen Einfrieren
+ keine Kernisolation, sondern RNA-IP
Wie kann man die Zugänglichkeit des Chromatins bestimmen?
DNase I-Analyse (hypersensitive site mapping)
- Gut verpackt — nicht möglich zu schneiden
- Schlecht verpackt — Schnittstellen
Was ist eine Gro-seq? Welche Vor- und Nachteile hat die Methode?
Gro-seq (global run-on and sequencing)
+ Transkriptionsrate-Messung
- Kernisolation und veränderte Nukleotide → Artefakte
- Viele Kerne isolieren + Biotin-modifizierte Nukleotide
- Gift zum Stoppen der Transkription → Promotoren werden von Pol nicht mehr erkannt
- Isolation über AK, Eluation, Hydrolyse von naszierenden RNAs
- NGS
Wie kann man nachweisen, dass dsRNA-Moleküle zu RNAi führen?
3 Ansätze: ssRNA, dsRNA und DNA als Kontrolle. Mit dsRNA muss etwas ansehbar sein (phänotypishe Änderung)
Wie funktioniert eine Ribo-seq (ribosomal profiling)? Was kann mit der Methode bestimmt werden?
Ribo-seq (ribosomal profiling)
- Ribosomen-Footprints (~28 nt): durch Antibiotika bleiben Ribos an der Stelle und schützen die Sequenz, alles andere mit Exonukleasen verdaut
- Footprints werden polyadenyliert, dann qRT-PCR → NGS
- Messung der Translationseffizienz
- Translation mit Kodon-Auflösung: Pausierungsstellen, uORFs, ORFs
Wie kann CRISPR-Cas9 angewendet werden?
CRISPR-Cas9
- Knock-out
- Gen einbringen (homologe Rekombination/Insertion)
- Riesendeletion von Genfragmenten
- dCas9 als TF für Promotorregulation
- dCas9 mit Effektordomäne für epigenetische Modifikation
- dCas9 mit GFP für Markierung
Welche Aktivität besitzt Cas9?
Cas9
Endonuclease mit 2 Domänen: RuvC (nicht-hybridisierter Strang) und HNH (hybridisierter Strang)
Was passiert in den Zellen, nachdem Cas9 geschnitten hat, aber kein DNA-Template für homologe Rekombination mitgeliefert wurde?
Non-homologous end joining
(NHEJ): direkte Ligation von freien Enden, zufällig und fehleranfällig
Nennen Sie eine Methode der RNA-RNA-Hybridisierung.
RNAi
Welche Fluoreszenzfarbstoffe können bei der qRT-PCR verwendet werden?
Fluoreszenzfarbstoffe bei qRT-PCR
Interkalatoren
- Ethidiumbromid: kann DNAP stören
- SYBR Green I: bindet an dsDNA
Sonden
- TAQ-man Sonde: Oligos mit Fluor/Quencher, wenn Quencher in der Nähe vom Fluor und an ssDNA gebunden → keine Fluoreszenz; wenn DNAP kommt und Sonde abschneidet, Quencher weg → Fluoreszenz
- FRET: fast wie TAQ-man ???
Was ist der Vorteil von der indirekten DNA-Markierung gegenüber direkter Markierung mit Fluorophoren?
Die Markierung mit Fluorophoren hat Einfluss auf die Transkription: modifizierte Nukleotide sind sehr groß, das stört die Polymerase → wenig Produkt
Bei der indirekten Markierung wird an das Nukleotid nur eine kleine Seitengruppe angehängt, was die Transkription nicht stört.
Sie möchten die Translation eines Gens messen. Welche Methode(n) würden Sie auswählen, um sie zu messen?
Ribo-seq (ribosomal profiling) + RNA seq
- Messung der aktiven Translation: es werden RNA mit Polysomen analysiert → Sequenzieren (Ribo-seq) + GesamtRNA sequenzieren (RNA seq)
- Translationseffizienz messen: RPKM (Ribo-seq)/RPKM (RNA-seq)
- RPKM = read per kilobase per million reads
- Proteinmenge korreliert besser mit Ribosomendichte als mit mRNA-Menge!
Was sind Topoisomerasen? Welche Typen gibt es?
Topoisomerasen: Enzyme, die DNA entspannen und entwinden
Typ IA: schneiden einen der beiden Einzelstränge und führen den anderen durch die Lücke
Typ II:
Cas9 muss in seiner Sequenz verändert werden, um es zur Editierung von eukaryotischen Genomen zu verwenden. Inwiefern?
Bakterielle Zellen haben DNA im Zytosol, eukaryotische — im Kern. Cas9 muss durch die Kernpore kommen. Dafür in Cas9 eine Sequenz einbauen (NLS, nuclear localisation signal, mit mehreren Lys,Arg)
Was ist nötig für eine Hybridisierung?
Hybridisierung
- Sonde mit Markierung
- Komplexes Mix mit dem Ziel
- Sonde-Ziel-Komplementarität
Um das Gen zur Komplementation einer Tryptophan-Biosynthesemutante (NY-trp-Zup) von E.coli zu finden, konstruieren Sie eine genomische Bibliothek von WT E.coli, indem Sie das Genom mit BamHI schneiden und die Fragmente in das Plasmid pGoSOX! klonieren.
pGoSOX! enthält Gene für Tetracyclin- und Kanamycin-Resistenz und hat eine BamH1-Schnittstelle, die innerhalb des Kanamycin-Resistenzgens liegt. Sie transformieren die Bibliothek in NY-trp-Zup Zellen und plattieren sie auf Vollmedium. Sie replizieren die Kolonien auf verschiedene Medien, wie unten gezeigt. Die Platten sind alle in derselben Orientierung gezeigt.
- Welche Kolonien enthalten den originalen pGoSOX! ?
- Welche Kolonien tragen pGoSOX! plus Insert?
- Welche Kolonien würden Sie wählen, um das Gen für Trp-Biosynthese zu analysieren, für das NY-Trp-Zup defizient ist?
- Was sind Kolonien 2 und 6?
1. Welche Kolonien enthalten den originalen pGoSOX!
3,4,5: beide Resistenzen vorhanden
2. Welche Kolonien tragen pGoSOX! plus Insert?
1,6
3. Welche Kolonien würden Sie wählen, um das Gen für Trp-Biosynthese zu analysieren, für das NY-Trp-Zup defizient ist?
1
4. Was sind Kolonien 2 und 6?
2: keine Übertragung vom Plasmid oder Spontanmutation (Rückmutation)
6: Insert falsch eingebaut und nicht vollständig für Trp-Synthese
Was würden Sie machen, wenn die repetitive Sequenzen vorliegen, die nicht bei Illumina abgelesen werden können?
Paired-end sequencing
Die Große des repetitiven Abschnitts kann über die Methode bestimmt werden.
Welches der folgenden Proteine wurde nicht für Genomeditierungen benutzt?
a. ZFN
b. TALENs
c. CRISPR-Cas9
d. MHC
Welches der folgenden Proteine wurde nicht für Genomeditierungen benutzt?
d. MHC
Auf welche Bereiche wird in einem ChIP-Seq Experiment bevorzugt normalisiert?
Normalisierung bei ChIP-Seq
Es wird auf dem Bereich normalisiert, wo keine Peaks sind (auf Hintergrund). Dabei werden die Peaks ausgeschnitten und auf den Rest normalisiert.
Welchen Vorteil haben andere Genomeditierungswerkzeuge gegenüber CRISPR-Cas9?
- Sie sind mehr spezifisch: kurze Erkennungssequenz, längere ES → weniger off-Targets (bei CRISPR nur 20 nt)
- keine PAM-Sequenz nötig
Was ist der Vorteil von der qRT-PCR gegen einfacher PCR?
qRT-PCR erlaubt eine Echtzeit-Verfolgung und kann die Konzentration von Proben bestimmen (WIEVIEL?). Bei der Endpunkt-PCR ist nur möglich zu bestimmen, WAS für ein Produkt vorliegt.
A. Wenn A größer als B ist
B. Wenn B größer als A ist
C. Wenn die beiden gleich groß sind
A. Die Zahl der freien Primer in Probe A nach 10 Zyklen
B. Die Zahl der freien Primer in Probe B nach 10 Zyklen
A. Wenn A größer als B ist
B. Wenn B größer als A ist
C. Wenn die beiden gleich groß sind
A. Die Zahl der freien Primer in Probe A nach 10 Zyklen
B. Die Zahl der freien Primer in Probe B nach 10 Zyklen
(da langsamer, weniger Amplifikate in B)
Wie funktioniert eine Zink-Finger-Nuklease?
Zink-Finger-Nuklease
- Zinkfinger-Domäne bindet DNA
- Nuklease-Domäne schneidet DNA
- Ein Dimer fürs Schneiden nötig
- 3-6 Zinkfingermotive (1 Motif für 3 Basenerkennung)
Es wurde herausgefunden, dass die letzte Base im Net-Seq Experiment überepräsentiert ist. Was kann das bedeuten?
RNAP bleibt länger an der letzten Base (Ende des Exons) → wegen cotranskriptionaler Ereignisse wie Splicing
Welche Filter-Hybridisierungstechniken kennen sie?
Filter-Hybridisierung
- Kolonieblot
- Slot/Dot-blot
- Northern/Southern blot
- Bakteriophagen-blot
Wie funktioniert eine indirekte DNA-Markierung?
indirekte DNA-Markierung
Biotin-Streptavidin-System
- DNA markieren mit kleinen Seitengruppen über reverse Transkriptase/Oligomarkierung
- Zwei Markers zum Gemisch geben: die zur Seitengruppe affin sind und die, zum Marker affin sind.
- Detektion über verschiedene Assays
Wie können off-Targets beim CRISPR-Cas9 minimiert werden?
CRISPR-Cas9 off-Targets
- Kurze Expressionszeit der sgRNA
- Veränderte sgRNA,sodass katalytische Aktivität bei weiteren Fehlpaarungen sinkt
- 2 Nukleasen gleichzeitig → 2 Sequenzen hintereinander, bessere Spezifität
Was ist das Besondere an CRISPR-Cas9?
Die Erkennung von DNA wird durch RNA-Hybridisierung gemacht. Früher waren nur Proteine verfügbar, die schwierig herzustellen sind.
Was würden Sie erwarten, wenn Sie in einer PCR die Temperatur in der Annealingsphase erhöhen und die Elongationsphase verlängern?
a. Präzision und Ertrag sind reduziert
b. Präzision und Ertrag sind erhöht
c. Präzision ist reduziert, Ertrag ist erhöht
d. Präzision ist erhöhr, Ertrag ist erniedrigt
Was würden Sie erwarten, wenn Sie in einer PCR die Temperatur in der Annealingsphase erhöhen und die Elongationsphase verlängern?
a. Präzision und Ertrag sind reduziert
b. Präzision und Ertrag sind erhöht
c. Präzision ist reduziert, Ertrag ist erhöht
d. Präzision ist erhöhr, Ertrag ist erniedrigt
Welche Sonden werden Sie verwenden, um antisense-RNA zu selektieren?
Wenn DNA-Sonde benutzt wird, werden beide RNA-Stränge (sense und antisense) hybridisiert und es findet keine Selektion statt.
Wenn Oligos/RNA-Sonde, wird nur ein Strang hybridisiert → sehr selektiv!
Bei welcher Wellenlänge ist die Absorption von dsDNA am höchsten?
260 nm
Welche Vorteile und Nachteile hat RNAi?
Vorteile
- spezifischer als Pharmaka
- einfach zu designen (Resistenzen ausweichbar)
- mehrere Gene gleichzeitig getroffen
Nachteile
- nur knock-down (KD)
- “Delivery” ist schwierig
- siRNAs nicht so stabil
- off-Targets
- Interferon-Antwort → Nebeneffekte
2 Plasmide wurden fusioniert und können nicht isoliert aus E.coli werden. Warum?
Bei der Plasmidfusion kommt es zu den folgenden Probleme:
- Isolierungsfaktor (wenn ein Plasmid ein Resistenzgen enthält und der zweite - das andere, ist keine Selektion möglich)
- Origin of replication (OriR): muss nur ein vorhanden sein. Wenn 2 OriR von beiden Plasmiden, stoßen Polymerasen aufeinander und die Replikation ist nicht vollendet (rolling circle) → Tod
CRISPR-Sequenzen im Zielgenom werden erkannt durch:
a. Zinkfingerdomänen
b. TALE Repeats
c. RNA
d. Leucin zipper
CRISPR-Sequenzen im Zielgenom werden erkannt durch:
c. RNA
Was sind PROMPTs? Wodurch können sie sichtbar gemacht werden?
PROMPTs (promotor upstream transcripts)
- über Gro-Seq
- antisense-RNA werden transkribiert! aber sofort abgebaut
- Polymerase produziert Transkripte nach der Poly-A-Cleavage! die auch sofort abgebaut werden
Zeichnen Sie eine DNA-Schmelzkurve. Was bedeutet DNA-Schmelztemperatur?
Schmelzpunkt, Tm, diejenige Temperatur – in °C – bei der eine doppelsträngige Nucleinsäure zu 50 % in die einzelsträngige Form denaturiert wird.
Welche der unten aufgeführten Resultat einer Endpunkt-RT-PCR zur Validierung eines shRNA-Ansatzes zeigt, dass das Experiment nicht geeignet für weitere Silencing-Experimente ist?
- Zellen transfiziert mit shRNA gegen Ziel-mRNA zeigen kein Amplikon. WT-Zelllinie zeigt ein Amplikon. Zellen transfiziert mit “Vector-shRNA” zeigen kein Amplikon. Zellen nur mit “Transfektionsreagenz” behandelt zeigen Amplikon.
- Zellen transfiziert mit shRNA gegen Ziel-mRNA zeigen kein Amplikon. WT-Zelllinie zeigt ein Amplikon. Zellen transfiziert mit “Vector-shRNA” zeigen Amplikon. Zellen nur mit “Transfektionsreagenz” behandelt zeigen Amplikon.
- Zellen transfiziert mit shRNA gegen Ziel-mRNA zeigen kein Amplikon. WT-Zelllinie zeiht kein Amplikon. Zellen transfiziert mit “Vector-shRNA” zeigen kein Amplikon. Zellen nur mit “Transfektionsreagenz” behandelt zeigen Amplikon.
Das Experiment basiert auf qRT-PCR: RNA + RT; shRNA gegen bestimmte RNA.
Negative Kontrolle muss ein Amplikon zeigen. Positiv → kein Amplikon (RNAi)
Negative Kontollen
- Kontrolle WT ohne shRNA
- Zufallssequenz (Vektor)
- Transfektionsreagenz (erhöht Zellporosität)
Varianten 1 und 3 sind nicht geeignet: 1 — Vector-shRNA kein Amplikon, 3 — WT und Vector-shRNA kein Amplikon
Mittels welchen Experiments können Sie die Polysomen anreichen?
Polysomenanreicherung erfolgt über Polysome-analyse:
- Zentrifugation → Dichtegradient: RNA mit vielen Polysomen haben größere Dichte
- Fraktionieren und Microarray von Fraktionen untersuchen / Gelelektrophorese
Was ist dCas9? Wie könnte es angewendet werden?
dCas9 (dead)
Cas9 ohne Endonuclease-Aktivität, kann crRNA binden, Zielsequenz erkennen.
Anwendungen
- Als Transkriptionsfaktor: Promotor ON/OFF
- Mit Effektordomäne für epigenetische Modifizierungen
- Mit GFP für Markierung
Wie würden Sie zeigen, dass es wirklich eine Mutation war und nicht ein Problem mit dem Bakterienstamm, den Sie zur Expression benutzt haben?
(Versuch: ORF von GFP amplifiziert und neben einem Promoter von E.coli in einen Vektor kloniert → keine Fluoreszenz in den Transformanten)
- Plasmidextraktion
- Sequenzieren
Was muss ein Vektor (Plasmid) haben, um erfolgreich von Bakterien benutzt zu werden?
Plasmid als Vektor muss haben:
- OriR - origin of replication, damit die Gene abgelesen werden
- Resistenzgen - Selektionsmarker
- lac-Operon (LacZ) - Marker für die Suche nach positiven Kolonien
- Polylinker - Region mit Restriktionsstellen
Warum ist die PCR eine endliche Reaktion?
Endprodukt-Hemmung
Bei der Sättigung werden Endprodukte nötige Enzyme gehemmt und die Reaktion hört auf.
Was würden Sie erwarten, wenn man in einer PCR Primer verwendet, die etwas kürzer sind und einige variable Stellen aufweisen?
a. Die PCR würde nicht beginnen
b. DiePCR würde nach dem ersten Zyklus enden
c. Reaktion würde ein einziges, kurzes PCR-Produkt ergeben
d. Reaktion würde eine Mixtur unterschiedlicher Produkte ergeben
Was würden Sie erwarten, wenn man in einer PCR Primer verwendet, die etwas kürzer sind und einige variable Stellen aufweisen?
a. Die PCR würde nicht beginnen
b. DiePCR würde nach dem ersten Zyklus enden
c. Reaktion würde ein einziges, kurzes PCR-Produkt ergeben
d. Reaktion würde eine Mixtur unterschiedlicher Produkte ergeben
Welche Kontrollmechanismen gibt es bei der Translation?
Regulation der Translation
- Proteinmodifikation
— Phosphorylierung von eIF4E-BP → eIF4G aktiviert → Translation
— Aktivierung von TOP mRNAs → Globale Kontrolle der Translation von ribosomalen Proteinen und TFs; mTOR-Kinase phosphoryliert ein Teil vom eIF4F → 5´-Terminal OligoPyrimidine Motif von eIF4F und anderen Proteinen (LARP1) besetzt → Translation
- Zirkularisation
- mittels PABP, die an eIF4G bindet (am Cap)
- Polysomen zirkularisiert, Re-start ist einfacher
-
miRNAs
* negative Kontrolle durch Deadenylierung (RNA-Abbau) und Interaktionen mit Transkriptionsfaktoren
Nach vier Zyklen einer PCR, wie viele Moleküle sind vorhanden, wenn man mit einem DNA-Duplex angefangen hat?
a. 16 einzelsträngige DNA-Moleküle
b. 16 doppelsträngige DNA-Moleküle
c. 18 einzelsträngige DNA-Moleküle
d. 18 doppelsträngige DNA-Moleküle
Nach vier Zyklen einer PCR, wie viele Moleküle sind vorhanden, wenn man mit einem DNA-Duplex angefangen hat?
a. 16 einzelsträngige DNA-Moleküle
b. 16 doppelsträngige DNA-Moleküle
c. 18 einzelsträngige DNA-Moleküle
d. 18 doppelsträngige DNA-Moleküle
- Es muss eine gerade Zahl sein
- Zwei Zyklen — 8 Duplikate, vier Zyklen — 16 Duplikate
Wie erfolgt eine negative Regulation der Translation?
Negative Regulation der Translation
miRNAs durch miRISC:
- Deadenylierung von Poly-A-Schwanz → RNA-Abbau
- Interaktion mit TFs, v.a. eIF4F
Welche Klonierung hinterlässt keine Spuren (Erkennungssequenzen nach dem Restriktionsschneiden) hinter sich?
Golden Gate Klonierung
Warum müssen Transkriptionsrate und Transkriptionsakkumulation nicht korrelieren? Nennen Sie 2 Beispiele.
Transkriptionsrate
- DNAP macht Transkript (viel oder wenig)
Transkriptionsakkumulation
- Teilweise wird abgebaut (RNA-Abbau)
- je nach dem Zellstadium ist die Menge immer unterschiedlich
- nicht alle RNAs werden aus dem Kern transportiert, und wenn nicht → sofort abgebaut
Sie sollen bei der Masterarbeit ein unbekanntes Gen mittels reverser Genetik in Drosophila untersuchen. Sie sollen eine Transposon-Mutagenese machen. Nennen Sie Argumente zum Vorteil der RNAi.
Transposon-Mutagenese ist viel unspezifischer als RNAi. Außerdem kann Transposon weiter springen und weitere Gene zerstören (knock-out). Wenn essentielle Gene betroffen sind, überlebt die Fliege nicht.
RNAi ist viel spezifischer und macht knock-down. Dadurch wird nur RNA-Menge verkleinert und die Fliege überlebt, wenn ein essentielles Gen betroffen ist (reduzierte Genfunktion, hypomorphe Mutation)
Welche enzymatische Aktivität hat Cas9?
Cas9
doppelsträngige Endonuklease
Wie ist Cq (cycle quantity) mit DNA-Menge verbunden?
Cq (cycle quantity)
Zeigt, wieviele Zyklen PCR hat
[DNA]~2Cq
Wie erfolgt eine globale Translationsregulation?
Globale Translationsregulation
5´-TOP mRNAs (mit 5´-terminal oligopyrimidine motif) werden entweder
- über die eIF4F an der Cap aktiviert (LARP-Proteine helfen auch), vorher Phosphorylierung von eIF4E-BP mit mTOR-Kinase
- oder über Mnk-Kinase als Antwort auf Stress (MAPK = mitogen activated protein kinase)
Wie unterscheidet sich CRISPR-Cas9 fundamental von anderen Genomeditierungswerkzeugen?
- RNA als Erkennungssequenz
- Viel einfacher nur sgRNA zu designen gegen bestimmte Sequenz
- Einfache Komplementarität
- Protein zu designen ist viel schwieriger, auch 3D-Struktur ist wichtig
Ein PCR Primer ist 18 Basen lang. Wie häufig wird er ans menschliche Genom binden?
a. (3.3 x 109) x 18
b. (3.3 x 109) / 18
c. (3.3 x 109) / 418
d. (3.3 x 109) / 218
e. 418
f. (3.3 x 109) / (1/4)18
Ein PCR Primer ist 18 Basen lang. Wie häufig wird er ans menschliche Genom binden?
a. (3.3 x 109) x 18
b. (3.3 x 109) / 18
c. (3.3 x 109) / 418
d. (3.3 x 109) / 218
e. 418
f. (3.3 x 109) / (1/4)18
- 418 — “wie oft?”, Anzahl der Sequenzen, die im Genom vorkommen
- (1/4)18 — Wahrscheinlichkeit, eine bestimmte Sequenz zu treffen
Welche der folgenden Methoden ist eine Equilibriumsmethode, die benutzt werden kann, um Dissoziationskonstanten einer DNA-Protein-Interaktion zu messen?
a. Site directed mutagenesis
b. ChIP
c. EMSA
d. Footprinting
Welche der folgenden Methoden ist eine Equilibriumsmethode, die benutzt werden kann, um Dissoziationskonstanten einer DNA-Protein-Interaktion zu messen?
a. Site directed mutagenesis
b. ChIP
c. EMSA
electrophoretic mobility shift assay: Protein+DNA inkubieren und im Gel anschauen (wenn Protein an DNA und Interaktion, wiegt DNA mehr als ohne!)
d. Footprinting
Was sind TALENs? Wie funktionieren sie?
TALEN - transcription activator-like effector nuclease
- TAL-effector Domäne bindet DNA
- Endonuklease-Domäne schneidet DNA
- TAL besteht aus 33-34 Aminosäuren
- Positionen 12/13 sind für Spezifität verantwortlich
