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Techniques De Biologie Moléculaire > Empreinte Génétique > Flashcards

Empreinte Génétique Flashcards

1
Q

Applications du profilage d’ADN (DNA profiling)

A
  1. Applications au domaine médico-légal (cas criminels, cas de paternité discuté, cas d’immigration)
  2. Applications à l’identification de cadavres:
    - corps difficilement identifiable
    - personne décédée depuis longtemps (squelette)
    - anthropologie et archéologie
  3. Applications hospitalières
    - le suivi de greffe de moelle osseuse
    - le diagnostic prénatal
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2
Q

Composition du génome humain

A

◇ 22 paires d’autosomes
◇ 1 paire d’hétérochromosomes
99,9% de l’ADN est identique chez tous les individus

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3
Q

Définition d’une epreinte génétique (=profil génétique)

A

Une méthode d’identification des individus basées sur le fait qu’aucun individu (excepté les vrais jumeaux) n’a la même séquence d’ADN

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4
Q

Les polymorphismes

A

Les différences dans les séquence nucléot
idiques du génome de différents individus (séquence naturelle)

Polymorphism, as related to genomics, refers to the presence of two or more variant forms of a specific DNA sequence that can occur among different individuals or populations. The most common type of polymorphism involves variation at a single nucleotide (also called a single-nucleotide polymorphism, or SNP). Other polymorphisms can be much larger, involving longer stretches of DNA.

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5
Q

SNP

A

Single nucleotide polymorphism = polymorphisme d’un seul nucléotide

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6
Q

STR

A

Short Tandem Repeat = Microsatellite

Courtes répétitions en tandem
Motif < 10 pb répété n fois

Exemple: AGATAGATAGATAGAT = (AGAT)n où n= nombre de répétitions du motif AGAT varie.

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7
Q

VNTR

A

Variable Number of Tandem Repeat = Nombre variable de répétitions en tandem

= minisatellites

Motif de 10 à 100 pb répété n fois où n = nombre de répétitions du motif (variable)

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8
Q

Les premières empreintes étaient basée sur

A

L’analyse des VNTR

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9
Q

La réalisation actuelle des empreintes est basée sur

A

L’analyses des STR

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10
Q

Caractéristiques des séquences polymorphiques (VNTR,STR)

A
  • ont une transmission mendélienne
  • stables au cours de la vie d’un individu
  • présentent un grand nombre d’alllèles
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11
Q

5 étapes de l’analyse génétique

A
  1. Prélèvement d’échantillons susceptibles de contenir de l’ADN
  2. Extraction d’ADN
  3. PCR
  4. Electrophorèse
  5. Interprétation et comparaison
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12
Q

En France et dans d’autre pays, on utilise courramment …. (réguïn

A

13 locus

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13
Q

ADN satellite

A

% GC différent de la moyenne = séquences d’ADN répété

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14
Q

Echantillons biologiques contenant de l’ADN

A

Sang 🩸
Os 🦴
Pellicules/squames (petites lamelles de peau morte qui se détachent spontanément de l’épiderme)
Cheveux (L’ADN se trouve dans la racine du cheveu et dans les cellules du cuir chevelu se trouvant à proximité de la racine lorsque le cheveu a été arraché.)

Ongles
Empreintes digitales
Salive
Sperme
Fragments de corps
Liquide vaginal
Sécrétions nasales ou auriculaires

Peu probable sauf s’ils contiennent de sang ou des cellules: fèces, sueur, urine

Tige du cheveu: l’ADN contenu dans la tige d’un cheveu est insuffisant pour une analyse de STR standard, mais une analyse de l’ADN mitochondrial est possible

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15
Q

Étapes d’extraction d’ADN

A
  1. Lyse des cellules. Les tampons de lyse peuvent contenir:
    - des détergents (SDS)
    - des agents chaotropiques (ex hydrochloride de guanidine)
    - de la proteinase K
  2. Purification de l’ADN : L’ADN est séparé des autres composants.
  3. Concentration / Elution de l’ADN: On obtient une solution d’ADN dans du TE (=Tampon Tris pH 7-8 pour éviter l’hydrolyse acide de l’ADN); EDTA (Chélateur d’ion bivalent dont Mg2+ cofacteur des Dnases)
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16
Q

Composants d’une réaction de PCR

A
  • ADN matrice (ADN génomique, plasmide…)
  • Deux amorces (17-30 nucléotides, encadrant la séquence à amplifier)
  • Tampon : TrisHCl pH 8,3 20mM - KCl 25mM, MgCl2 1,5mM
  • dNTP (AGTC)
  • Taq ADN Polymérase (ou autre ADN Polymérase thermostable)
17
Q

Paramètres du programme d’une PCR

A

Classiquement : 25-35 cycles
Durée et température d’un cycle :
- dénaturation 30-90 sec. à 94° C
- hybridation 30-60 sec. à 50-60°C
- élongation 30-120 sec. à 72° C

18
Q

Choix des amorces

A
  • longueur idéale: 17-30 nt
  • % GC 50% (on doit allonger les amorces si % plus bas pour éviter des températures de fusion trop basses)
  • Eviter les répétitions de plus de 3-4 nucléotides identiques
  • ne pas former de structures secondaires
  • ne pas s’apparier entre elles
19
Q

Calcul de la température d’hybridation

A

Tm de chaque amorce = 2(A+T) + 4(G+C)
On choisit le Tm de l’amorce la plus basse
Température d’hybridation Ta = Tm - 5

20
Q

PCR multiplexe

A

Permer d’analyser simultanément un ensemble de loci en une seule réaction de PCR

La PCR multiplexe est l’un des outils les plus utilisés en génotypage pour la détection des SNP, SSR, STR, microsatellites…, également employée pour identifier des pathogènes, des mutations, des maladies génétiques. C’est une approche plus économique que la PCR en simplexe, car elle nécessite moins de réactifs, d’échantillons et de temps.
Le principe de la PCR multiplexe est simple : on utilise un set de plusieurs couples d’amorces pour amplifier simultanément plusieurs cibles d’ADN en une seule réaction de PCR, plutôt qu’un seul couple d’amorces pour amplifier une cible d’ADN unique. En pratique, il n’est pas si simple de mener à bien une PCR multiplexe. La mise au point est souvent fastidieuse, car lorsque le nombre de cibles à amplifier dans une même réaction augmente, le niveau de complexité s’accroît. Des optimisations sont généralement nécessaires avant de bénéficier pleinement des avantages de la PCR multiplexe.

21
Q

2 empreintes diférentes

A

2 individus différents

22
Q

2 empreintes semblables

A

On doit donner la probabilité que 2 profils identiques existe par hasard = probabilité de coïncidence ou probabilité de concordance aléatoire (calcul dérivé du modèle de Hardy- Weinberg)

23
Q

Recherche de paternité

A

Probabilité de paternité = probabilité que la totalité des allèles obligatoires (= non hérité de la mère) présents chez l’enfant soit bien hérité du père par rapport à une autre hypothèse qui serait d’être hérité d’un homme pris au hasard dans la population.
(Calcul selon le théorème de Bayes prenant en comptes les génotypes du trio père putatif-mère-enfant et les fréquences géniques des systèmes considérés dans la population d’origine)

24
Q

Modèle de Hardy-Weinberg

A

Soit 2 allèles a et A de probabilité p et q

p(aa) = p^2
p(AA) = q^2
p(aA) = 2 x p x q

Pour 2 loci: p1 x p2
Pour 13 loci: p1 x p2 x p3 x…x p13

Probabilité de 10^-20 à 10^-30 selon les fréquences des allèles rencontré dans le profil

25
Q

Analyse des STR sur les chromosomes X et Y

A

Ces STR présentent moins de variabilité inter-individuelle et interalléique et ne sont utilisé qu’en appoint de l’analyse des autosomes.
Cela permet:
- d’augmenter le nombre de résultats sur des prélèvements d’ADN dégradé
- d’établir une lignée paternelle dans l’identification de personne (découverte de cadavre, paternité)

🧒 un garçon recoit son chromosome Y de son père biologique (et un des deux chromosome X de sa mère)
👧 une fille reçoit le chromosome X de son père et un des deux chromosome X de sa mère

26
Q

Analyse des SNPs

A
  • estimation de l’origine ethnique
  • détermination d’apparence morphologique (couleur peau, cheveux, yeux
  • peut permettre l’analyse d’échantillons mélangés, d’échantillons d’ADN dégradés pour lesquels des analyses STR n’ont pas été possible
27
Q

Intérêts et Inconvénients de l’analyse de l’ADN mitochondrial (ADN-MT)

A

👍 quand 🧬 nucléaire est dégradé
👍 dans certains échantillons contenant peu de 🧬 nucléaire (ex: cheveu sans bulbe)
👍👎 héritage exclusif de 🧬-MT par la mère
👎 hétéroplasmie
👎 analyse sensible aux contaminations
👎 pouvoir discriminant faible

28
Q

Etude de l’ADN mitochondrial

A

Structure simplifiée de l’ADN mitochondrial présentant la région de contrôle avec les deux fragments variables HV2 et HV1, et le gène du cytochrome b.

29
Q

L’analyse des SNP va-t-elle remplacer des STR?

A

➡️ problèmes de confidentialité
➡️ il faut analyser 50 SNP pour avoir le même pouvoir discriminant que 13 STR
➡️ calcul de la probabilité de coïncidence: il faudrait analyser la fréquence de chaque SNP utilisé dans une population donné (refaire ce qui a été fait pour la fréquence des STR)
➡️ bases de données actuelles établies sur les STR - typage à refaire

30
Q

La pigmentation humaine

A

est un caractère polygénique qui peut être régulé par des interactions entre gènes.

L’interaction du gèbe HERC2 sur le gène OCA2, situés tous deux sur le chromosome 15, influence la couleur des yeux. L’allèle C au niveau du SNP rs12913832 du gène HERC2 est responsable pour 99% de la couleur bleu.

31
Q

Méthode d’analyse des SNPs

A

Par séquençage haut débit
NGS= Next Generation Sequencing

32
Q

Étapes d’analyse du génome mitochonrial

A
  1. Définition du mitotype
    - Extraction de l’ADN
    - Amplification par PCR de la région de contrôle (600pb)
    - Séquençage de la région de contrôle par séquençage automatique
    - Comparaison de la séquence obtenue avec une séquence de référence, la séquence d’Anderson: les points de différences observés permettent de définir le mitotype.
  2. Comparaison des mitotypes
  3. Détermination du risque d’erreur en cas de conclusion d’identité
33
Q

Le séquençage

A

La réactionde sänger: synthèse d’un brin complémentaire à l’ADN matrice à partir d’unecamorce par une ADN polymérase en présence de dNTP et de ddNTP (dideoxydNTP).

Amorce de séquençage s’hybride à une séquence connue de l’ADN à séquencer

ADN à séquencer: sous la forme simple brin

Lorsqu’un ddNTP est incorporé, la réaction s’arrête (pas de 3’-OH pour faire de liaison avec le 5’ P)

Avec la technique de séquençage par traceurs fluorescent, on ajoute aux dNTP des ddATP, ddTTP, ddCTP, ddGTP, chaque dNTP étant couplé à un fluorochrome différent

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